降解氯氰菊酯的鞘氨醇單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)藥污染的生物技術(shù)處理領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥殘留具 有高效降解作用的鞘氨醇單胞菌WHSC-81及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥是模擬天然的除蟲(chóng)菊酯而合成的一類殺蟲(chóng)劑，具有廣譜高效、 低毒等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和衛(wèi)生害蟲(chóng)防治中得到廣泛應(yīng)用。然而，擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑在茶 葉、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物上的過(guò)高殘留，帶來(lái)了食品安全問(wèn)題。歐盟、日本作為中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口 的兩個(gè)主要市場(chǎng)，不斷對(duì)農(nóng)藥殘留限量作出更嚴(yán)格的規(guī)定，使得中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口面臨巨大 壓力。同時(shí)，擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑對(duì)多種水生生物具有高毒性。氯氰菊酯是擬除蟲(chóng)菊酯類 農(nóng)藥的一種，廣泛用于防治果樹(shù)、蔬菜、禾谷類、煙草等作物的鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲(chóng)。 研宄表明，氯氰菊酯在水中的半衰期長(zhǎng)達(dá)31d，對(duì)多種水生生物毒性較大，對(duì)大鼠生殖系統(tǒng) 也有危害。
[0003] 鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)可降解的農(nóng)藥類型較多，包括有機(jī)磷、有機(jī) 氯等殺蟲(chóng)劑，2, 4-D、甲磺隆等除草劑。假單胞菌屬（Pseudomonassp.)同樣能夠降解多種 農(nóng)藥，如甲基對(duì)硫磷、甲安磷、樂(lè)果等。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的氯氰菊酯降解菌株主要屬于產(chǎn)堿菌 屬（Alcaligenessp.)、紅球菌屬（Rhodococcussp.)和芽抱桿菌屬（Bacilliussp.)。國(guó) 外曾報(bào)道過(guò)氯氰菊醋的降解菌株P(guān)seudomonasspp?和Serratiaspp.，20天的降解率只 有50%，國(guó)內(nèi)也曾報(bào)道過(guò)鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp菌株XJ對(duì)氯氰菊醋的降解率為 81. 8%，而我們分離的菌株WHSC-81降解率達(dá)到91. 3%以上，菌株WHSC-8 T經(jīng)生物學(xué)特性及 基因比對(duì)為新菌株。WHSC-81在應(yīng)用于土壤農(nóng)藥污染的原位修復(fù)時(shí)，易于定殖，并發(fā)揮其對(duì) 氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯的降解功能，這是很多其他菌株無(wú)法比擬的。
[0004] 鞘氨醇單胞菌降解芳香化合物的能力與其大質(zhì)粒有關(guān)，質(zhì)粒上的開(kāi)放閱讀框編 碼大量運(yùn)輸和降解芳香化合物的酶類。也有實(shí)驗(yàn)表明，與降解有關(guān)的基因不僅位于細(xì)菌 質(zhì)粒上，還位于細(xì)菌的染色體上，不同地層的鞘氨醇單胞菌其降解芳香化合物的基因位 于不同的地方，地表菌株基因定位于染色體上，而地下菌株在質(zhì)粒上。鞘氨醇單胞菌對(duì)芳 香化合物的降解機(jī)制是依次在芳環(huán)上加氧，形成醛、酮或醇類中間體，而后開(kāi)環(huán)分裂，如 Sphingomonassp.RW1降解氧荷（二苯環(huán)化合物），首先是對(duì)鄰近醚鍵的目標(biāo)位進(jìn)行加氧， 形成二氫二醇（不穩(wěn)定的半縮醛中間體），再生成2, 2, 3-三羥聯(lián)苯，被間位裂解，再生成 水楊酸（單苯化合物），由兒茶酚間位分裂途徑或龍膽酸鹽途徑進(jìn)一步降解。另一種降解 機(jī)制是其它能源存在下，通過(guò)共代謝作用進(jìn)行降解。
[0005] 鞘氨醇單胞菌是清理土壤中有毒物質(zhì)最有效的微生物類群之一，由于其大質(zhì)粒 上攜帶了許多能降解苯系及雜環(huán)物質(zhì)的酶系基因，在受有毒物質(zhì)污染的土壤中，鞘氨醇單 胞菌隨毒物的空間分布而分布。如農(nóng)田氯氰菊酯殘留于土壤中，并隨地表和地下水向土壤 深層迀移。
[0006] 本發(fā)明以生物修復(fù)（Bioremediation)為理論基礎(chǔ)的農(nóng)藥殘留降解菌技術(shù)為降低 農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中的農(nóng)藥殘留物提供了希望，該技術(shù)具有高效、無(wú)毒、無(wú)二次污染的 特點(diǎn)，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，操作簡(jiǎn)便，目前已成為去除農(nóng)藥殘留污染的一種重要方法。分離鑒定 能降解氯氰菊酯農(nóng)藥的細(xì)菌，對(duì)其降解特性和應(yīng)用潛力進(jìn)行了研宄。該研宄為降解菊酯類 農(nóng)藥殘留及其降解機(jī)理、克隆降解酶基因打下了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥殘留具有高效降解作用的鞘氨醇單胞 菌WHSC-81及其應(yīng)用途徑，該菌株于2014年11月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編：430072,保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2014575分類命名： SphingomonashengshuiensisWHSC_8T〇
[0008] 鞘氨醇單胞菌WHSC-81的生長(zhǎng)條件：溫度范圍20 - 35°C，最佳生長(zhǎng)溫度28°C， 耐鹽范圍0-1% (w/v)，耐酸堿度范圍pH5-10,最佳為pH7。菌落特征：28°C在NA平板 上培養(yǎng)2天，形成淡黃色圓形菌落，直徑1mm;DNA(G+C) %含量為68. 72%，主要脂肪酸為 C18:l?7c(64. 6% )和C16:0(12. 5% )。掃描電鏡結(jié)果顯示菌體為短棒狀，有鞭毛。
[0009] 鞘氨醇單胞菌WHSC-81為革蘭氏陰性菌，生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0010] 表1WHSC-8T生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0011]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鞘氨醇單胞菌，能夠降解氯氰菊酯，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2014575。
2. 權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌在降解農(nóng)藥殘留領(lǐng)域的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌的凍干菌粉的制備方法，包括如下步驟： 1) 離心管準(zhǔn)備：選取50mL及1. 5mL離心管若干，經(jīng)自來(lái)水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2? 3次，烘干；121°C下高壓滅菌20min，備用； 2) 菌種準(zhǔn)備及收集：菌種經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C，150rpm，培養(yǎng) 2d，用50mL離心管離心收集菌體，并用滅菌蒸餾水洗滌菌體后再次收集； 3) 預(yù)凍：_80°C冰箱預(yù)凍l_2h ; 4) 冷凍干燥：將預(yù)凍后的樣品離心管去掉蓋子，頂部捆上無(wú)菌封口膜，封口膜上打幾 個(gè)小孔，以利于凍干過(guò)程中水分排出，將處理好的樣品置于已預(yù)冷30min的FD-1-50真空冷 凍干燥機(jī)的干燥盤(pán)內(nèi)，再將有機(jī)玻璃罩蓋上，開(kāi)始冷凍干燥，直至離心管內(nèi)凍干物呈酥塊狀 或松散片狀，時(shí)間為8-20h ; 5) 收集分裝：將50mL離心管內(nèi)冷凍干燥好的菌體無(wú)菌條件下分裝至1. 5mL離心管內(nèi)， 無(wú)菌封口膜封口并標(biāo)記好菌種名、時(shí)間等信息，分裝好的凍干菌體_20°C保藏。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種對(duì)氯氰菊酯農(nóng)藥殘留具有高效降解作用的鞘氨醇單胞菌WHSC-8T及其應(yīng)用，該菌株于2014年11月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2014575。本發(fā)明的鞘氨醇單胞菌對(duì)氯氰菊酯、辛硫磷、毒死蜱、異丙威、克百威等農(nóng)藥殘留均有顯著降解效果，其中對(duì)氯氰菊酯的降解率達(dá)到91.3％以上。本發(fā)明提供的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地區(qū)大面積推廣使用。CCTCC NO：M 201457520141118
【IPC分類】A62D101-28, C12N1-04, C12R1-01, A62D3-02, C12N1-20, A62D101-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104531589
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510016653
【發(fā)明人】魏淑珍, 郭繼平, 吳榮榮, 梁魁景, 張志強(qiáng), 王茜, 王婷婷, 張彩鳳, 李志濤, 李輝, 朱冰清
【申請(qǐng)人】衡水學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年2月5日