芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵和生物降解【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是提供了一種利用芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法。本發(fā)明采用芽孢桿菌YP1(CGMCC6318，Bacillus?sp.YP1)與含銅離子的發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵，通過低溫離心、硫酸銨沉淀和冷凍干燥相結(jié)合的方法分離濃縮得漆酶，然后用所得酶處理聚乙烯薄膜。通過水接觸角(WCA)、ATR-FTIR和SEM的表征看出，聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理后接觸角從98.1°降低到69.0°，變得相對(duì)親水；表面出現(xiàn)了極性基團(tuán)羰基C＝O；表面出現(xiàn)裂縫、凹槽等侵蝕現(xiàn)象，變得相對(duì)粗糙。證明芽孢桿菌YP1胞外漆酶具有氧化和降解聚乙烯的能力，為探索聚乙烯生物降解的酶處理方法提供了一定的研究基礎(chǔ)。
【專利說明】芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法
[0001]本發(fā)明涉及一種利用芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，屬于微生物發(fā)酵和固體廢物生物降解的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]塑料廢棄物是目前非常嚴(yán)重的固體廢物污染問題，它正以每年4000萬t的速度在環(huán)境中積累，造成嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染。聚乙烯_[CH2-CH2]n-是日常生活中最常用的高分子材料之一，大量用于制造塑料袋、塑料薄膜及牛奶桶的產(chǎn)品等，被廣泛應(yīng)用于國民經(jīng)濟(jì)和人類生活的各個(gè)方面。由于其長(zhǎng)鏈、疏水大分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，一般認(rèn)為聚乙烯在自然環(huán)境中的生物降解過程是極其緩慢的。長(zhǎng)期以來，各國研究者都在努力探索有效的聚乙烯生物降解方法和途徑。
[0003]高分子的生物降解是指微生物或酶切斷聚合物分子鏈，在分子鏈水平上利用生化過程降解大分子的方法。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些真菌和細(xì)菌等微生物具有降解聚乙烯的作用:這些微生物能夠利用聚乙烯作為唯一碳源生長(zhǎng)，使聚乙烯表面產(chǎn)生明顯的侵蝕。此外，少數(shù)報(bào)道表明鏈霉菌胞外酶、真菌木質(zhì)素錳過氧化物酶和紅球菌漆酶對(duì)預(yù)處理聚乙烯(UV或改性劑處理)有氧化降解的潛力，大豆過氧化物酶和細(xì)菌單加氧酶對(duì)未處理聚乙烯具有氧化降解的潛力。
[0004]漆酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物(真菌和細(xì)菌)中。漆酶具有較強(qiáng)的催化氧化能力，能催化氧化降 解多種難降解的有機(jī)物，包括農(nóng)藥、多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、酚類、苯胺類及蒽醌類等，尤其對(duì)天然高分子木質(zhì)素的降解研究的比較多。當(dāng)漆酶催化底物氧化時(shí)，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中通過單電子提取方式去除一個(gè)氫原子，形成相應(yīng)的底物自由基，這些自由基不穩(wěn)定會(huì)進(jìn)一步發(fā)生水合作用、歧化作用等非酶促反應(yīng)，從而氧化芳基-烷基及其側(cè)鏈烷基的C-C鍵等。聚乙烯由長(zhǎng)鏈C-C鍵鏈接而成，漆酶的這些催化特性使得其也可能具有氧化降解聚乙烯的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明可通過以下方式得以實(shí)現(xiàn):
[0006]在選定的培養(yǎng)基中接種芽孢桿菌YPl (CGMCC6318，)種子液，在適宜的產(chǎn)酶條件下發(fā)酵，通過一定的方法分離濃縮得到漆酶，再將酶用于降解聚乙烯薄膜，在適宜條件下作用一定時(shí)間后取出樣品，洗凈后表征酶降解效果。
[0007]發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖20，KH2PO40.7，K2HPO40.7，MgSO4.7H200.7，NaN032.0，NaC10.005,FeSO4.7Η200.002,ZnSO4.7Η200.002,MnSO4.Η200.0OLCuSO4.5Η200 ~0.005，pH 自然。
[0008]產(chǎn)酶工藝:在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)24h的芽孢桿菌YPl (接種濃度2 X IO5CFU/mL)，37°C、125r/min震蕩培養(yǎng)2~10d。發(fā)酵液離心后收集上清液，以85%飽和度硫酸銨沉淀，4000rpm冷凍離心40min后得到蛋白質(zhì)沉淀，以高純水重懸浮配，Mw3500Da透析除鹽和離心除變性蛋白后以丁香醛連氮測(cè)定漆酶活力。當(dāng)培養(yǎng)基中不含Cu2+時(shí)，上清液中基本無漆酶活性；當(dāng)培養(yǎng)基中Cu2+濃度為10 μ M，培養(yǎng)6d時(shí)菌株YPl產(chǎn)漆酶活性最大。漆酶的最適反應(yīng)溫度和PH分別為60°C和5.0?？蓪⒗鋬龈稍锖蟮玫降拿阜墼赺20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009]將上述得到的酶粉加高純水溶解，測(cè)定濃度。將聚乙烯薄膜裁成1.5cmX 1.0cm和
1.5cmX0.5cm尺寸的小片(約IOOmg)加入到磷酸鹽緩沖液(IOOmM, ρΗ7.0)中，加入酶液(約0.92mg)用以處理聚乙烯薄膜,37.?、125;τ/η?η震蕩下反應(yīng)4d。
[0010]反應(yīng)結(jié)束后取出聚乙烯小片，首先用1% SDS溶液浸泡30min，然后用蒸餾水徹底沖洗，自然干燥。分別以水接觸角(WCA)、ATR-FTIR和SEM方法表征漆酶對(duì)聚乙烯的降解效果.
[0011]本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0012]1.在分離過程中，采用各種濃縮方法相結(jié)合，提高了實(shí)驗(yàn)室條件下大量培養(yǎng)菌株分離胞外酶的效率。
[0013]2.胞外酶的生產(chǎn)分離及酶對(duì)聚乙烯的處理過程不需要特殊的儀器，易操作。
[0014]3.本發(fā)明提供的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，不僅可以應(yīng)用于淀粉基聚乙烯，也可應(yīng)用于石油基聚乙烯，可以應(yīng)用于低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)及高密度聚乙烯(HDPE)的任何一種聚合物的氧化降解。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理前后的接觸角(WCA)結(jié)果。未處理聚乙烯的WCA為98.1±2.2° ;酶處理聚乙烯的WCA為69.0±5.4° 表示兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)p〈0.001，表明酶處理前后聚乙烯薄膜的WCA有顯著性差異，聚乙烯親水性增強(qiáng)。
[0016]圖2為聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理前后ATR-FTIR結(jié)果。酶處理后聚乙烯表面在1740、1660和1000~1200cm-1出現(xiàn)新峰。
[0017]圖3為聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理前后的SEM照片。(a)為未處理聚乙烯，表面光滑；(b)為酶處理聚乙烯，表面出現(xiàn)裂縫和凹槽，有明顯侵蝕現(xiàn)象；放大倍數(shù)均為20，000X。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019]向500mL的錐形瓶中裝入含10 μ M Cu2+的發(fā)酵培養(yǎng)基200mL，滅菌后加入培養(yǎng)24h的種子液，接種濃度2 X 105CFU/mL ；37°C U25r/min震蕩培養(yǎng)6d。發(fā)酵完成后，將培養(yǎng)液分裝入50mL離心管，在3500rpm、4°C下離心20min，收集上清棄去沉淀。向發(fā)酵液中緩慢加硫酸銨粉末至85%飽和度，4°C保溫一夜。4000rpm、4°C離心40min，收集蛋白質(zhì)沉淀，多次水重懸浮去除不溶性物質(zhì)。透析脫鹽后以丁香醛連氮測(cè)定漆酶活力，為43.4U/mL。漆酶的最適反應(yīng)溫度和PH分別為60°C和5.0。
[0020]實(shí)施例2
[0021]將聚乙烯薄膜裁成1.5cmX 1.0cm和1.5cmX0.5cm大小，用I % SDS溶液浸泡30min,然后用蒸懼水徹底沖洗，自然干燥。向裝有IOOmg聚乙烯小片的50mL錐形瓶中，加入IOmL滅菌的IOOmM磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.0)和0.1mL酶溶液(約0.92mg酶)；同樣條件，未加酶溶液的作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。37°C、125r/min，反應(yīng)。4d后取樣，用I % SDS溶液浸泡聚乙烯30min，用蒸餾水徹底沖洗，自然干燥后作表征。WCA、ATR-FTIR和SEM的結(jié)果見附圖1~3。
[0022]圖1接觸角(WCA)的結(jié)果表明，聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理后表面親疏水性質(zhì)發(fā)生了顯著變化，WCA減小，從98.1°降低到69.0°，聚乙烯變得相對(duì)親水。圖2ATR-FTIR可以看出，聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理后表面官能團(tuán)發(fā)生了變化，出現(xiàn)了極性基團(tuán)羰基C = O。圖3SEM觀察表明，聚乙烯薄膜經(jīng)漆酶處理后表面物理形貌發(fā)生變化，出現(xiàn)了裂縫、凹槽等侵蝕現(xiàn)象，表面變得相對(duì)粗糙。
[0023]從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法得到的胞外漆酶對(duì)聚乙烯具有氧化和降解作用，且在分離過程中采用各種濃縮方法相結(jié)合，提高了實(shí)驗(yàn)室條件下大量培養(yǎng)菌株分離聚乙烯降解酶 的效率。
【權(quán)利要求】
1.芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:在選定的含銅培養(yǎng)基中接種菌株，在適宜的產(chǎn)酶條件下發(fā)酵，通過一定的方法分離濃縮得到漆酶，再用此酶降解聚乙烯薄膜，在適宜條件下作用一定時(shí)間后取出樣品，洗凈后表征漆酶降解效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:本發(fā)明采用的菌株為芽孢桿菌YPl (CGMCC6318，Bacillus sp.YPl)。所用種子培養(yǎng)基為普通肉湯培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加去離子水至lL，pH7.4±0.2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:聚乙烯可以是淀粉基聚乙烯，也可以是石油基聚乙烯，可以是低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)及高密度聚乙烯(HDPE)的任何一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖 20，KH2PO40.7，K2HPO40.7，MgSO4.7Η200.7，NaN032.0，NaCl0.005，F(xiàn)eSO4.7Η200.002，ZnSO4.7Η200.002，MnSO4.H2O0.001，CuSO4.5Η200 ~0.005，pH自然。
5.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:發(fā)酵產(chǎn)酶條件為37°C、125r/min震蕩培養(yǎng)2~IOcL
6.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:在4°C、4000rpm離心40mi n后得發(fā)酵上清液,再逐漸加硫酸銨粉末至85%飽和度,得蛋白質(zhì)沉淀，Mw3500Da透析除硫酸銨和離心除變性蛋白后以冷凍干燥法得酶粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求書4和5所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中Cu2+濃度為10 μ Μ,培養(yǎng)6d時(shí)菌株YPl產(chǎn)漆酶活性最大；漆酶的最適反應(yīng)溫度和PH分別為60°C和5.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的芽孢桿菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是:漆酶降解聚乙烯的條件為:聚乙烯薄膜IOOmg(裁成1.5cmX 1.0cm和1.5cmX0.5cm的小片)、0.92mg 酶、ρΗ7.0、37°C、125r/min，反應(yīng) 4d。
【文檔編號(hào)】C08J11/10GK103980535SQ201410225175
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】楊軍, 汪祥燕, 楊宇, 于憶瀟 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)