)結(jié)構(gòu)示意圖如圖3,選取pTRV2 (PYL156)上的及mHI和兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)載體進(jìn)行雙酶切，限制性內(nèi)切酶選用NEB(New EnglandBiolabs)公司的ifeazMHF和內(nèi)切酶。反應(yīng)體系為：pTRV2質(zhì)粒1μg，內(nèi)切 酶各 1yl，l〇XCutsmartBuffer5μL，用水補(bǔ)足至 50μL。于 37°C酶切 15 分鐘，65°C 酶失活20分鐘。酶切產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提后，經(jīng)2倍的無(wú)水乙醇和1/10體積的NaAc沉淀， 用75%的乙醇認(rèn)真的洗兩次后，將乙醇吹干。把酶切后的線性化質(zhì)粒溶于20μ1的雙蒸水 中備用。
[0025] 三、重組質(zhì)粒的提取、連接、轉(zhuǎn)化以及鑒定 利用GibsonAssembly?MasterMix(NewEnglandBiolabs)對(duì)步驟一純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟二得到的線性化載體進(jìn)行連接，具體反應(yīng)體系為：1μ1純化回收的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，1μL線性化載體，4μL2XGibsonAssemblyMasterMix，用水補(bǔ)足8μ1〇 50°C反應(yīng)半小時(shí)后取2μL轉(zhuǎn)入50μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)，測(cè)序鑒定結(jié)果正確的即為 pTRV2-LcCIF重組質(zhì)粒，擴(kuò)搖提取質(zhì)粒。
[0026] 四、利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 取出100μ1GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，立即加入5μ1重組質(zhì)粒DNA。 輕彈，冰上放置30min，液氮中冷凍5min，37°C水浴中溫浴5min，冰上2min，加入無(wú)抗生 素的 500μL的YEP(AgrobacteriumGrowthMedium)液體培養(yǎng)基，28°C搖 3 ~4h。3000 r，離心3min，去培養(yǎng)基500μL，剩下的100μL全部均勻涂布于YEP固體培養(yǎng)基上（100 yllOOmgI1Kan, 50μL50mgllif)。28°C靜止 2 ~3d。搖菌于含抗生素的（100 μL100mgl1Kan, 50μL50mgpRifOYEP培養(yǎng)基中，28°C，250rpm振蕩過(guò)夜，菌液 PCR驗(yàn)證。
[0027] 五、質(zhì)粒的大規(guī)模提取 挑取陽(yáng)性克隆于500μ1含有100μgml1Amp的LB(Lysogenybroth，LB)液體培 養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接100μ1菌液至10mlLB液體培養(yǎng)基37°C過(guò)夜培養(yǎng)，15，000g 離心1min收集菌體，按照每毫升菌體加： SolutionI100μ1 (冰浴 5min劇烈振蕩） SolutionII200μ1 (冰浴 5min輕輕混勾） SolutionIII150μ1 (冰浴 5min輕輕混勾） Solution(I~III)參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(莎姆布魯克，美，2005)。
[0028] 15，000g離心5min，上清加入RNAse(10mgml3 37°C1h后加入等體積酸： 氯仿（1:1)，劇烈振蕩后15，000g5min離心，取上清，加入等體積氯仿異戊醇，15，000 g，5min上清加1/10體積2. 5MNaAc和2體積無(wú)水乙醇，-20°C沉淀10min后，用75%乙 醇洗滌，晾干后加入適量適量雙蒸水溶解。
[0029] 六、農(nóng)桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)以及侵染 每 100mlYEP培養(yǎng)基中加入 100μ1 100mgllan，50μ1 50mgI1Rif。挑取 單菌落至2ml離心管含有500μ1YEP培養(yǎng)基，后轉(zhuǎn)入50ml離心管搖菌15ml，28°C，200 r.m，搖菌過(guò)夜。包括pTRVl和pTRV2-LcCIF兩種菌。
[0030] 將第一天搖好的菌液，按1 :50或1 :25稀釋到新鮮的YEP培養(yǎng)基中，每100mlYEP 培養(yǎng)基加入1ml1MMES(終濃度10mM)，10μ1乙酰丁香酮母液(終濃度20mM)，100μ1 100mg1 1Kan，50μ1 50mg1 1Rif。500ml三角瓶搖菌 100 ~200ml，28°C，200rpm 搖菌過(guò)夜。
[0031] 3000g離心15min，倒掉培養(yǎng)基，用槍吹吸菌體使之均勻懸浮在侵染液中，吸 打混勻直至無(wú)塊狀。用分光光度計(jì)測(cè)重懸菌液濃度，使〇D6。。在1. 0~3. 0,將pTRVl和 pTRV2-LcCIF菌液按體積1 :1混合，暗處?kù)o置4~6小時(shí)。
[0032] 選取三株雌花盛開期的"糯米糍"作為實(shí)驗(yàn)材料，于3月19日（雌花盛花期）利用 制備得到的〇D_=l. 0浸染液進(jìn)行噴花處理(處理組)，對(duì)照組為：噴施0D_=1. 0的含空載的 侵染液，處理后50天(第一和第二次生理落果后）對(duì)平均穗坐果率和種胚發(fā)育情況進(jìn)行調(diào) 查。
[0033] 結(jié)果表明：與對(duì)照相比，處理組"糯米糍"荔枝的單果穗的掛果數(shù)明顯增加，對(duì)照平 均單穗坐果為1. 68±0. 48個(gè)，而處理組則為2. 57±0. 45個(gè)，平均坐果數(shù)比對(duì)照提高53%。 花后50天，對(duì)照果實(shí)和種子平均重分別為1. 67±0. 07g和0. 293±0. 017g，處理組分別為 1. 66±0. 07g和0. 291±0. 016g，兩者無(wú)明顯差異，然而，從種子的形態(tài)看，處理組種子的內(nèi) 腔明顯大于對(duì)照種子(見圖4)，荔枝果實(shí)發(fā)育種子種皮的大小決定于液態(tài)胚乳量，液態(tài)胚乳 量越多，種皮越大，這結(jié)果說(shuō)明處理組果實(shí)液態(tài)胚乳的發(fā)育明顯多于對(duì)照果實(shí)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/F，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。2. 權(quán)利要求1所示細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7編碼的蛋白，其特征在于，其 氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3. 用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述荔枝細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7柏引物，其特征 在于，其引物序列如SEQIDNO:3~4所示。4. 含有權(quán)利要求1所述細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因ZcC/7柏表達(dá)載體。5. 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求4所述表達(dá)載體在提高荔枝坐果率方面的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求4所述表達(dá)載體在制備提高荔枝坐果率的制劑方面 的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述荔枝為糯米糍。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因<i>LcCIF</i>及其應(yīng)用，所述<i>LcCIF</i>核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，該抑制子可與細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶相結(jié)合使其失去活性，通過(guò)短期沉默細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子提高細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性，促進(jìn)液態(tài)胚乳早期發(fā)育，可用于提高糯米糍荔枝的坐果率，在生產(chǎn)上有這廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/84, C07K14/415, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105274119
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510652952
【發(fā)明人】王惠聰, 趙杰堂, 張潔瓊, 吳子辰, 劉戀, 黃旭明
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年10月10日