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真菌細(xì)胞壁降解酶的制作方法

文檔序號(hào):1351572閱讀:2568來源:國知局
專利名稱:真菌細(xì)胞壁降解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性的真菌酶,編碼該溶菌酶的核苷酸序列,包含該核苷酸序列的核酸構(gòu)建體,生產(chǎn)該溶菌酶的方法,以及該溶菌酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)
溶菌酶是一種由許多種生物作為對(duì)抗細(xì)菌的防御性機(jī)制生產(chǎn)的O-糖基水解酶。該酶通過剪切肽聚糖的糖苷鍵引發(fā)細(xì)菌細(xì)胞壁的水解;所述肽聚糖是細(xì)菌中一種重要的結(jié)構(gòu)分子。在它們的細(xì)胞壁被溶菌酶作用弱化后,細(xì)菌細(xì)胞由于滲透壓而裂解。
溶菌酶存在于許多生物中,如病毒,植物,昆蟲,鳥類,爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物。在哺乳動(dòng)物中,已經(jīng)從鼻分泌物,唾液,眼淚,腸,尿和乳中分離出溶菌酶。該酶剪切N-乙?;谒岬?號(hào)碳和N-乙?;?D-葡糖胺的4號(hào)碳之間的糖苷鍵。在體內(nèi),這兩種糖聚合形成細(xì)胞壁多糖。
溶菌酶對(duì)其顯示有效性的細(xì)菌包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)。
卵清溶菌酶蛋白的溶菌作用目前用在兩個(gè)市場(chǎng)中。
在干酪生產(chǎn)中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溶菌酶對(duì)于營(yíng)養(yǎng)體型的梭菌屬細(xì)菌并且特別是酪丁酸梭菌具有有效破壞性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌在用于生產(chǎn)干酪的奶的熱處理后能夠存活并且隨后繁殖以引發(fā)后期氣孔生成(late blowing)。后期氣孔生成是在發(fā)生于干酪成熟期間丁酸發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣。不必要的產(chǎn)氣(eyes)可能造成這樣的影響產(chǎn)生不規(guī)則形狀的氣孔而造成的結(jié)構(gòu)缺陷;或明顯令人不快的味道和氣味;最后,干酪塊可能完全裂開。在奶發(fā)酵中使用溶菌酶,可以進(jìn)行干酪的生產(chǎn)和加工而不用考慮丁酸發(fā)酵引發(fā)后期氣孔生成。這帶來歐洲干酪生產(chǎn)中廣泛使用溶菌酶,特別是在中度和長(zhǎng)期成熟的干酪的制造中。推薦的劑量是0.2Ibs/1000加侖奶。由于熱不穩(wěn)定性,溶菌酶必須在最后的熱處理之后加入,并且由于蛋白酶敏感性在粗制凝乳酶加入之前盡可能早地加入。
在藥學(xué)中,溶菌酶在生物液體中的天然功能是攻擊對(duì)于身體外源的細(xì)菌。許多通過任何典型途徑——眼、口、鼻和傷口侵襲身體的細(xì)菌受到人免疫系統(tǒng)的對(duì)抗,溶菌酶是所述免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵部分。通過生產(chǎn)包含這種卵清來源的蛋白質(zhì)的藥物片劑和膠囊已經(jīng)將這種抗感染活性用于藥物工業(yè)中。它還是眼藥水、牙膏和喉片中的重要成分。溶菌酶的潛在用途是多樣的。已經(jīng)在癌癥研究和獸醫(yī)應(yīng)用中確定了成功的結(jié)果。作為食品防腐劑,溶菌酶是許多潛在致癌物的天然、有機(jī)替代物。溶菌酶在嬰兒食品應(yīng)用以及動(dòng)物飼料中的應(yīng)用已經(jīng)顯示出積極的結(jié)果。這種卵清來源的酶的潛能是多樣的并且對(duì)將來應(yīng)用的研究和開發(fā)正在進(jìn)行之中。
已經(jīng)報(bào)道了一種來自Chalaropsis的GH25溶菌酶(Felsch JW,Ingagami T,and Hash JH.(1975)The N,O-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species;VThe complete amino acid sequence.JBC.25010pp 3713-3720)。
可以在商業(yè)市場(chǎng)上購得的主要產(chǎn)品是母雞卵清溶菌酶,其并不剪切在例如金黃色鏈球菌(Streptococcus aureus)細(xì)胞壁中的N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶(N,6-O-diacetylmuramidase)因而不能溶解這種重要的人類病原體及其他。
所以需要新的具有溶菌酶活性的多肽。
發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人分離了一種編碼具有溶菌酶活性的酶的真菌基因/cDNA。據(jù)我們所知編碼這種酶的基因/cDNA以往未曾被描述過。
所以在第一方面本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性并且屬于GH25家族的真菌多肽。
在第二方面本發(fā)明涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
定義在討論本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施方案之前,提供相對(duì)于本發(fā)明主要方面的特定術(shù)語的定義。
縮寫GicNAc,N-乙酰氨基葡萄糖;MurNAc,N-乙?;谒峄旧霞兊亩嚯?substantially pure polypeptide)在本文中,術(shù)語“基本上純的多肽”意指多肽制品,其最多包含10重量%的與它天然伴隨的其它多肽物質(zhì)(其它多肽物質(zhì)的更低百分比是優(yōu)選的,例如,最多8重量%,最多6重量%,最多5重量%,最多4重量%,最多3重量%,最多2重量%,最多1重量%,最多1/2重量%)。因而,優(yōu)選所述基本上純的多肽具有至少92%的純度,即,所述多肽構(gòu)成存在于制品中總多肽物質(zhì)的重量的92%,優(yōu)選更高的百分比如至少94%的純度,至少95%的純度,至少96%的純度,至少97%的純度,至少98%的純度,至少99%的純度,最多99.5%純度。優(yōu)選本文公開的多肽是基本上純的形式。特別地,優(yōu)選本文公開的多肽是“實(shí)質(zhì)上(essentially)純的形式”,即所述多肽制品實(shí)質(zhì)上不含它所天然伴隨的其它多肽物質(zhì)。這可以,例如,通過公知的重組方法制備多肽而實(shí)現(xiàn)。這里,術(shù)語“基本上純的多肽”與術(shù)語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”是同義的。
溶菌酶活性術(shù)語溶菌酶活性在本文中定義為O-糖基水解酶,其催化兩種或多種糖之間,或糖和非糖部分之間的糖苷鍵的水解。溶菌酶剪切細(xì)菌細(xì)胞壁的粘多糖和粘多肽中某些殘基之間的糖苷鍵,導(dǎo)致細(xì)菌裂解。溶菌酶屬于酶類別EC3.2.1.17。
同一性在本文中,兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的同源性由參數(shù)“同一性”來描述。
為了本發(fā)明的目的,通過可用于蛋白質(zhì)和DNA比對(duì)的Needleman-Wunsch比對(duì)來確定兩種氨基酸序列之間的同一性程度。對(duì)于蛋白質(zhì)比對(duì)來說所用的默認(rèn)評(píng)分矩陣為BLOSUM50,對(duì)缺口中第一個(gè)殘基的罰分為-12,而對(duì)缺口中其它殘基的罰分為-2??梢杂脕碜訤ASTA軟件包v20u6版的Align軟件進(jìn)行比對(duì)(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″,PNAS 852444-2448;andW.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA″,Methods in Enzymology,18363-98)。
使用同一性矩陣為默認(rèn)評(píng)分矩陣,利用與上面所述相同的算法和軟件包可以確定兩種核苷酸序列之間的同一性程度。對(duì)缺口中第一個(gè)殘基的罰分為-16,而對(duì)缺口中的其它殘基的罰分為-4。
片段當(dāng)在本文中使用時(shí),SEQ ID NO2的“片段”是保留氨基酸序列的溶菌酶活性,但有一個(gè)或多個(gè)氨基酸從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除的多肽。優(yōu)選地,一個(gè)片段包含SEQ ID NO2的至多208個(gè)氨基酸殘基,例如,氨基酸20-228。
基本上純的多核苷酸如本文所用的術(shù)語“基本上純的多核苷酸”指這樣一種多核苷酸制品,其中所述多核苷酸已經(jīng)離開了其天然遺傳環(huán)境,因此不含其它無關(guān)的或不需要的編碼序列,并且為適于應(yīng)用在遺傳工程蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中的形式。因而,基本上純的多核苷酸最多包含10%重量的與它天然伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)(其它多核苷酸物質(zhì)的更低百分比是優(yōu)選的,例如,最多8重量%,最多6重量%,最多5重量%,最多4重量%,最多3重量%,最多2重量%,最多1重量%,最多1/2重量%)。不過,基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū),如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選所述基本上純的多核苷酸具有至少92%的純度,即,所述多核苷酸構(gòu)成存在于制品中總多核苷酸物質(zhì)的重量的至少92%,優(yōu)選更高的百分比如至少94%的純度,至少95%的純度,至少96%的純度,至少97%的純度,至少98%的純度,至少99%的純度,最多99.5%的純度。優(yōu)選本文公開的多核苷酸是基本上純的形式。特別地,優(yōu)選本文公開的多核苷酸是“實(shí)質(zhì)上純的形式”,即所述多核苷酸制品實(shí)質(zhì)上不含與它天然伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)。這可以,例如,通過公知的重組方法制備多核苷酸而實(shí)現(xiàn)。這里,術(shù)語“基本上純的多核苷酸”與術(shù)語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”是同義的。
修飾在本發(fā)明的上下文中術(shù)語“修飾”意指由顯示為SEQ ID NO2的氨基酸1-233的氨基酸序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾以及編碼該多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是在目標(biāo)氨基酸中或目標(biāo)氨基酸上的氨基酸側(cè)鏈的替換,取代,刪除和/或插入。
人工變體當(dāng)在本文中使用時(shí),術(shù)語“人工變體”意為具有溶菌酶活性的多肽,其由一種生物產(chǎn)生,所述生物表達(dá)與SEQ ID NO1相比修飾過的基因。所述修飾過的基因當(dāng)在合適的宿主中表達(dá)時(shí)由此產(chǎn)生所述變體,該基因是通過人類干預(yù)由SEQ ID NO1中公開的核苷酸序列的修飾而獲得的。
cDNA當(dāng)用于本文中時(shí)術(shù)語“cDNA”意在涵蓋可以通過由源自真核細(xì)胞的成熟的、經(jīng)過剪切的mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起初的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體并且它在變?yōu)槌墒斓慕?jīng)過剪切的mRNA之前經(jīng)歷一系列加工事件。這些事件包括通過稱作剪切的過程來除去內(nèi)含子序列。當(dāng)cDNA源自mRNA時(shí),它相應(yīng)地缺少內(nèi)含子序列。
核酸構(gòu)建體當(dāng)用于本文時(shí),術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意為一種核酸分子,不論是單鏈或雙鏈的,其分離自天然存在的基因或者其經(jīng)過修飾以天然不存在的方式包含核酸的片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的編碼序列表達(dá)所需的控制序列時(shí),術(shù)語“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。
控制序列術(shù)語“控制序列”在這里定義為包括任何組分,其是本發(fā)明的多肽表達(dá)所必需的或有益的。每種控制序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外源的。這些控制序列包括,但不限于,前導(dǎo)序列,多腺苷化序列,前肽序列,啟動(dòng)子,信號(hào)肽序列,和轉(zhuǎn)錄終止子。至少,所述控制序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄與翻譯終止信號(hào)。所述控制序列具有接頭用來導(dǎo)入有利于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)連接的特定限制性位點(diǎn)。
可操作性連接的術(shù)語“可操作性連接的”在本文中被定義為這樣一種構(gòu)型,其中將控制序列相對(duì)于DNA序列的編碼序列適當(dāng)?shù)刂糜谝粋€(gè)位置上從而使控制序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
編碼序列當(dāng)在本文中使用時(shí)術(shù)語“編碼序列”意在涵蓋核苷酸序列,其直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框確定,其通常以ATG起始密碼子開始。所述編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。
表達(dá)在本文中,術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽生產(chǎn)的任何步驟,包括但不限于,轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
表達(dá)載體在本文中,術(shù)語“表達(dá)載體”涵蓋線性或環(huán)狀的DNA分子,,其包含編碼本發(fā)明多肽的片段,并且所述片段可操作性地連接到提供其轉(zhuǎn)錄的其它片段上。
宿主細(xì)胞如本文所用的,術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何易受核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型。當(dāng)使用細(xì)菌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)它不適于表達(dá)本發(fā)明的真菌多肽,不過,細(xì)菌宿主細(xì)胞可以用于克隆目的。
術(shù)語“多核苷酸探針”,“雜交”以及各種嚴(yán)格條件在標(biāo)題為“具有溶菌酶活性的多肽”的部分進(jìn)行定義。
發(fā)明詳述本發(fā)明的多肽是在篩選高度分泌的多肽的過程中從真菌,更確切從朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus,與朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)同義)中分離的,其功能已被確定。在第一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性并且屬于GH25家族的真菌多肽。EC3.2.1.17酶活性分類包括進(jìn)行原核生物細(xì)胞壁的肽聚糖雜聚物中N-乙?;?D-葡糖胺和N-乙酰基胞壁酸之間1,4-β-鍵水解的酶。一種酶可以具有一種底物特異性(例如N-乙?;谒?而沒有另一種底物特異性(在此情況下為N-乙?;?D-葡糖胺)。
GH25家族是根據(jù)Henrissat糖基水解酶家族分類的酶的分類(Henrissat B.,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280309-316(1991);Henrissat B.,BairochA.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.293781-788(1993);Henrissat B.,Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316695-696(1996);Davies G.,Henrissat B.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3853-859(1995))。
除了GH25之外,具有溶菌酶(EC3.2.1.17)活性的其它水解酶家族有GH22,GH23和GH24。家族GH22,或溶菌酶C包括雞卵清溶菌酶和反芻動(dòng)物的胃溶菌酶。此家族是四個(gè)家族中研究最廣泛的。一般稱為溶菌酶G的GH23由Goose和許多研究較少的來自基因組測(cè)序項(xiàng)目的噬菌體以及細(xì)菌序列所代表。GH24包括特別是噬菌體T4和其它噬菌體和細(xì)菌溶菌酶。由Seo等2003年(Seo HJ;Kitaoka M;Ohmiya K;Hayashi K.,(2003)Substratespecificity of the N,6-O-diacetylmuramidase from Streptomyces globisporus.Journal of Bioscience and Bioengineering,Vol.95(3)pp.313-316)進(jìn)行的研究顯示,至少對(duì)于球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)GH25酶來說,觀察到與雞卵清溶菌酶GH22相比不同的活性譜。該鏈霉菌的酶具有N-乙酰胞壁質(zhì)酶和N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶活性。這使得球孢鏈霉菌酶能夠降解高度乙?;慕瘘S色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)胞壁。這種活性可以外推到該家族中的其它溶菌酶,如本發(fā)明的溶菌酶GH25。
在另外的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及這樣的多肽,其中所述包含與SEQ IDNO2的氨基酸1-233具有至少65%,優(yōu)選至少70%,例如至少75%,更加優(yōu)選至少80%,如至少85%,還要更加優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%,例如至少96%,如至少97%,還要最優(yōu)選至少98%,如至少99%的同一性程度的氨基酸序列,優(yōu)選由所述氨基酸序列組成(下文中稱為″同源性多肽″)。在一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1-233至多有十個(gè)氨基酸(例如十個(gè)氨基酸)不同,特別是至少五個(gè)氨基酸(例如五個(gè)氨基酸),如至多四個(gè)氨基酸(例如四個(gè)氨基酸),例如至多三個(gè)氨基酸(例如三個(gè)氨基酸)不同。在一個(gè)特別令人感興趣的實(shí)施方案中,所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1-233至多有兩個(gè)氨基酸(例如兩個(gè)氨基酸),如一個(gè)氨基酸不同。
優(yōu)選地,本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列;其等位變體;或其具有溶菌酶活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸1-233。在另外的實(shí)施方案中,所述多肽由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成。
本發(fā)明的多肽可以是由天然來源鑒定和分離的野生型溶菌酶。這些野生型多肽可以例如通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行具體鑒定,所述方法是一種能夠用來鑒定溶菌酶候選物的方法。簡(jiǎn)言之GH25溶菌酶候選物可以通過利用GH25家族的已知溶菌酶作為搜索序列在基因組或cDNA測(cè)序項(xiàng)目中直接進(jìn)行鑒定。另一種方法是利用一種標(biāo)準(zhǔn)的同源性搜索程序如WU-BlastX(2.0a19MP-WashU)比較所有的獨(dú)特DNA片段(重疊群)。
另外,可以通過如在J.E.Ness等,Nature Biotechnology17,893-896(1999)中所述的DNA改組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。而且,本發(fā)明的多肽可以是一種人工變體,其包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比具有氨基酸的至少一個(gè)取代,刪除和/或插入的氨基酸序列,或優(yōu)選由其組成。這些人工變體可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建,如通過包含顯示為SEQ IDNO2的氨基酸1-233的多肽的定點(diǎn)/隨機(jī)誘變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,氨基酸變化(在人工變體以及在野生型多肽中)是微小的,這些變化有保守性氨基酸取代,并不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和或活性;小的刪除,一般是1個(gè)到大約30個(gè)氨基酸;小的氨基-或羧基-末端延長(zhǎng),例如氨基末端的甲硫氨酸殘基;長(zhǎng)達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小的連接肽;或小的延伸,其通過改變靜電或另一種功能而有利于純化,如多組氨酸區(qū)(polyhistidinetract),抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守性取代的實(shí)例是在各組氨基酸堿性氨基酸(精氨酸,賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸,異亮氨酸,纈氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸,色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸,丙氨酸,絲氨酸和蘇氨酸)之內(nèi)發(fā)生取代。一般不改變特定活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的,并且由例如,H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,TheProteins,Academic Press,New York所描述。最常發(fā)生的互換是Ala/Ser,Val/lle,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,和Asp/Gly以及這些的反向互換。
在本發(fā)明的一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述氨基酸變化使多肽的物理-化學(xué)特性得以改變。例如,可以進(jìn)行提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性改變最適pH值等等的氨基酸改變。
優(yōu)選地,與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比,這些取代、刪除和/或插入的數(shù)目為至多10個(gè),例如至多9個(gè),如至多8個(gè),更加優(yōu)選至多7個(gè),例如至多6個(gè),如至多5個(gè),最優(yōu)選至多4個(gè),例如至多3個(gè),如至多2個(gè),特別是至多1個(gè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及具有溶菌酶活性的多肽,其由在極低嚴(yán)格條件下,優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下,更加優(yōu)選在中等嚴(yán)格條件下,更加優(yōu)選在中等高度嚴(yán)格條件下,進(jìn)一步優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下,最優(yōu)選在極高嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交的核苷酸序列所編碼(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd edition,Cold SpringHarbor,New York)。
SEQ ID NO1的核苷酸序列或其子序列,以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段,可以用來設(shè)計(jì)多核苷酸探針以便根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法由不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有溶菌酶活性的多肽的DNA。特別地,這些探針可以用來根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡操作與目標(biāo)屬或種的基因組或cDNA雜交,以便鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可以比完整序列短得多,但長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)為至少15,優(yōu)選至少25,更加優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸,如至少70個(gè)核苷酸長(zhǎng)。不過,優(yōu)選所述多核苷酸探針至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)。例如,所述多核苷酸探針可以至少200個(gè)核苷酸長(zhǎng),至少300個(gè)核苷酸長(zhǎng),至少400個(gè)核苷酸長(zhǎng)或至少500個(gè)核苷酸長(zhǎng)。甚至可以使用更長(zhǎng)的探針,例如,至少600個(gè)核苷酸長(zhǎng),至少700個(gè)核苷酸長(zhǎng),至少800個(gè)核苷酸長(zhǎng),或至少900個(gè)核苷酸長(zhǎng)的多核苷酸探針。可以使用DNA和RNA探針。一般對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記以便檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如,用32P,3H,35S,生物素,或抗生物素蛋白)。
由此,可以從制備自這些其它生物的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并編碼具有溶菌酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳,或其它分離技術(shù)來從這些其它生物中分離基因組或其它DNA??梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移到并固定于硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1同源的克隆或DNA,將具有固定DNA的載體材料用于Southern印跡中。
為了本發(fā)明的目的,“雜交”表明所述核苷酸序列在極低到極高嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的多核苷酸序列雜交,該標(biāo)記的多核苷酸序列與SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列雜交。利用X射線膠片或通過本領(lǐng)域已知的其它方法可以檢測(cè)在這些條件下與所述多核苷酸探針雜交的分子。無論何時(shí)術(shù)語“多核苷酸探針”用于本文,應(yīng)當(dāng)理解這種探針包含至少15個(gè)核苷酸。
在另一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述多核苷酸探針是編碼SEQ IDNO2的多肽的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈。在另一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述多核苷酸探針是SEQ ID NO1的互補(bǔ)鏈。在另一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述多核苷酸探針是SEQ ID NO1的成熟肽編碼區(qū)的互補(bǔ)鏈。
對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的長(zhǎng)探針,極低到極高嚴(yán)格條件被定義為按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡操作,在42℃于5X SSPE,1.0%SDS,5X Denhardt′s溶液,100μg/ml剪切和變性的鮭魚精子DNA中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。優(yōu)選地,至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的長(zhǎng)探針包含不超過1000個(gè)核苷酸。對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)的長(zhǎng)探針,最后用2×SSC,0.1%SDS于42℃(極低嚴(yán)格)將載體材料洗滌三次每次15分鐘,優(yōu)選地用0.5×SSC,0.1%SDS于42℃(低嚴(yán)格)洗滌三次每次15分鐘,更加優(yōu)選地用0.2×SSC,0.1%SDS于42℃(中等嚴(yán)格)洗滌三次每次15分鐘,進(jìn)一步優(yōu)選地用0.2×SSC,0.1%SDS于55℃(中高度嚴(yán)格)洗滌三次每次15分鐘,最優(yōu)選地用0.1×SSC,0.1%SDS于60℃(高度嚴(yán)格)洗滌三次每次15分鐘,特別地用0.1×SSC,0.1%SDS于68℃(極高嚴(yán)格)洗滌三次每次15分鐘。
盡管不是特別優(yōu)選地,預(yù)期也可以使用較短的探針,例如從大約15到99個(gè)核苷酸長(zhǎng)的探針,如從大約15到大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)。對(duì)于這些短探針,嚴(yán)格條件被定義為,于0.9M NaCl,0.09M Tris-HCI pH 7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1X Denhardt′s溶液,1mM焦磷酸鈉,1mM磷酸二氫鈉,0.1mMATP,和0.2mg酵母RNA每ml中,在比根據(jù)Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 481390)的計(jì)算法計(jì)算的Tm低5℃到10℃的溫度下,按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡操作進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和洗滌雜交后產(chǎn)物。
溶菌酶活性對(duì)于溶菌酶活性的測(cè)定已經(jīng)描述了幾種測(cè)定法。在J.Biochem.(H.Maeda,1980,vol.88(4)1185-1191)中描述的一種測(cè)定法是基于利用熒光素標(biāo)記的肽聚糖作為底物的熒光極化作用或熒光強(qiáng)度,所述熒光素標(biāo)記的肽聚糖獲自溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)。
另一種測(cè)定法是基于在450nm處監(jiān)測(cè)由溶菌酶造成的藤黃微球菌(Micrococcus luteus)懸液的澄清,并與已知活性的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)相比較。這種測(cè)定法是在FIP Center for Standards,International Commission onPharmaceutical Enzymes,Harelbekestaat 72,B-9000gent,Belgium中開發(fā)出來的。這種測(cè)定法需要使用凍干的存活藤黃微球菌ATCC 4698細(xì)胞。這種底物以及詳細(xì)的方案可以由上述Center for Standards獲得。
另一種測(cè)定法,EnzChekLysozyme Assay Kit(E-22013),可由MolecularProbes獲得,并且是基于對(duì)標(biāo)記以熒光素的溶壁微球菌細(xì)胞壁的溶菌酶活性的測(cè)量。
具有溶菌酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽是真菌多肽。如本文所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota),壺菌門(Chytridiomycota),和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等于Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定義的),以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人,1995,同前,第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人,1995,同前)。
在具體的實(shí)施方案中,所述真菌多肽是酵母多肽。在此所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(Fungi Imperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變,為了本發(fā)明的目的,酵母的定義將如Biology and Activities of Yeast,Skinner,F(xiàn).A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編,Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9,1980所述。
在特定實(shí)施方案中的酵母多肽為假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽。在一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,所述多肽是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis的多肽。
在另一種特定實(shí)施方案中,本發(fā)明的真菌多肽是絲狀真菌多肽如枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、籃霉屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)的多肽。
在另一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案中,多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、網(wǎng)狀鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、肽色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
將會(huì)理解的是對(duì)于前述物種,本發(fā)明包括完全和不完全的狀態(tài),以及其它分類學(xué)上的等價(jià)物,例如無性型,不管其種名如何。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將方便地認(rèn)識(shí)到合適的等價(jià)物的同一性。
公眾可以方便地從多個(gè)培養(yǎng)物保藏中心,如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)處獲得這些物種的菌株。
此外,可以使用上述探針從其它來源包括從自然界(例如,土壤、堆肥、水等等)分離的微生物中鑒定并獲得這些多肽。從自然生境分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知。然后類似地通過篩選另一種微生物的基因組文庫或cDNA文庫可得到核苷酸序列。一旦用探針檢測(cè)到編碼該多肽的核酸序列,可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的技術(shù)分離或克隆該序列(見,例如,Sambrook等人,1989,同前)。
由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的多肽也包括融合多肽或可切開的融合多肽,其中另一種多肽在該多肽或其片段的N端或C端與之融合。融合多肽是通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)相融合而產(chǎn)生的。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域中已知,包括連接編碼多肽的編碼序列,使得它們共閱讀框,并使融合多肽的表達(dá)位于相同啟動(dòng)子和終止子的控制之下。
多核苷酸和核苷酸序列本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特別地,本發(fā)明涉及由編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。在具體的實(shí)施方案中,所述核苷酸序列在SEQ ID NO1中給出。在更加具體的實(shí)施方案中,核苷酸序列139-724是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。
本發(fā)明還包括具有編碼由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成的多肽的核苷酸序列的多核苷酸,優(yōu)選由其組成,所述多核苷酸基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與SEQ ID NO1區(qū)別。
本發(fā)明還涉及具有編碼具溶菌酶活性的SEQ ID NO2片段的SEQ IDNO1的子序列的多核苷酸,優(yōu)選由其組成。SEQ ID NO1的子序列是SEQID NO1所包括的核苷酸序列,除了從5’和/或3’端已刪去了一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還涉及具有在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)修飾的經(jīng)修飾的核苷酸序列的多核苷酸,優(yōu)選由其組成,其中所述經(jīng)修飾的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸19-233。
用于分離或克隆編碼一種多肽的核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知,包括從基因組DNA的分離、從cDNA的制備或其組合。例如,通過使用眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)庫的抗體篩選來檢測(cè)具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段,能從這種基因組DNA中克隆本發(fā)明的核酸序列。參見,例如,Innis等,1990,PCRA Guide to Methods and Application,AcademicPress,New York。可以應(yīng)用其它核酸擴(kuò)增方法如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)??蓮那怪昊蛄硪环N或相關(guān)生物中克隆核酸序列,因而,該核酸序列可以是例如該核酸序列多肽編碼區(qū)的等位變體或種間變體。
可通過基因工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得核苷酸序列,以便將該核苷酸序列從其天然位置再定位到另外的位點(diǎn),在此位點(diǎn)上該序列將被復(fù)制??寺》椒砂ò幋a該多肽的核苷酸序列的期望片段的切割和分離、該片段向載體分子中的插入,以及重組載體向宿主細(xì)胞中的摻入,在宿主細(xì)胞中該核酸序列的多拷貝或克隆將被復(fù)制。該核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成的來源或其任意組合。
本發(fā)明還涉及多核苷酸,其具有與SEQ ID NO1的核苷酸84-782有至少65%同一性的核苷酸序列,優(yōu)選由其組成。優(yōu)選地,所述核苷酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸84-782有至少70%同一性,例如,至少80%同一性,如至少90%同一性,更加優(yōu)選至少95%同一性,如至少96%同一性,例如至少97%同一性,還要更加優(yōu)選至少98%同一性,如至少99%同一性。特別地,所述核苷酸序列編碼具有溶菌酶活性的多肽。如先前所述的那樣來測(cè)定兩種核苷酸序列之間的同一性程度(見標(biāo)題為“定義”的部分)。
編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的修飾對(duì)于多肽的合成可能是必需的,所述多肽包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比具有至少一個(gè)置換、刪除和/或插入的氨基酸序列。這些人工變體可能以工程改造的方式有別于分離自其天然來源的多肽,例如,在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等等方面有所區(qū)別的變體。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯然這種修飾能在分子功能的關(guān)鍵區(qū)之外進(jìn)行,而仍產(chǎn)生活性多肽。為本發(fā)明的分離核酸序列所編碼的多肽的活性所必需,因此優(yōu)選地不予修飾的氨基酸殘基,可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法如定點(diǎn)誘變或丙氨酸分區(qū)誘變(見,例如,Cunningham和Wells,1989,Science 2441080-1085)來鑒定。在后一種方法中,在分子中每一帶正電荷的殘基處均引入突變,測(cè)定產(chǎn)生的突變分子的溶菌酶活性(如實(shí)施例所示)以鑒定對(duì)于分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也能通過三維結(jié)構(gòu)分析來確定,三維結(jié)構(gòu)由核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記(見,例如,de Vos等,1992,Science 255306-312;Smith等,1992,Journal of Molecular Biology224899-904;Wlodaver等,1992,F(xiàn)EBS Letters 30959-64)來確定。
另外,通過導(dǎo)入核苷酸取代可以修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列,所述取代不會(huì)產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列,但是其對(duì)應(yīng)于宿主生物產(chǎn)生酶所偏好的密碼子用法。
通過利用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變,可以將一個(gè)核苷酸調(diào)換另一個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)入核苷酸序列中。特別有用的是利用具有目標(biāo)插入片段超螺旋的雙鏈DNA載體和兩個(gè)包含所需突變的合成引物的方法。每條分別與載體的相對(duì)鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物借助Pfu DNA聚合酶在溫度循環(huán)過程中延伸。納入引物后,生成包含錯(cuò)列缺口的突變質(zhì)粒。在溫度循環(huán)后,用對(duì)于甲基化和半甲基化DNA特異性的DpnI處理產(chǎn)物以消化親代DNA模板并選擇包含突變的合成DNA。還可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法。關(guān)于核苷酸取代的一般性描述參見,例如,F(xiàn)ord等,1991,Protein Expression andPurification 295-107。
本發(fā)明還涉及一種多核苷酸,其具有編碼具溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列,優(yōu)選由其組成,并且其在極低嚴(yán)格條件下,優(yōu)選在低嚴(yán)格條件下,更加優(yōu)選在中等嚴(yán)格條件下,更加優(yōu)選在中等高度嚴(yán)格條件下,進(jìn)一步優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下,最優(yōu)選在極高嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交。
如將要被理解的,所述核苷酸序列的與雜交相關(guān)的細(xì)節(jié)和詳細(xì)說明將與在標(biāo)題為“具有溶菌酶活性的多肽”部分討論的雜交方面相同或類似。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含可操作性連接到一種或多種控制序列上的本發(fā)明的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體,所述控制序列在與控制序列相容的條件下于合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
可以用多種方式操作編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體,在核苷酸序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可以是有利的或必需的。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
控制序列可以是合適的啟動(dòng)子序列,即為了核酸序列的表達(dá)而被宿主細(xì)胞識(shí)別的一種核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列,包括突變型、截短型或雜合型啟動(dòng)子,并可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
在絲狀真菌宿主細(xì)胞中引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從編碼下列酶的基因中獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gla A)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787),以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的雜合型啟動(dòng)子),及其突變型、截短型和雜合型啟動(dòng)子。
在酵母宿主中,有用的啟動(dòng)子可獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等,1992,Yeast,8423-488描述了用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用的啟動(dòng)子。
控制序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列,即被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的一種序列。終止子序列被可操作性地連接到編碼多肽的核酸序列的3’端。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選的終止子可從編碼釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因中獲得。Romanos等,1992,同前,描述了用于酵母宿主細(xì)胞的其它有用的終止子。
控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列,即對(duì)于宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA的一種非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列被可操作性地連接到編碼多肽的核酸序列的5’端。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的前導(dǎo)序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因中獲得。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)序列從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)中獲得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列,即被可操作性地連接到核酸序列3’端的一種序列,在轉(zhuǎn)錄時(shí)它可被宿主細(xì)胞作為信號(hào)識(shí)別,以將聚腺苷殘基加至轉(zhuǎn)錄的mRNA。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選的聚腺苷酸化序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因中獲得。Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology155983-5990描述了用于酵母宿主細(xì)胞的有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信號(hào)肽編碼區(qū),其編碼與多肽的氨基端相連接的氨基酸序列,并引導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列編碼序列的5’端可固有地含有信號(hào)肽編碼區(qū),該編碼區(qū)與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段在翻譯讀框內(nèi)天然連接?;蛘撸幋a序列的5’端可含有對(duì)于編碼序列外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列正常條件下不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí),可能需要外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。或者,外源信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替換天然信號(hào)肽編碼區(qū)以獲得增強(qiáng)的多肽分泌。然而,引導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
所述信號(hào)肽編碼區(qū)為SEQ ID NO1的核苷酸84-138,其編碼SEQ IDNO2的氨基酸1-18。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)纖維素酶基因或柔毛腐質(zhì)霉脂酶基因中獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因中獲得。Romanos等人,1992,同前,描述了其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)。
控制序列也可以是前肽編碼區(qū),其編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列。所產(chǎn)生的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或者有時(shí)稱為酶原(zymogen))。多肽原通常無活性,通過由多肽原催化或自催化地切割前肽能轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。
當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)兩者都存在于多肽的氨基端時(shí),前肽區(qū)緊接多肽的氨基端,信號(hào)肽區(qū)緊接前肽區(qū)的氨基端。
最好加入使得多肽表達(dá)能夠相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)而被調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是那些響應(yīng)包括存在調(diào)節(jié)化合物存在的化學(xué)或物理刺激而引起基因表達(dá)被打開或關(guān)閉的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在酵母中,可使用包括ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在絲狀真菌中,TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中,包括在氨甲蝶呤存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和有重金屬時(shí)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中,編碼多肽的核酸序列常與調(diào)節(jié)序列可操作性地連接。
表達(dá)載體本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。上述多種核苷酸和控制序列可以連接在一起產(chǎn)生重組表達(dá)載體,該重組表達(dá)載體可包括一種或多種適宜的限制性位點(diǎn),以便于編碼多肽的核酸序列在這些位點(diǎn)的插入或置換?;蛘?,可通過將核酸序列或含有該序列的核酸構(gòu)建體插入到合適的表達(dá)載體中來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在生成表達(dá)載體時(shí),將編碼序列定位于載體中,從而使編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作性地連接。
重組表達(dá)載體可以是能方便地對(duì)其進(jìn)行重組DNA程序并能導(dǎo)致核酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)?;虿《?。載體的選擇一般取決于載體與待引入載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制性載體,即,作為一種染色體外實(shí)體存在的載體,其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制,例如,質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。
載體可含有保證自我復(fù)制的任何工具?;蛘?,載體可以是這樣一種載體,當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時(shí),它整合到基因組中并與所整合的染色體一起復(fù)制。另外,可以使用單一載體或質(zhì)?;蚴莾煞N或多種載體或質(zhì)粒,它們一起含有被引入到宿主細(xì)胞基因組中的總DNA,或者可以是轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有允許容易地篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一種或多種選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因,其產(chǎn)物有助于產(chǎn)生對(duì)殺生物劑或病毒的抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型到營(yíng)養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)變等等。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記可以包括,但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶),以及其等價(jià)物。
優(yōu)選的用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amds和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有這樣的元件,其允許載體向宿主細(xì)胞基因組中的穩(wěn)定整合或載體在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞基因組的自主復(fù)制。
對(duì)于向宿主細(xì)胞基因組中的整合而言,載體可依賴編碼多肽的核苷酸序列,或用于通過同源或非同源重組使載體穩(wěn)定地整合到基因組中的載體的任何其它元件?;蛘撸d體可以含有用于引導(dǎo)通過同源重組向宿主細(xì)胞基因組中整合的附加的核苷酸序列。所述附加的核苷酸序列使載體能在染色體的精確位置整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性,整合元件優(yōu)選地應(yīng)含有足夠數(shù)量的與相應(yīng)靶序列高度同源的核酸,如100-1,500個(gè)堿基對(duì),優(yōu)選地400-1,500個(gè)堿基對(duì),最優(yōu)選地800-1,500個(gè)堿基對(duì),以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。另外,整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面,可以通過非同源重組將載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
對(duì)于自主復(fù)制而言,載體可進(jìn)一步包含使載體能在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起點(diǎn)可以具有使其在宿主細(xì)胞內(nèi)的作用成為溫度敏感型的突變(見,例如,Ehrlich,1978,Proceedings of the National.Academy of Sciences USA 751433)。
可以將多于一個(gè)拷貝的編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列插入宿主細(xì)胞中以增強(qiáng)該核酸序列的表達(dá)。通過將至少核酸序列的另一個(gè)拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中,或者將核酸序列包含有可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因,通過在合適的選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞,能篩選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而也就含有所述核酸序列的更多拷貝的細(xì)胞,由此可以獲得核苷酸序列拷貝數(shù)的增加。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知(見,例如,Sambrook等,1989,同前)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞,其方便地用于多肽的重組產(chǎn)生。將含有本發(fā)明的核苷酸序列的載體引入宿主細(xì)胞,以使載體作為染色體整合體或作為自我復(fù)制的染色體外載體而維持在胞內(nèi)。
宿主細(xì)胞可以是真核生物,如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物,或真菌細(xì)胞。并且,為了克隆的目的所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞,例如,大腸桿菌細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。在此所用的“真菌”包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和接合菌門(如Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK所定義的),以及卵菌門(如Hawksworth等人,1995,同前,第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人,1995,同前)。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中,真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在此所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變,對(duì)于本發(fā)明的目的而言,將如Biology and Activities of Yeast Skinner,F(xiàn).A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9,1980所述定義酵母。
在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中,酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia的細(xì)胞。
在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維酵母、諾地酵母或Saccharomycesoviformis細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia Lipolytica細(xì)胞。
在另一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中,真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?!敖z狀真菌”包括真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人,1995,同前,所述)。絲狀真菌的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲延伸,碳分解代謝是專性需氧的。相反,酵母如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過單細(xì)胞菌體的芽殖,碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
在一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌宿主細(xì)胞是但不限于枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢霉屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬或木霉屬的種的細(xì)胞。
在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、肽色鐮孢、擬枝孢鐮孢、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum細(xì)胞。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌親代細(xì)胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens、柔毛腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或綠色木霉多肽。
真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和以本來已知的方式進(jìn)行的細(xì)胞壁再生。用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的合適方法描述于EP238 023和Yelton等,1984,Proceedings of the National.Academy of SciencesUSA 811470-1474。Malardier等,1989,Gene 78147-156和WO 96/00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢屬的種的合適方法??捎肂ecker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.編的Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology,194,182-187,Academic Press,New York;Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153163;和Hinnen等,1978,Proceedings of theNational.Academy ofSciences USA 751920中所述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法,包括(a)培養(yǎng)菌株,其以野生型形式能產(chǎn)生多肽;和(b)回收該多肽。優(yōu)選地該菌株屬于曲霉屬,更加優(yōu)選地為米曲霉。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法,包括(a)在有利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞;和(b)回收該多肽。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中,用本領(lǐng)域中已知的方法在適于多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如,可在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?;虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞,這在合適的培養(yǎng)基中和使多肽能被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行。用本領(lǐng)域中已知的方法,在含有碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商得到或根據(jù)公開的組成(例如,于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,則可直接從培養(yǎng)基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌,則可從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收。
可使用本領(lǐng)域中已知的、對(duì)多肽特異的方法檢測(cè)所述多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如,如本文所述可使用酶測(cè)定法確定多肽的活性。
可以通過本領(lǐng)域已知的方法回收得到的多肽。例如,可以通過常規(guī)方法,包括,但不限于,離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀將多肽從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收出來。
本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域中已知的多種方法進(jìn)行純化,所述方法包括,但不限于,層析(例如,離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如,制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如,硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(見,例如,Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden編,VCH Publishers,New York,1989)。
組合物在又一方面,本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多肽的組合物。
所述組合物可含有本發(fā)明的多肽作為主要的酶組分,例如,單組分組合物。或者,組合物可包含多種酶活性,如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶。
組合物可按照本領(lǐng)域已知的方法制備,并且可以是液體或干組合物的形式。例如,所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。要包括在所述組合物中的多肽可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行穩(wěn)定。
下面給出本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選用途的例子。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可以在本領(lǐng)域已知的方法基礎(chǔ)之上確定。
生物膜(biofilm)生長(zhǎng)在生物膜中的微生物比生長(zhǎng)在傳統(tǒng)懸浮液培養(yǎng)物中的相同微生物不易受各種類型抗微生物劑影響。眾所周知饑餓的細(xì)菌對(duì)多種抗微生物刺激的敏感度低的多。例如,許多經(jīng)典的抗生素如青霉素,在緩慢或未分裂的細(xì)菌中作用微弱。溶菌酶由于攻擊并破壞肽聚糖層而不管細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)如何,所以保持有效。
生物膜控制;實(shí)例牙科器械水道(dental water line)在牙科器械水道(dental water line)中的生物膜積聚物可能包含由多種生物——舉少數(shù)幾例,銅綠假單胞菌(Psuedomonas aeroginosa),奇異變形菌(Proteus mirabilis)及某種軍團(tuán)菌(Leigonella sp.)——構(gòu)成的生物膜。還有可能由于系統(tǒng)的防回縮閥失靈而使通常出現(xiàn)在口腔中的物種得以移生。當(dāng)涉及免疫受損的患者時(shí),交叉感染的危險(xiǎn)當(dāng)然就更成為潛在的威脅,而當(dāng)今時(shí)代這一類的患者數(shù)目持續(xù)穩(wěn)定增加。需要對(duì)牙科器械水道中細(xì)菌生物膜積聚進(jìn)行有效控制。生物膜的綜述可見Watnick P和Kolter R.(2000)Biofilm,city of microbes.J Bacteriol.;182(10)2675-9。
一種商業(yè)喉片產(chǎn)品的典型實(shí)例是由BOEHRINGER INGELHEIMFRANCE生產(chǎn)的Lysopaine。
活性成分桿菌肽200U.I.
(至65iu/mg)木瓜蛋白酶2mg至30NK/mg溶菌酶鹽酸鹽5mg至26000UFIP/mg通過測(cè)量懸浮在緩沖液中的細(xì)胞裂解物的OD動(dòng)力學(xué)測(cè)定的單位。通過裂解物誘導(dǎo)的懸浮在緩沖液中的細(xì)菌培養(yǎng)物的混濁度變化測(cè)量單位測(cè)定。
非活性成分糖精賦形劑硬脂酸鎂賦形劑薄荷腦香味劑山梨醇賦形劑用于局限于口咽頰膜的點(diǎn)感染的局部治療。注意如果常規(guī)細(xì)菌感染的臨床指征明顯,考慮抗生素治療。
牙膏可以單獨(dú)或與其它酶甚至是抗微生物肽組合使用溶菌酶。其它酶的例子葡萄糖氧化酶,乳過氧化物酶。
包括溶菌酶的典型牙膏組合物是″BioteneLaclede,Inc.2030EastUniversity Drive,Rancho Domiguez,CA 90220,USA。
成分活性成分包含乳過氧化物酶(100gm)無活性成分葡萄糖氧化酶,溶菌酶,單氟磷酸鈉,山梨醇,甘油,焦磷酸鈣,水合二氧化硅,Zylitol,羧甲基纖維素,香料,苯甲酸鈉,β-d-葡萄糖,硫氰酸鉀。
去污劑組合物本發(fā)明的溶菌酶可以加入到并且因而成為去污劑組合物的組分,特別是在具有pH7或更低的液體去污劑中。
本發(fā)明的去污劑組合物可以配制成手工或機(jī)器洗衣去污劑組合物,其包括適于預(yù)處理污損織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加織物軟化劑組合物,也可配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的去污劑組合物配方,或用于手工工或機(jī)器洗碗操作的配方。
在具體的方面,本發(fā)明提供包含本發(fā)明溶菌酶的去污劑添加劑。所述去污劑添加劑以及去污劑組合物可以包含一種或多種其它酶,如蛋白酶、脂酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶,例如,漆酶,和/或過氧化物酶。
一般所述酶的特性應(yīng)當(dāng)與選定去污劑相容,(即最優(yōu)pH,與其它酶和非酶成分的相容性,等),并且所述酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。
DNA重組(改組(shuffling))SEQ ID NO1的核苷酸序列可以用于DNA重組(或改組)操作。以這種操作獲得的新多核苷酸序列可以編碼具有提高特性的溶菌酶活性的新多肽,如提高的穩(wěn)定性(貯存穩(wěn)定性,熱穩(wěn)定性),提高的特異性活性,提高的最優(yōu)pH,和/或提高的針對(duì)特異性化合物的耐受性。
在兩種或多種同源性輸入多核苷酸之間的改組(起始點(diǎn)多核苷酸)包括片段化多核苷酸和重組片段,以獲得輸出多核苷酸(即已經(jīng)進(jìn)行過改組循環(huán)的多核苷酸),其中許多核苷酸片段與輸入多核苷酸相比得以調(diào)換。
DNA重組或改組可以是(部分地)隨機(jī)過程,其中嵌合基因文庫由兩種或多種起始基因生成。可以使用多種已知的方案實(shí)施這種改組或重組過程。
該過程可以包括親本DNA的隨機(jī)片段化,隨后通過PCR重組裝成新的全長(zhǎng)基因,例如US5605793,US5811238,US5830721,US6117679所述的?;虻捏w外重組可以按照例如US6159687,W098/41623,US6159688,US5965408,US6153510所述來實(shí)施。重組過程可以在活體細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生,例如WO 97/07205和WO 98/28416所述。
親本DNA可以如Kikuchi等(2000a,Gene 236159-167)所述通過DNA酶I處理或通過限制性核酸內(nèi)切酶消化進(jìn)行片段化。如Kikuchi等(2000b,Gene 243133-137)所述改組兩個(gè)親本的單鏈親本DNA可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)親本的改組。
一種特定的改組方法是按照在Crameri等,1998,Nature,391288-291和Ness等,Nature Biotechnology 17893-896中所述的方法。另一種格式為在US6159687中所述的方法實(shí)施例1和實(shí)施例2。
通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述,所述實(shí)施例不應(yīng)被視為限制本實(shí)施例實(shí)施例1從朱紅栓菌中克隆GH25溶菌酶朱紅栓菌(=朱紅密孔菌)CBS114004,多孔菌科(Polyporaceae),多孔菌目(Polyporales),Agricomycetidae,擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes),擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。從板栗的死枝中分離該菌株,所述死枝由WenpingWu于2002年9月收集自中國北京懷柔縣。Wenping Wu于2002年10月11日將該菌株最后鑒定為朱紅栓菌。11月17日將該菌株保藏于真菌菌種保藏中心(Centraal Bureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,P.O.Box85167,3508AD Utrecht,The Netherlands),保藏號(hào)CBS 114004。
發(fā)酵和酶指紋分析將真菌菌株CBS114004在兩種培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵;FG4和MEX-1培養(yǎng)基于25攝氏度,160rpm,6天。通過標(biāo)準(zhǔn)酶指紋識(shí)別測(cè)定對(duì)培養(yǎng)液測(cè)試酶活性(培養(yǎng)液的酶指紋分析。
酶指紋分析通過在廣譜的酶測(cè)定法上測(cè)定培養(yǎng)物肉湯獲得酶活性曲線。制備帶有底物的96孔微量滴定(MT)板并保存于+10℃待用。準(zhǔn)備兩種不同的pH值pH3和pH7。使用下列底物0.05%AZCL(Mazurine帶染料和交聯(lián)底物,Megazyme)-直鏈淀粉、阿拉伯聚糖、β-葡聚糖(大麥)、酪蛋白、膠原、凝乳聚糖、葡聚糖、半乳聚糖(馬鈴薯),半乳甘露聚糖(角豆Carob),羥乙基纖維素,支鏈淀粉,木聚糖(燕麥),和木葡聚糖(AZCL-酪蛋白不能在pH3使用,所以從這些板中省去)。底物的制備pH3板0.1g的每種AZCL底物溶于100ml 0.2M琥珀酸pH3+10μl TritonX-100(0.01%),以得到最終濃度0.1%AZCL。pH7板0.1g的每種AZCL底物溶于50ml無菌H20加10μl TritonX-100(0.01%)。將50ml 0.4M MOPS pH7加入每種50ml AZCL底物中,以得到100ml的最終體積和0.2M緩沖液,0.1%AZCL的最終濃度。還包括漆酶和脂酶活性分析物,其制備如下漆酶35ml含0.08mg/ml Chicago Sky Blue的0.2M磷酸/硼酸鹽緩沖液,pH 9;脂酶將2%PVA溶液與豆油3∶1混合制備聚乙烯醇(PVA)/豆油乳狀液(emulation)。利用MLTRA-TURRAX乳化該油,并將12ml的乳化液與含10mM CaCl2pH 5.5的500ml 0.2M醋酸鈉緩沖液和5ml 0.2%結(jié)晶紫溶液混合。利用Multidrop S20Stacker,Titertek Instruments,Inc.,Alabama制備MT板,并使用US.Sterilin 96孔MT板。將200μl的每種AZCL底物和脂酶底物以及150μl的漆酶底物分裝至MT孔中并向每種底物中加入30-50μl培養(yǎng)液并于26攝氏度過夜孵育。在測(cè)定中取得的結(jié)果值如下0無活性,1弱活性,2強(qiáng)活性。在第6天收集菌絲體,此時(shí)樣品顯示許多不同的酶活性,并在-80度下保存待用于cDNA文庫構(gòu)建。
總RNA分離使用經(jīng)過修改的Fenozol總RNA提取法(Active Motif,Inc)。
材料來自Active motif的Fenozol,Cat.nr.2100無RNA酶的eppendorf管,吸頭無RNA酶的氯仿無RNA酶的異丙醇無RNA酶的96%和70%乙醇無RNA酶的3M醋酸鈉pH 5,2酚-氯仿混合物CIA(氯仿∶異戊醇,24∶1)將下列材料于250℃烘干12小時(shí)石英砂金屬勺研缽和研棒150ml玻璃燒杯150ml烘干玻璃燒杯中加20ml Fenozol。在液氮下于預(yù)冷的研缽和研棒中用烘干的石英砂研磨保藏的菌絲體(-80℃)。將研磨好的材料用勺轉(zhuǎn)移到燒杯中并迅速混合以便將冷凍的材料溶解形成濃懸浮液。將包含所述材料的燒杯轉(zhuǎn)移到50℃水浴中15分鐘。隨后將所述材料轉(zhuǎn)移到Oakridge管中并加入“無RNA酶”的氯仿。隨后劇烈渦旋混合樣品并隨后讓其在室溫中放置10分鐘。于12,000g,室溫將試管離心20分鐘并且隨后將上層相轉(zhuǎn)移到新的Oakridge管中。加入等體積的酚-氯仿混合物并且隨后將樣品劇烈渦旋混合樣品并隨后在相同條件下進(jìn)行離心。將樣品上層相轉(zhuǎn)移到新的試管中并加入等體積的CIA,并重復(fù)振蕩和離心步驟,但只離心10分鐘。將水相轉(zhuǎn)移到新的試管中并加入6.25ml異丙醇,混合并且隨后將所述材料于室溫孵育15分鐘。隨后將試管于12,000g,4℃離心30分鐘。小心去除上清液并小心加入18ml的70%乙醇。將試管于12,000g,4℃離心5分鐘并且隨后去除上清液并將沉淀進(jìn)行風(fēng)干。將RNA沉淀物重懸于500μl DEPC(二甲基焦碳酸酯)處理的水中。于65℃加熱10分鐘以幫助重懸。將總RNA保存于-80℃待進(jìn)一步使用。
聚腺苷酸富集的RNA產(chǎn)品使用來自Active Motif的mTrap Midi mRNA分離試劑盒(Active Motif,Europe)。按照生產(chǎn)商的說明書純化聚腺苷酸富集的RNA,同時(shí)作下列改變使用上述分離的總RNA懸浮液作為起始材料。向大約20μg總RNA中加入15ml無蛋白酶的裂解緩沖液。通過如方案中所述的柱層析洗脫mRNA級(jí)分并選擇呈現(xiàn)0.5kb以上的級(jí)分集合進(jìn)行cDNA合成。
cDNA文庫的生成使用Smart cDNA構(gòu)建試劑盒(K1051-1,BD Biosciences),同時(shí)作如下改動(dòng)在第二鏈cDNA合成步驟后,根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(AP Pharma)使用GFX離心柱層析純化所述材料并將所述材料洗脫于85μl的去離子水中。在Sfil消化后,根據(jù)下列方法用溴化乙錠凝膠純化對(duì)處理的cDNA進(jìn)行大小分級(jí)1)制備1xTBE(溶于高壓滅菌的LiChroSolv/HPLC水)緩沖液中0.8%的SeaPlaque LMP瓊脂糖凝膠,膠和緩沖液中都加溴化乙錠。向來自步驟D的100μl Sfil消化液加入加樣緩沖液,在干凈的電泳槽中15V下將樣品與加于樣品兩側(cè)的DNA分子量標(biāo)記一起電泳過夜。
2)在UV盒和長(zhǎng)波UV(360nm)下,顯影cDNA和DNA分子量標(biāo)記。用解剖刀移除全部在500bp以下的凝膠并移除樣品孔的上部。將剩余的凝膠滑到槽下并在樣品孔上面倒入1.5%Seaplaque溴化乙錠瓊脂糖凝膠。
3)反接電泳裝置的電極并使DNA跑入1.5%瓊脂糖凝膠中一小段距離。
4)在長(zhǎng)波UV下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)凝膠切割和凝膠片段的GFX純化。
根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用T4DNA連接酶(New England Biolabs,Inc)在標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)中將樣品連接入載體pMHas5中。在專利申請(qǐng)W02003044049中描述了pMhas5質(zhì)粒和在該質(zhì)粒中產(chǎn)生的真菌cDNA文庫的使用。使用相同的方法鑒定如W02003044049中所述來自SigA4轉(zhuǎn)座子的栓菌(Trametes)GH25溶菌酶。在最初的BLAST命中中,序列SEQ ID1被鑒定為與GENESEQPAAW85696魯?shù)劓溍咕?Strptomycesrutgersensis)糖基水解酶GH 25和真菌序列SWISSPROTP00721Chalaropsis sp.GH 25肽序列以及許多其它來自基因組測(cè)序產(chǎn)物的較少注解的鏈霉菌開放閱讀框(天蘭色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor),Q9FBR0)都有高度的相似性(見同源性矩陣表1)?;诖诵畔?,決定在米曲霉中表達(dá)栓菌GH 25候選物。
表1.
在公共數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的高分GH25水解酶的同源性表
AAW85696,魯?shù)劓溍咕?;Q9FBR0,天蘭色鏈霉菌;NP001276本發(fā)明的GH25;Chalaropsis(SWISSPROTP00721)實(shí)施例2來自栓菌的本發(fā)明的GH25酶的表達(dá)使用序列號(hào)1設(shè)計(jì)自定義的寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)以生成編碼本發(fā)明插入片段,其側(cè)翼為有利于克隆入表達(dá)載體的限制性酶位點(diǎn)。
引物引物1(Seq ID No 3),NP1276EcoRI5′-GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′引物2,(Seq ID No 4),NP1276NotI5′ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′下劃線部分為加到引物上的額外DNA序列以引入用于克隆的限制性酶位點(diǎn)。
以下列方式由以上cDNA文庫(見上面實(shí)施例1)擴(kuò)增GH25溶菌酶編碼序列使用1微升的cDNA(大約10納克的DNA)作為模板與兩種引物NP1276EcoRI和NP1276NotI一起進(jìn)行PCR反應(yīng)。
NP1276EcoRI5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′(SEQ IDNO3)NP1276NotI5′ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′(SEQ IDNO4)在100μl反應(yīng)體積中每種引物使用10pmol。在廠商推薦的條件下使用ProofStart聚合酶(Qiagen GMBH)。在初始的于94攝氏度熱處理10分鐘后的條件如下變性溫度;94攝氏度-30秒,退火溫度;55攝氏度-30秒,和在72攝氏度下延伸1分鐘??偣策\(yùn)行35個(gè)循環(huán)。
在1%瓊脂糖凝膠上分離PCR反應(yīng)物等份。在預(yù)測(cè)的820堿基對(duì)處看到單一的明顯條帶。通過GFX離心層析柱(AB Phama)從凝膠中分離片段并用剪切由PCR引物引入的凸出部分的EcoRI和NotI進(jìn)行消化。分離消化的片段并克隆入pXYG1051,一種基于質(zhì)粒pMStr46的曲霉屬表達(dá)質(zhì)粒(見國際專利申請(qǐng)W02003070956的實(shí)施例)。具體地,通過HindⅢ消化和重連接(relegation)去除AMA自主復(fù)制區(qū),形成完整的載體。在標(biāo)準(zhǔn)的連接,轉(zhuǎn)化入DH10B大腸桿菌后,鑒定在LB板上氨芐青霉素選擇下生長(zhǎng)的菌落。選擇10個(gè)菌落以便制備質(zhì)粒DNA。利用專利申請(qǐng)W02003070956中披露的pXYG1051的載體引物對(duì)得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。選擇其中一個(gè)沒有PCR錯(cuò)誤的克隆(NP001276-4)用于Qiagen小量質(zhì)粒制備(Qiagen GMBH)。
利用選擇的克隆(NP001276-4)在曲霉菌中表達(dá)所述酶(見下面)并且將包含本發(fā)明基因的EcoRI-NotI插入片段用于將所述片段亞克隆入標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌載體,pBlueScript KS+(StratageneInc.),并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH10B(來自Clontech)。此菌株于2003年12月8日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig,Germany),保藏號(hào)DSM16084。
在曲霉菌中表達(dá)克隆NP001276將cDNA克隆NP001276-4轉(zhuǎn)化入米曲霉菌株Jal355(在國際專利申請(qǐng)W02003070956中公開)。于蔗糖作為碳源的Cove硝酸鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上在選擇性和非誘導(dǎo)性條件下將30個(gè)轉(zhuǎn)化子重分離兩次。為了檢測(cè)NP1276的表達(dá),將轉(zhuǎn)化子在30攝氏度下于具有10ml YPM(2%蛋白胨,1%酵母提取物,2%麥芽糖)的試管中生長(zhǎng)4天。如生產(chǎn)商所推薦地將上清液在NuPage10%Bis-Tris SDS凝膠(Invitrogen)上電泳。當(dāng)用麥芽糖誘導(dǎo)Plectasin的表達(dá)時(shí)曲霉菌生長(zhǎng)良好。在大多數(shù)轉(zhuǎn)化子中見到GH 25溶菌酶的預(yù)期大小的明顯條帶(23kDa),而在未轉(zhuǎn)化的宿主菌株米曲霉BECh2中未見到此帶。選擇強(qiáng)表達(dá)的單一曲霉菌轉(zhuǎn)化子(EXP00787)進(jìn)行繼續(xù)研究。用具有三塊隔板的20×1000ml Erlingmeyer搖瓶進(jìn)行大規(guī)模搖瓶實(shí)驗(yàn)。每只瓶包含100毫升FG4P培養(yǎng)基(FG4P3%豆粕(SFK 102-2458),1.5%麥芽糊精(Roquette),0.5%Pep-tone bacto(Difco 0118),1.5%KH2PO4(Merck 4873),0.2ml/升Pluronic PE 6100(BASF))。所用條件30攝氏度,150RPM,生長(zhǎng)3天。通過濾過兩層微孔布miracloth收集培養(yǎng)液并進(jìn)行冷凍待用。
實(shí)施例3.
本發(fā)明的GH25酶的純化純化的描述將1.7升的發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)菌過濾并在SP-sepharose柱上利用50mM NaAcpH5/50mM NaAc,1M NaCI pH5進(jìn)行純化。將收集的級(jí)分在Amicon槽(Millipore)上以10kDa截留分子量進(jìn)行濃縮。N末端氨基酸序列(EKRANPKGID)確證了純化的蛋白質(zhì)是成熟的GH25酶。
實(shí)施例4.
通過細(xì)胞壁測(cè)定法檢測(cè)溶菌酶活性將凍干的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma)用作底物。將底物懸浮于適當(dāng)pH的Britton & Robinson緩沖液中(0.08M磷酸,0.08M硼酸和0.08M醋酸;用1M NaOH調(diào)節(jié)pH至2-12)至最終濃度為0.3mg/ml。向96孔微量滴定板中的每個(gè)孔加入100μl底物懸浮液和30μl濃度為大約1mg/ml的酶溶液。加入酶之后5分鐘在酶標(biāo)儀中于450nm上測(cè)量濁度的變化。計(jì)算曲線的斜率并用作酶活性的相對(duì)度量。
溫度曲線將純化的酶于40、50、60和70℃溫育15min。將樣品冷卻至室溫并用上述測(cè)定法中測(cè)量pH 5處的相對(duì)殘留活性。所述酶在高達(dá)50℃都是穩(wěn)定的。
表2.
pH曲線制備pH 4,5,6,7和8的底物懸浮液,并如上述測(cè)量酶的相對(duì)活性。所述酶在pH5上具有最優(yōu)pH。
表3.
生物材料的保藏按布達(dá)佩斯條約要求將下列生物材料保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-38124Braunschweig,Germany),并給予下列編號(hào)保藏物 編號(hào)保藏日大腸桿菌DH10BDSM160842003-12-05按布達(dá)佩斯條約要求將下列生物材料保藏于真菌菌種保藏中心(CentralBureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,P.O.Box 85167,3508ADUtrecht,the Netherlands),并給予下列編號(hào)保藏物 編號(hào)保藏日朱紅栓菌 CBS114004 2003-11-17
僅用于國際局
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>真菌細(xì)胞壁降解酶<130>10515.000-DK<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>945<212>DNA<213>朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)<400>1ggccattacg gccgggggtg cacagacgtc ggtgtccgag cacatcctat ctcactcaag 60cttagaccac cttgggctac gacatgaagc tctctaccac agctctgctt gctattgcgg120tggcagtggc ctctgcttct cccactcccg agaagcgtgc caaccccaag ggcattgacg180tctcggctta ccaacccaac atcaactgga gcaccgtcaa agccaacggg atctcgttcg240catatatcaa ggcaaccgag ggtaccacgt ataccaaccc agacttctcg agccagtata300caggcgcgac taatgctgga ctcattcggg gcggctacca cttcgcccat cccgactcct360cttcaggcgc gactcaagcc aagtacttcc tggcccacgg aggtggatgg acaagcgacg420gaatcacact tccaggcgct ctcgacatcg agtataaccc tagcggggcg gagtgttatg480gcttaagcgc gtcggcgatg gtttcgtgga tcaaagactt ctccaatacc taccactcgt540cgaccggagt ttaccctgtt atttacacca ccacggactg gtggacgaca tgcacgggca600acagtgccgc gtttgcttcg acgaaccctc tatggattgc ccgctatgca tcaagcatcg660gcaccctgcc cgcaggttgg agttatacaa cgttctggca atatgctgac tcgggcccga720accctggtga ccaggatgag ttcaatggct cgatggcagg actgaagcag cttgcgctcg780ggtgaagtgg gatgtgaggt cgccggagaa gaagcagagt ccaccggcag cagtatccgt840cgtgtacatc atggtgtcat accatccgaa gacgatactc gagtcgtacg gacaattcgc900agcttcgtaa ctttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa945<210>2<211>233<212>PRT<213>朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)<400>2Mct Lys Lcu Ser Thr Thr Ala Leu Lcu Ala Ilc Ala Val Ala Val Ala
1 5 10 15Ser Ala Scr Pro Thr Pro Glu Lys Arg Ala Asn Pro Lys Gly Ile Asp20 25 30Val Ser Ala Tyr Gln Pro Asn Ile Asn Trp Ser Thr Val Lys Ala Asn35 40 45Gly Ile Ser Phc Ala Tyr Ile Lys Ala Thr Glu Gly Thr Thr Tyr Thr50 55 60Asn Pro Asp Phe Scr Ser Gln Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Gly Lcu65 70 75 80Ilc Arg Gly Gly Tyr His Phc Ala His Pro Asp Ser Ser Scr Gly Ala85 90 95Thr Gln Ala Lys Tyr Phe Lcu Ala His Gly Gly Gly Trp Thr Scr Asp100 105 110Gly Ile Thr Lcu Pro Gly Ala Lcu Asp Ilc Glu Tyr Asn Pro Scr Gly115 120 125Ala Glu Cys Tyr Gly Leu Ser Ala Ser Ala Met Val Ser Trp Ile Lys130 135 140Asp Phe Scr Asn Thr Tyr His Ser Scr Thr Gly Val Tyr Pro Val Ile145 150 155 160Tyr Thr Thr Thr Asp Trp Trp Thr Thr Cys Thr Gly Asn Ser Ala Ala165 170 175Phc Ala Scr Thr Asn Pro Lcu Trp Ilc Ala Arg Tyr Ala Ser Ser Ile180 185 190Gly Thr Leu Pro Ala Gly Trp Scr Tyr Thr Thr Phc Trp Gln Tyr Ala195 200 205Asp Ser Gly Pro Asn Pro Gly Asp Gln Asp Glu Phc Asn Gly Scr Met210 215 220Ala Gly Leu Lys Gln Lcu Ala Lcu Gly225 230<210>3<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對(duì)于Seq ID no1的具有添加的EcoR1位點(diǎn)的上游PCR引物<400>3gcggaattca acatgaagct ctctaccaca gctc 34<210>4<211>36
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對(duì)于Seq ID no1的具有添加的Not1位點(diǎn)的下游PCR引物<400>4atatgcggcc gcaaagttac gaagctgcga attgtc 3權(quán)利要求
1.具有溶菌酶活性并屬于GH25家族的真菌多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽,其選自(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽;(b)包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質(zhì)粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分所編碼的多肽具有至少80%同一性;(c)由核苷酸序列編碼的多肽,所述核苷酸序列在高度嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交;或(d)具有溶菌酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽,其包含氨基酸序列,該氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸1-233具有至少85%同一性,具體是至少90%同一性,更加具體是至少95%同一性,或至少99%同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽,其包含SEQ ID NO2的氨基酸1-233。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4的多肽,其由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽,其由核苷酸序列編碼,所述核苷酸序列在極高度嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交。
7.具有編碼在權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中定義的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
8.核酸構(gòu)建體,其包含權(quán)利要求7中定義的核苷酸序列,所述核苷酸序列可操作性地連接到引導(dǎo)所述多肽在合適宿主中生產(chǎn)的一種或多種控制序列上。
9.重組表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。
10.重組宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。
11.生產(chǎn)如在權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中定義的多肽的方法,包括(a)培養(yǎng)菌株從而生產(chǎn)所述多肽,所述菌株的野生型形式能夠生產(chǎn)所述多肽;和(b)回收所述多肽。
12.生產(chǎn)如在權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中定義的多肽的方法,包括(a)在有益于生產(chǎn)所述多肽的條件下,培養(yǎng)如在權(quán)利要求10中所定義的重組宿主細(xì)胞;和(b)回收所述多肽。
13.具有核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸84-782具有至少85%的同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的多核苷酸,其與SEQ ID NO1的核苷酸84-782具有至少90%的同一性,具體是至少95%的同一性,更加具體是至少99%的同一性。
15.包含SEQ ID NO1的多核苷酸。
16.由SEQ ID NO1組成的多核苷酸。
17.具有核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質(zhì)粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分具有至少85%同一性。
18.具有編碼具有溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸,并且所述核苷酸序列在高度嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交。
19.具有經(jīng)修飾的核苷酸序列的多核苷酸,所述經(jīng)修飾的核苷酸序列在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)修飾,并且其中所述經(jīng)修飾的核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成的多肽。
20.改組DNA的方法,其包括使用在權(quán)利要求7和13-19的任一項(xiàng)所定義的多核苷酸。
21.編碼具有溶菌酶活性的多肽的多核苷酸,其可以通過權(quán)利要求20的方法獲得。
22.具有溶菌酶活性的多肽,其由權(quán)利要求21的多核苷酸所編碼。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽作為生物膜形成抑制劑的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽在牙用組合物中的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽在去污劑組合物中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
分離了一種具有溶菌酶活性的新的真菌酶。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有溶菌酶活性并屬于GH25家族的真菌多肽,其中所述酶選自(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽;(b)包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質(zhì)粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分所編碼的多肽具有至少80%同一性;(c)由核苷酸序列編碼的多肽,所述核苷酸序列在高度嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸探針雜交;或(d)具有溶菌酶活性的(a),(b)或(c)的片段。
文檔編號(hào)C11D3/386GK1922314SQ200580006100
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者吳文平, 柯克·M·施努爾 申請(qǐng)人:諾維信公司
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