表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物生物質(zhì)的聯(lián)合預(yù)處理和水解的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的基因工程植物進(jìn)行聯(lián)合預(yù)處理和水解的方法。對用于制備轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)盒和載體進(jìn)行了描述。還提供了利用本發(fā)明的表達(dá)盒和載體來表達(dá)一種或多種細(xì)胞壁降解酶的基因工程改造的植物。【專利說明】表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物生物質(zhì)的聯(lián)合預(yù)處理和水解[0001]本申請要求2011年3月7日提交的美國臨時申請N0.61/449,769的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請?jiān)诖艘匀脑姆绞郊{入本文。[0002]以電子方式與本申請?zhí)峤坏男蛄斜硪浴靶蛄斜怼睘槲募?，?chuàng)建于2012年3月7日，文件大小為620，037字節(jié)，在此以全文援引的方式納入本文?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本發(fā)明涉及從表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物中生產(chǎn)可溶性糖的方法，以及轉(zhuǎn)基因植物、表達(dá)載體，核酸以及細(xì)胞壁降解蛋白?！?br>背景技術(shù)：
】[0004]木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一種引人注目的用于生產(chǎn)生物燃料、化學(xué)物質(zhì)和生物產(chǎn)品的原料。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可提供許多優(yōu)勢，包括豐富的可用性、潛在的低成本、可持續(xù)性，以及一般不作為人類的食物來源被消耗(LangeveldJffAetal.2010CropSci50:S131-S151)。為了將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)換成可再生能源和生化藥劑，生物處理將一部分木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成單糖，然后轉(zhuǎn)化為生物燃料或其他生物產(chǎn)品。[0005]由于生物質(zhì)預(yù)處理和酶水解的成本，通過生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)糖的成本是昂貴的(AlviraPetal.2010BioresourTechnollOl:4851；AbramsonMetal.2010PlantSciencel78:61；DanielKlein-Marcuschameretal.Biotechnol.Bioeng.2012；109:1083)。酶水解不容易降解植物細(xì)胞壁，因?yàn)榧?xì)胞壁多糖的生物異質(zhì)性、化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征使它們難以被水解酶水解(ZhuLetal.2008BioresourTechnol99:3817)。出于這個原因，酶水解需要能夠使植物細(xì)胞壁容易水解的預(yù)處理。在工業(yè)上比較普遍的預(yù)處理技術(shù)，通常使用苛刻的條件，如高溫和極端的pH值條件(WymanCEetal.2005BioresourTechnol96:1959；MosierNetal.2005BioresourTechnol96:673)。這些條件會引起糖降解并且導(dǎo)致產(chǎn)糖量減少，以及形成有毒的發(fā)酵化合物，需要昂貴的額外步驟以及昂貴的前期資本設(shè)備來進(jìn)行解毒、分離和中和。[0006]預(yù)處理成本、外源酶用量的高成本、緩慢的水解速率、酶的有限供應(yīng)也會影響到涉及木質(zhì)纖維素生物質(zhì)工藝的商業(yè)化。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]一方面，本發(fā)明涉及一種從基因工程植物材料(engineeredplantmaterial)中生產(chǎn)可溶性糖的方法。該方法包括通過將基因工程植物材料與制漿制劑(pulpingformulation)混合形成混合物以進(jìn)行預(yù)處理。所述基因工程植物材料包括編碼第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白選自由木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶和內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶所組成的組中。所述方法還包括提供水解條件。[0008]一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程植物。所述基因工程植物包括編碼與第一參考序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一參考序列選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所組成的組中。[0009]一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒。所述表達(dá)盒包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第一參考序列的核酸雜交的第一多核苷酸序列，所述第一參考序列選自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38和SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。所述表達(dá)盒還包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第二參考序列的核酸雜交的第二多核苷酸序列，所述第二參考序列選自由SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39、SEQIDNO:40,SEQIDNO:4USEQIDNO:42和SEQID:43所組成的組中。被選定為第一參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。[0010]一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒。所述表達(dá)盒包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交的多核苷酸序列，所述參考序列選自由含有SEQIDNO:52,SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61和SEQIDNO:62的序列所組成的組中。[0011]一方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體。所述表達(dá)載體包括能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有選自由SEQIDNO:68,SEQIDNO:69,SEQIDNO:70,SEQIDNO:7USEQIDNO:72、SEQIDNO:73,SEQIDNO:74、SEQIDNO:75,SEQIDNO:76,SEQIDNO:77,SEQIDNO:78、SEQIDNO:79,SEQIDNO:80,SEQIDNO:8USEQIDNO:82和SEQIDNO:83所組成的組中的序列的核酸雜交的多核苷酸序列?！緦＠綀D】【附圖說明】[0012]結(jié)合附圖閱讀將會更好地理解以下對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明。出于圖解本發(fā)明的目的，圖中顯示的是目前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不局限于顯示出的具體設(shè)置和方法。在附圖中:[0013]圖1是顯示表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物生物質(zhì)的聯(lián)合預(yù)處理和水解步驟的流程圖。[0014]圖2A-2B顯不了使用#5復(fù)合酶(enzymecocktail)(FCt;灰色(每3個一組的柱形圖的中間))或缺乏木聚糖酶A的#5復(fù)合酶(Ct-Xyn;斜條紋(右))或者不經(jīng)酶(NCt；白色(左))水解后，來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(transgenicplant)(XynA.2015.05)和缺乏木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?XynB.2063.17)的葡萄糖(圖2A)和木糖(圖2B)的產(chǎn)量。[0015]圖3A-3B顯示使用#1復(fù)合酶(FCt;灰色(每3個一組的柱形圖的中間))或缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn;斜條紋(右))，或者不經(jīng)酶(NCt;白色(左))水解后，來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶B(XynB.2063.17)的轉(zhuǎn)基因植物和預(yù)處理的野生型對照植物(AxB)的葡萄糖(圖3A)和木糖(圖3B)的產(chǎn)量。[0016]圖4顯示了對預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行#1復(fù)合酶(FCt;灰色(中間))或缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-EG(右))，或者不經(jīng)酶(NCt；白(左))水解后的葡萄糖產(chǎn)量。圖4A顯示了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.02和EGA.2049.10)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.12)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。圖4B顯示了從表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(EGB2042.03)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.2004.8.02)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。[0017]圖5A-?顯示了表達(dá)多種蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的水解結(jié)果。圖5A和圖5C表示使用#1復(fù)合酶處理的從測試轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏挟a(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量，圖5B和圖表示使用#1復(fù)合酶處理的從測試轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏挟a(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。圖5A和圖5B顯示的結(jié)果:經(jīng)過全復(fù)合酶處理(FCt;深灰色(中間))、缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶處理(FCt-Xyn;條紋柱(右)以及不經(jīng)酶(NCt;白色柱(左))的處理的I)雙重疊表達(dá)木聚糖酶A(XynA)和輔酶(Acc)的轉(zhuǎn)基因植物XynA/AccA/B.2096.05和XynA/AccA/B.2096.01；2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.2004.8.02。圖5C和圖顯示的結(jié)果:經(jīng)過全復(fù)合酶處理(FCt;深灰色(每組樣品中四個的最左邊))、缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-Xyn;斜條紋(左二))，缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-EG;白色(左三))，以及缺乏木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶的全復(fù)合酶處理(Ct-Xyn-EG;網(wǎng)格線(左四))的I)表達(dá)XynA和EGA的轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09；2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000.12。[0018]圖6A-6B分別顯示從預(yù)處理的野生型對照植物AxB和表達(dá)三重疊加(triplestacked)蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.56，XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的秸桿中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。產(chǎn)量的衡量是根據(jù)使用Acceleraseli1500/XY復(fù)合酶(FCt;黑色柱(右))進(jìn)行酶水解，并與缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt;灰色(左))對比進(jìn)行的。[0019]圖7A-7B分別顯示的是轉(zhuǎn)基因植物的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。圖7A顯示的是經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn;斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt;白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因柳枝稷(XynA.pv2015.3c>XynA.pv2015.4c)和預(yù)處理的野生型柳枝稷(Alamo白楊)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量。圖7B顯示了經(jīng)過#1復(fù)合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn；斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt;白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的第一代轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.05.T0),表達(dá)木聚糖酶A的第二代轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.05.Tl)以及預(yù)處理的缺乏木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(TGC.4000.11)中產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量的結(jié)果。[0020]圖8A-8B分別顯示了經(jīng)過#I復(fù)合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn;斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt;白色(左))的酶水解后，從兩種預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物(XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c)和對照非轉(zhuǎn)基因柳枝稷植物(Alamo)中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。[0021]圖9A-9B分別顯示了經(jīng)過#I復(fù)合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1復(fù)合酶(Ct-Xyn;斜條紋(右))和缺乏復(fù)合酶的對照處理(NCt;白色(左))的酶水解后，從預(yù)處理的表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶ACiXynA)的轉(zhuǎn)基因植物(iXynA.2229.110)和預(yù)處理的野生型對照植物(AxB)中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。[0022]圖10闡明了使用#1復(fù)合酶對預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(XynA.2015.5T1;實(shí)心三角)和預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17;實(shí)心圓圈)與對比的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.2004.8.02;空心方框)進(jìn)行酶水解產(chǎn)生葡萄糖產(chǎn)量的時間進(jìn)程。[0023]圖11闡明了使用#1復(fù)合酶(EGA.2049.10.FCt、實(shí)心方框;TGC.4000.11.FCt、空心菱形)和缺乏內(nèi)切葡聚糖酶的#1復(fù)合酶(EGA.2049.10.Ct_EG、實(shí)心三角；TGC.4000.11.Ct-EG,空心圓圈)對預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.10)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ?TGC.4000.11)進(jìn)行酶水解產(chǎn)出葡萄糖產(chǎn)量的時間進(jìn)程。[0024]圖12A-12B闡明了經(jīng)過全復(fù)合酶(EGA/XynA.2242.09.FCt,實(shí)心方塊；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)處理，與使用缺乏內(nèi)切葡萄糖酶的全復(fù)合酶(圖12A中EGA/XynA.2242.09.Ct_EG、實(shí)心圓圈；TGC.4000.11;Ct_EG，空心圓圈)和使用缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶(EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn、實(shí)心圓圈；TGC.4000.11;Ct_Xyn，空心圓圈)處理相t匕，預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2242.09)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)的酶水解產(chǎn)出葡萄糖產(chǎn)量的時間進(jìn)程。[0025]圖13A-13B闡明了經(jīng)過全復(fù)合酶(XynA/AccB.2092.103.FCt,實(shí)心方塊；TGC.4000.11.FCt,空心菱形)與缺乏木聚糖酶的全復(fù)合酶(XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn,實(shí)心三角；TGC.4000.11.Ct-Xyn、空心圓圈)進(jìn)行酶水解后，分別來自預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/AccB.2092.103)和預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)的葡萄糖和木糖產(chǎn)量的時間進(jìn)程。[0026]圖14闡明了對預(yù)處理的以下表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行酶水解，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)和缺乏酶的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?TGC.4000.11)對比得到葡萄糖的產(chǎn)量，所述表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括:表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.17)，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(EGA.2049.10)，表達(dá)木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/Acc.B.2092.103)，表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2242.09)，表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(iXynA.2229.110)。進(jìn)行預(yù)處理的溫度為65°C(PT_65)和75°C(ΡΤ_75)。酶用量包括每克生物質(zhì)0.2毫升AccelIerase"1500或0.1毫升Accellerase'XY以及0.05μM的β-葡糖苷酶(BGL)。每個ΡΤ_65和ΡΤ_75預(yù)處理的上面的條形設(shè)定為目前轉(zhuǎn)基因和對照植物的數(shù)據(jù)，從左到右依次是AxB；TGC.4000.11；XynA.2015.05T1；XynB.2063.17；XynA/AccB.2092.103；iXynA.2229.110；EGA.2049.10;和XynA/EGA.2242.09。[0027]圖15顯示了使用#5復(fù)合酶對預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因柳枝稷(EGC.2253.4b，實(shí)心圓圈)和野生型柳枝稷(Alamo、空心方框)進(jìn)行酶水解產(chǎn)出的葡萄糖的產(chǎn)量。預(yù)處理溫度為:65°C、75。。和95。。。[0028]圖16A-16B顯示了預(yù)處理溫度和時間對從酶水解的預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物(EGA/XynA.2342.105;黑條(右))和預(yù)處理的對照植物(TGC.2342.01;灰條(左))中產(chǎn)出的葡萄糖(圖16)和木糖(圖16B)產(chǎn)量的影響。[0029]圖17A-17B顯示了預(yù)處理溫度對從預(yù)處理的表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A和木聚糖酶A的轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09.01和EGA/XynA.2242.09.07，以及對照植物:野生型AxB和轉(zhuǎn)基因TGC.4000.11中產(chǎn)出的葡萄糖(圖17A)和木糖(圖17B)產(chǎn)量的影響。[0030]圖18顯示了使用減少的酶用量:#1全復(fù)合酶(FCt)，75%的#1全復(fù)合酶(0.75FCt)，50%的#1全復(fù)合酶(0.50FCt)，25%的#1全復(fù)合酶(0.25FCt),10%的#1全復(fù)合酶(0.1OFCt)和無酶(OFCt)進(jìn)行水解后，減少外源酶用量對從預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物XynA.2015.05T1(實(shí)心圓圈)，XynB.2063.17(實(shí)心三角)和對照植物TGC.2004.8.04(實(shí)心方塊)中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量的影響。[0031]圖19顯示了減少外源酶用量對從轉(zhuǎn)基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04,XynE/EGC/CBHA.2339.05和對照植物BxA中產(chǎn)出的葡萄糖產(chǎn)量的影響。預(yù)處理使用0.17M亞硫酸氫銨和碳酸銨(pH8.1)，在75°C、液固比為10條件下進(jìn)行16小時。在大約2%固含量，沒有酶(NCt;白色(左))，20%全復(fù)合酶(0.2FCt;灰色(中間))和全復(fù)合酶，加入量為0.2毫升/0.1毫升的每克稻桿(0.2ml/0.1mlofpergramstover),50°C和pH值5.0的條件下進(jìn)行為期三天的酶水解。[0032]圖20A-20B分別顯示了經(jīng)過全用量的復(fù)合酶Accelerase-1500/XY(FCt;黑色(右))、20%用量的復(fù)合酶(0.2FCt;灰色(圖20A中和圖20B右))以及無酶(NCt；白色(圖20A左))的酶水解后，預(yù)處理的表達(dá)木聚糖酶A和內(nèi)切葡聚糖酶的植物(XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA2309.107)與預(yù)處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参飳Ρ鹊钠咸烟呛湍咎堑漠a(chǎn)量。[0033]圖21A-21B顯不了經(jīng)過每克稻桿加入0.2毫升Accellerase*1500和0.1毫升Accellerase'XY的全復(fù)合酶(FCt),80%的全復(fù)合酶；每克稻桿加入0.16毫升Accellerase?1500和0.08毫升Accellerase?XY(0.8FCt),60%的全復(fù)合酶；每克稻桿加入0.12毫升Accellerasex1500和0.06毫升AccelIerase丨(XY(0.6FCt),40%的全復(fù)合酶；加入每克稻桿0.08毫升Accellerase?1500和0.04毫升Aceellerase⑧XY(0.4FCt),20%的全復(fù)合酶；每克稻桿加入0.04毫升AccelIerase1500和0.02毫升Acce丨丨eraseκ:XY(0.2FCt)以及無酶(OFCt)的情況下進(jìn)行酶水解后，減少的外源酶用量對從轉(zhuǎn)基因植物EGA/XynA.2242.09.16，CBHA.2069.01.03和對照植物TGC.4000.11中產(chǎn)出的葡萄糖(圖21A)和木糖(圖21B)產(chǎn)量的影響。[0034]圖22顯不了使用I)復(fù)合酶Accellerase*1500和Acce丨丨eraseφ:XY;和2)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09以及對比的對照植物的同步糖化和發(fā)酵(SSF)得到的乙醇產(chǎn)量。[0035]圖23顯示了基于表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2069.3.17;白色)和野生型對照植物(AxB;灰色)的重量損失的生物質(zhì)增溶。[0036]圖24A-24B顯示了從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB;圖24A)和表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2063.3.17;圖24B)中產(chǎn)出乙酸(HAc)的產(chǎn)量。處理在75°C下進(jìn)行16小時(白色(左))、85°C下進(jìn)行7小時(條紋(中間))和95°C下進(jìn)行(網(wǎng)格(右))[0037]圖25A-25B顯示了從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB;圖25A)和表達(dá)外切葡聚糖酶CBHA的轉(zhuǎn)基因植物(CBHA.2063.3.17)產(chǎn)出糖降解產(chǎn)物羥甲基糠醛(HMF)和糠醛的產(chǎn)量。處理方式用白色、條紋或網(wǎng)格表示，從左至右依次是:白色，HMF_75°C處理16小時；條紋，HMF_85°C處理7小時；網(wǎng)格，HMF_95°C處理16小時；條紋，糠醛_95°C處理16小時)。[0038]圖26顯示了經(jīng)過0.17M亞硫酸氫銨和碳酸銨(BSC；pH8.1)預(yù)處理并自動水解后，從僅表達(dá)木聚糖酶B的轉(zhuǎn)基因植物(XynB.2063.15)、表達(dá)木聚糖酶A和兩種輔助酶A和B的轉(zhuǎn)基因植物(XynA/AccA/B.2096.1)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?WTAxB)中產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。將木糖作為單糖(黑色(右))和將木糖作為寡糖(灰色(左))來評估木糖的產(chǎn)量。[0039]圖27顯示了經(jīng)過0.17M亞硫酸氫銨和0.165M碳酸銨(BSC；pH8.1)預(yù)處理并自動水解后，從兩種表達(dá)木聚糖酶B、內(nèi)切葡聚糖酶和CBHB(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55)的轉(zhuǎn)基因植物，表達(dá)木聚糖酶B、內(nèi)切葡聚糖酶和CBHA(XynB/EGA/CBHA.2345.116)的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?AxB)產(chǎn)出的木糖產(chǎn)量。[0040]圖28A-28B分別顯示從使用AccelleraselY預(yù)處理的轉(zhuǎn)基因植物(同時表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶A的EGA/XynA.2242.09T1(實(shí)心圓圈)，以及轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参颰GC.4000(實(shí)心方塊))中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖產(chǎn)量。[0041]圖28C-28D分別表示從都同時表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶A、木聚糖酶B和外切纖維素酶B(cellobihydrolaseB)的XynB/EGA/CBHB.2349.55(空心圓圈)，XynB/EGA/CBHB.2349.229(實(shí)心正三角)和XynB/EGA/CBHB.2349.56(實(shí)心倒三角)，以及表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶A的iXynA.2329.14和野生型對照植物AxB中產(chǎn)出的葡萄糖和木糖的產(chǎn)量。【具體實(shí)施方式】[0042]在以下的說明中某些術(shù)語的使用只是為了方便而不是限制。單詞“右”、“左”、“頂”和“底”在所提及的附圖中用于指代方向。用于權(quán)利要求書和說明書相應(yīng)部分中的單詞“一個”和“一種”，除特別聲明外，定義為包括一個或多個引用項(xiàng)。這個術(shù)語包括以上特別提到的單詞，及其衍生詞，以及相似的單詞。短語“至少一個”意思為兩個或兩個以上的項(xiàng)目的列表，如“A，B或C”，意思是A、B或C的任何一個及它們的任何組合。[0043]本文的實(shí)施方式提供了在植物中表達(dá)一系列的細(xì)胞壁降解(CWD)蛋白的技術(shù)。CWD蛋白可以是CWD酶或CWD酶的修飾形式。修飾形式可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。植物可以是玉米、高粱、柳枝稷或其他植物。本文的實(shí)施方式提供了獲得含有植物CWD蛋白的生物質(zhì)，以在糖生產(chǎn)中用作原料。植物酶表達(dá)使用植物作為一個“工廠”，而不是微生物發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)CWD酶。這種方法的優(yōu)勢在于將生物質(zhì)原料中的蛋白直接用于可發(fā)酵糖生產(chǎn)中。有水解特性的轉(zhuǎn)基因植物生物質(zhì)可以不需要嚴(yán)格的預(yù)處理來提高細(xì)胞壁纖維素與外源酶的可結(jié)合性。在單株植物中，不同類型CWD蛋白的表達(dá)可以為生物燃料和生物化學(xué)生產(chǎn)創(chuàng)建一個低成本的糖平臺。本文的實(shí)施方式提供了對來自包括一種或多種類型CWD蛋白的基因工程植物的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行溫和的化學(xué)預(yù)處理來生產(chǎn)可溶性糖的方法。[0044]—種實(shí)施方式提供了一種從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法。所述方法可以包括通過與制漿制劑混合形成混合物以預(yù)處理基因工程植物原料?；蚬こ讨参锊牧峡梢园ň幋a第一蛋白的第一多核苷酸序列。第一蛋白可以是CWD酶。第一蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD酶。第一蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。第一蛋白可以能夠水解基因工程植物材料的組分。能夠水解某組分意味著在水解條件下第一蛋白催化該組分的水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第一蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接(spliced)后，該蛋白能夠在水解條件下水解該組分。所述方法還可以包括提供水解條件。水解條件可以適于水解該組分。[0045]基因工程植物材料還可以包括編碼第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD蛋白。第二蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第二蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第二蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。第二蛋白能夠水解基因工程植物原料的組分。能夠水解某組分意味著第二蛋白在水解條件下催化這種組分水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第二蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接后，該蛋白可以在水解條件下水解該組分。[0046]基因工程植物材料還可以包括編碼第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD蛋白。第三蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第三蛋白可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第二蛋白的蛋白。第三蛋白可以能夠水解基因工程植物原料的組分。能夠水解某組分意味著第三蛋白在水解條件下催化這種組分水解。對于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的第三蛋白而言，能夠水解某組分意味著該內(nèi)含肽從肽上剪接后，該蛋白能夠在水解條件下水解該組分。[0047]基因工程植物材料是指轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物的子代，轉(zhuǎn)基因植物的后代，或上述任何一種植物的部分。轉(zhuǎn)基因植物材料可以含有不存在于天然植物中的細(xì)胞壁降解酶或其編碼基因?；蚬こ讨参锊牧峡梢允潜磉_(dá)CWD蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，或轉(zhuǎn)基因植物的任何部分。基因工程植物材料可以是表達(dá)修飾形式的CWD蛋白的任何轉(zhuǎn)基因植物，或轉(zhuǎn)基因植物的任何部分。轉(zhuǎn)基因植物可以是任何形式的植物。植物的轉(zhuǎn)基因植物類型可以是但不限于玉米、甜菜、甘蔗、高粱、柳枝稷、芒草、桉樹、柳樹或楊樹?；蚬こ讨参锊牧峡梢允钦麄€轉(zhuǎn)基因植物或該植物的部分。所述部分可以是但不限于葉、莖、花、芽、花瓣、子房、果實(shí)或種子。基因工程植物材料可以是來自轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織。基因工程植物材料可以由一種或多種轉(zhuǎn)基因植物的部分再生?；蚬こ讨参锊牧峡梢允堑谝晦D(zhuǎn)基因植物和第二轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物有性雜交的產(chǎn)品，其中，產(chǎn)品植物保留引種到第一轉(zhuǎn)基因植物的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)基因植物可以是本文所提供的轉(zhuǎn)基因植物中的任何一種。轉(zhuǎn)基因植物可以含有任何載體，表達(dá)盒，或單獨(dú)的核酸或其片段。[0048]基因工程植物材料與制漿制劑的混合可以通過任何基因工程植物材料和制漿制劑的結(jié)合來完成。混合可以通過攪拌來完成。[0049]制漿制劑可以是分解木質(zhì)素的物質(zhì)，所述木質(zhì)素將木質(zhì)纖維素植物材料內(nèi)部的木質(zhì)纖維素結(jié)合在一起。所述物質(zhì)可以降解木質(zhì)素而不會嚴(yán)重降解木質(zhì)纖維素。預(yù)處理可以導(dǎo)致在基因工程植物中表達(dá)的部分酶的釋放和木質(zhì)纖維素植物材料內(nèi)木質(zhì)素的部分降解。[0050]所述方法可以包括在預(yù)處理之前，期間或之后對CWD蛋白進(jìn)行激活。所述方法可以包括在供給水解條件之前、期間或之后對CWD蛋白進(jìn)行激活。被激活的CWD蛋白可以是第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或任何外加的木質(zhì)纖維素處理酶。CWD蛋白可以被修飾為含有內(nèi)含肽。所述內(nèi)含肽可以融合至CWD酶上或酶末端或酶的內(nèi)部。所述內(nèi)含肽在供給誘導(dǎo)條件下可誘導(dǎo)剪接。誘導(dǎo)條件可以是特定的混合物溫度。誘導(dǎo)條件可以是預(yù)處理或提供水解步驟之前、期間或之后的溫度。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的酶和用于誘導(dǎo)內(nèi)含肽剪接的條件，可以作為活化條件，這在2004年7月7日提交的美國申請Appln.10/886，393和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55746，2010年的11月5日提交的PCT/US10/55669和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55751中有所描述，在此以全文援引的方式納入本文。[0051]所述組分可以是需要處理的任何部分。所述組分可以是木質(zhì)纖維材料。所述組分可以為本文所列出的任何CWD蛋白的底物。所述組分可以為木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物。所述組分可以是包括本文所列出的任何CWD蛋白的底物的一部分。所述組分可以是包括木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物一部分。[0052]所述方法還包括混合之前、期間或之后添加其他植物材料，預(yù)處理，或提供水解條件。其他植物材料可以是基因工程材料以外的任何植物生物質(zhì)、纖維素或木質(zhì)纖維材料。其他植物材料可以來源于生物煉制產(chǎn)物。其他植物材料可以包括林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢物。林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢物可以是但不限于玉米秸桿、甘蔗渣(baggasses)、小麥秸桿、廢木材、森林修剪物(foresttrimmings)、廢紙、城市固體廢物(MSW)。其他植物材料可以是任何能源作物。能源作物可以是但不限于。柳枝稷、高粱、甜菜、甘蔗、芒草和楊樹。[0053]編碼第一蛋白，第二蛋白，第三蛋白或任何額外的酶的多核苷酸序列可以可操作地連接至調(diào)控序列上。本文中，可操作地連接意味著調(diào)控元件將其功能賦予多核苷酸序列。在調(diào)控元件是啟動子的情況下，當(dāng)將調(diào)控元件與多核苷酸序列可操作地連接的時候，啟動子能夠控制它們的表達(dá)。在調(diào)控元件是終止子的情況下，所述終止子能夠終止多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。下面提供了調(diào)控元件的非限制性參考示例。[0054]第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種可以是但不限于選自下列的酶:XynA:來自嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)的β-1,4-木聚糖酶229Β(Uniprot登記號Ρ77853);XynB:來自米曲霉(ThermomycesIanuginosus)的內(nèi)_1，4_β-木聚糖酶(Uniprot登記號043097)；EGA:來自高山象白蟻(Nasutitermestakasagoensis)的內(nèi)-β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號077044)；EGB:來自解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的內(nèi)_β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號Ρ54583)；AccA:來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A(Uniprot登記號042807)；AccB:來自黑曲霉的阿魏酸酯酶B(Uniprot登記號Q8WZI8)；AccA/B:黑曲霉的阿魏酸酯酶A和阿魏酸酯酶B;EGC:來自海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)的內(nèi)-β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶(Uniprot登記號033897)；Ρ40942:來自幾堆梭菌F9(ClostridiumstercorariumF9)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登記號P40942);P40943:來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌T_6(GeobacillusstearothermophiIusT-6嗜熱脂肪芽抱桿菌)的β-1，4-木聚糖酶(Uniprot登記號Ρ40943)；030700:來自芽孢桿菌屬NG-27的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登記號030700)；CBHA:來自熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)的外切纖維素酶A(Uniprot登記號068438)；CBHB:外切纖維素酶B(SYTBD22308);或XynE:木聚糖酶(EU591743)。[0055]第一蛋白可以包括與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[Ρ77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所組成的組中。第一蛋白可以包括與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成。[0056]第二蛋白可以包括與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述第二參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所組成的組中。第二蛋白可以包括與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成。[0057]第三蛋白可以包括與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述第三參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所組成的組中。第三蛋白可以包括與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成。[0058]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼各自靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因植工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第一祀向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每種可以獨(dú)立選擇各自的靶向肽。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立地選自但不限于造粉體靶向信號、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號、葉綠體靶向信號、核靶向肽和液泡靶向肽。[0059]第一靶向多肽可以位于所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以與SEQIDNO:13[BAASS]、大麥糊粉粒序列SEQIDNO:14[HVAlePS]、SEQIDNO:15[PRla]、SEQIDNO:16[Y玉米蛋白序列xGZein27ss_02]或SEQIDNO:17[GluB4SP]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98,99或100%的同一性。[0060]與第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一種相結(jié)合的第一靶向多核苷酸序列可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO:21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。[0061]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEQIDNO:22[SEKDEL]、縮減的SEQIDNO:23[KDEL]或大麥液泡分類決定序列SEQIDNO:24[HvVSD-OI]中的一種具有至少72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一種上。[0062]在細(xì)胞質(zhì)積累中，提供的所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中至少有一種可以不含有靶向肽。[0063]所述第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列與第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列結(jié)合在一起，可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HVVSD-01]所組成的組中。[0064]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種可以編碼CWD蛋白的“變體”。所述CWD蛋白的變體的氨基酸序列可以根據(jù)氨基酸序列的缺失、添加、替換或CWD蛋白的其它修飾而改變。CWD蛋白的變體可以維持CWD蛋白的生物活性。本文中，所述維持生物活性是指，變體至少有從CWD蛋白中得到的60%的活性。對木聚糖酶活性的評估可以在實(shí)驗(yàn)中使用本文中實(shí)施例1標(biāo)題為“秸桿酶活性測定”的小節(jié)中描述的XylazymeAX底物。對內(nèi)切葡聚糖酶的活性的評估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用本文中實(shí)施例1標(biāo)題為“秸桿酶活性測定”的小節(jié)中描述的Cellazyme底物。外切葡聚糖酶活性的評估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用突光4_甲基傘形酮-b_D_乳吡喃糖苷(4-methylumbelliferyl-b-D-1actopyranoside)(4-MU),如HarrisonMDetal.2011“Accumulationofrecombinantcellobiohydrolaseandendoglucanaseintheleavesofmaturetransgenicsugarcane,”PlantBiotechnologyJournal(植物生物科技雜志)9:884-896中所描述的，這里以全文援引的方式納入本文。對阿魏酸酯酶活性的評估可以通過在實(shí)驗(yàn)中使用PNP標(biāo)記的阿魏酸鹽作為底物(詳見HegdeS.等.2009“Single-stepsynthesisof4-nitrophenylferulateforspectrophotometrieassayofferuloylesterases,，，AnalyticalBiochemistry(分析生物化學(xué))387(I):128_129)。上述木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶或阿魏酸酯酶活性的測試可以用來確定與CWD降解蛋白序列有少于100%的同一性的序列是否為CWD降解蛋白的變體。這里CWD蛋白的變體可以被修飾成與CWD蛋白有相似的疏水性、親水性、溶解度、氨基酸殘基極性的氨基酸序列。這里CWD蛋白可以根據(jù)翻譯后的修飾而改變。不同的翻譯后修飾可以是但不限于糖基化，乙酰化或磷酸化作用。變體可以通過任何方式形成。變體可以通過定點(diǎn)誘變或非定點(diǎn)誘變形成。本文中，易錯PCR可以用來創(chuàng)建CWD蛋白的突變體，而且以上任何實(shí)驗(yàn)均可以用來評估突變體是否是變體。[0065]實(shí)施方式包括將第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或它們的變體中的至少一種融合到靶向肽或羧基靶向肽中的至少一種的變體上。靶向肽或羧基靶向肽的變體將蛋白靶向融合到與靶向肽或羧基靶向肽的參考序列相同的位點(diǎn)上。[0066]內(nèi)含肽的變體可以在第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中提供。內(nèi)含肽的變體可以從其融合的蛋白中剪接。[0067]為確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分比，可以包括在兩條序列的相應(yīng)位置上比對和比較氨基酸殘基或核苷酸。如果兩條序列所有的位置都被相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么這兩條序列被稱為具有100%的同一性。同一性百分比可以通過SmithWaterman算法測定(SmithTF、WatermanMS1981“IdentificationofCommonMolecularSubsequences,”JMolBiol147:195-197,該文獻(xiàn)通過全文援引的方式納入本文)。[0068]在一種實(shí)施方式中，編碼與引用的氨基酸參考序列具有低于100%同一'丨生的蛋白的多核苷酸序列可以編碼含有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，與引用的氨基酸參考序列具有低于100%的同一性的蛋白可以是含有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，編碼與引用的核酸參考序列編碼的蛋白具有低于100%的同一性的蛋白的多核苷酸序列可以編碼蛋白的變體，所述蛋白由參考序列編碼。[0069]參考圖1，顯示了一種從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法。圖1顯示了基因工程植物材料的聯(lián)合預(yù)處理和水解的工藝流程?；蚬こ讨参锊牧匣蚧蚬こ讨参锊牧匣焱渌参锊牧峡梢酝ㄟ^送料機(jī)10添加到反應(yīng)器20進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理和酶液化，也就是說，將固體木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成液化狀態(tài)以進(jìn)一步加工和水解的過程。在反應(yīng)器20，基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以與制漿制劑混合。制漿制劑可以包括至少一種組分，所述組分具有選自由亞硫酸根、亞硫酸氫根、硫酸根、碳酸根、氫氧根和氧負(fù)離子(oxide)所組成的組中的離子。所述至少一種組分還包括但不限于選自由銨離子、鈉離子、鎂離子及鈣離子所組成的組中的反荷離子(counterion)。至少一種組分可以是鹽。所述鹽可以是但不限于亞硫酸鹽(S032_)、亞硫酸氫鹽(HS03_)、氧化物(02_)和氫氧化物(0H—)。所述鹽可以包括反荷離子。反荷離子可以包括但不限于鈉離子(Na+)、鈣離子(Ca2+)、氫離子、鉀離子(K+)、鎂離子(Mg2+)和銨離子(MO。制漿制劑可以包括氧化鈣(CaO)、石灰或氫氧化鈣(Ca(OH)2)、消石灰中的至少一種。[0070]在一種實(shí)施方式中，制漿制劑可以至少包括亞硫酸氫銨和碳酸銨中的一種。亞硫酸氫銨的濃度可為0.02M至0.35M，而碳酸銨的濃度可為0.025M至0.25M。制漿制劑可以與基因工程植物材料或混有其他植物材料的基因工程植物材料以優(yōu)選的液固比混合成混合物。這種混合物具有的液固比可選自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或I的值，或上述任何兩個值區(qū)間內(nèi)的任意值(包括端點(diǎn))。例如，液固比可以為小于任何選自3-7之間的整數(shù)或非整數(shù)的值。液固比值可以等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或上述任何兩個值區(qū)間內(nèi)任何值(包含端點(diǎn))。例如，液固比可以為等于3至7范圍內(nèi)任何整數(shù)或非整數(shù)的值。[0071]預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物任意一段時間。預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物長達(dá)16個小時。所述培養(yǎng)可以進(jìn)行更長或更短的時間。預(yù)處理可以包括培養(yǎng)混合物一段小于或等于16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I小時的時間。[0072]預(yù)處理可以包括提供40°C至95°C的混合物溫度。40°C至95°C的混合物溫度，可以在不使水解酶失活的情況下破損或除去混合物中木質(zhì)素纖維材料的部分木質(zhì)素。預(yù)處理可以包括提供55°C、65°C、75°C、95°C、低于551:、低于651:、低于75°C、低于95°C、低于100°C、40°C至55°C、40°C至65°C、40°C至75°C、40°C至95°C、40°C至低于100°C、55°C至65°C、55°C至75°C、55°C至95°C、55°C至低于100°C、65°C至75°C、65°C至95°C、65°C至低于100°C、75°C至95°C、75°C至低于100°C或95°C至低于100°C的混合物溫度。[0073]預(yù)處理可以包括提供混合物pH值為5.0至10。預(yù)處理可以包括提供混合物pH值在6.5-8.5范圍內(nèi)。提供的混合物pH值可以是5.0,5.5,6.0,7.0,7.5,8.0,9.0、9.5或10，或任意兩個上述PH值之間的(包括端點(diǎn))pH值。預(yù)處理過程中混合物的pH值可以取決于使用的化學(xué)物質(zhì)的類型和/或使用的植物材料的類型。提供混合物PH值可以包括添加pH值調(diào)節(jié)化學(xué)物質(zhì)。PH值調(diào)節(jié)化學(xué)物質(zhì)可以是酸或堿。[0074]預(yù)處理步驟結(jié)束時，混合物可以包括部分降解的植物材料和稱為部分濾液的液相，所述部分濾液可以含有來自制漿制劑和低濃度的CWD酶的化學(xué)物質(zhì)或從基因工程植物材料釋放的酶。所述方法可以包括在分離器30中從部分降解的植物材料的固體部分分離部分濾液。分離可通過各種工藝來完成?？梢酝ㄟ^沉淀、過濾或離心部分濾液。所述方法可以包括在多個回合的預(yù)處理中至少收集或回收一部分部分濾液。在去除部分濾液后，混合物中固體的濃度可以增加并且可以為在2%至15%(w/v)的范圍內(nèi)的任何整數(shù)或非整數(shù)值，或?yàn)樵?%至15%(w/v)范圍內(nèi)的任何兩個整數(shù)值內(nèi)的范圍。[0075]所述方法可以包括用任何合適的液體清洗預(yù)處理的基因工程植物材料。液體可以是去離子水。液體可以通過離心分離而去除。[0076]所述方法還包括通過機(jī)械研磨來精煉，這可以在精煉機(jī)40內(nèi)通過任何已知的方法完成，例如但不限于去纖維化(defibrilIation),研磨或打碎。[0077]所述方法可以包括轉(zhuǎn)移精煉的預(yù)處理的生物質(zhì)到糖化容器50。從基因工程植物材料中釋放的CWD酶的水解作用發(fā)生在糖化容器50中。[0078]提供的水解條件可以包括調(diào)整混合物為2%至25%的固含量，在2%至25%(包括端點(diǎn))之間的任何整數(shù)或非整數(shù)值的固含量，或在2%至25%之間任意兩個整數(shù)范圍內(nèi)的任何整數(shù)或非整數(shù)值的固含量。提供的水解條件可以包括培養(yǎng)混合物長達(dá)144小時的一段時間，選自長達(dá)144小時的任何一個整數(shù)或非整數(shù)值的一段時間，或大于零和長達(dá)144小時內(nèi)任意兩個整數(shù)值范圍內(nèi)的一段時間。提供水解條件可以包括提供100°C或更低、65°C或更低、50°C或更低、48°C至50°C、48°C至65°C、48°C至小于100°C，或48°C至100°C的混合物溫度。提供水解條件可以包括提供從4.8至5.0范圍的pH值，4.8的pH值，4.9的pH值或者5.0的pH值?？梢愿鶕?jù)基因工程植物材料中CWD酶的具體活性來選擇溫度，pH值或處理時間中的至少一種。[0079]如果基因工程植物材料包括多種CWD酶，可以按順序?yàn)樗龆喾N酶中的每一種的表達(dá)、預(yù)處理或水解中的至少一步提供最佳的條件。水解條件可以包括提供一種酶活性最佳的pH值，然后提供適于另一種酶活性的最佳的不同pH值。水解條件可以包括在不同的時段來調(diào)整每種酶最佳活性的溫度。例如，木聚糖酶可能需要不同于內(nèi)切葡聚糖酶的溫度或pH值。[0080]所述方法包括添加一種或多種外源酶到基因工程植物材料，其它植物材料或混合物其中的至少一種中。外源酶可以在預(yù)處理之前、期間或之后添加。外源酶可以在提供水解條件之前、期間或之后添加。外源酶可以添加到糖化容器50中。一種或多種外源酶可以以復(fù)合酶(enzymecocktail)的形式提供。復(fù)合酶可以包括一種或多種CWD酶。本文中，在一種實(shí)施方式中提供的CWD酶可以是但不限于木質(zhì)素降解酶，纖維素降解酶或半纖維素降解酶。本文中，在一種實(shí)施方式中提供的CWD酶可以是但不限于選自糖苷酶、木聚糖酶、纖維素酶、纖維素內(nèi)切酶、外切葡萄糖酶、外切纖維素酶、β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶以及淀粉酶中的一種。復(fù)合酶可以包括從里氏木霉(Trichodermareesii)中分離的的纖維素酶。復(fù)合酶可以從供應(yīng)商購買。復(fù)合酶可以為但不限于從杰能科國際(GenencorInternational)(羅契斯特市，紐約)購買的Accellerase?lOOO,Accellerase*1500和Accellerase%XY。復(fù)合酶可以是諾纖力?賽力二代(Cellic)。酶Cellic可以包括不同類型的CWD酶?；旌衔镏胁煌愋偷腃WD酶的最優(yōu)條件可以被提供。例如，在所述方法中，可以調(diào)節(jié)水解處理的溫度、PH值和時間以為混合物中不同的酶提供最優(yōu)條件。水解條件可以包括減少復(fù)合酶中含有的外源酶的用量。減少用量可以包括在基因工程植物材料中具有較少的或缺乏一種或多種CWD蛋白表達(dá)的制劑。例如，如果轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)木聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶，這些酶可以從按配方制成的用于具有轉(zhuǎn)基因植物的基因工程植物材料水解的復(fù)合酶中去除。[0081]水解效率可以通過測量植物材料的增溶進(jìn)行評估。測量植物材料增溶的方法為本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】所公知，可以包括確定單糖和二糖濃度，例如通過高效液相色譜(HPLC)法。在此描述的實(shí)施例中，可以使用具有LC解決方案軟件(solutionssoftware)的ShimadzuLC-20AD二元液相泵(Shimadzu,Kyoto,Japan)進(jìn)行HPLC,糖濃度的測量可以使用AminexHPX-87p糖柱(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)。其他測量植物材料的增溶的方法，例如，通過測定重量損失、木質(zhì)素去除或?qū)︻A(yù)處理的植物材料進(jìn)行脫乙酰作用都是可用的。[0082]所述方法還可以包括使混合物和/或水解產(chǎn)物與發(fā)酵生物相接觸，以便生產(chǎn)生化產(chǎn)品。酶水解后，可溶性糖可以回收并用于生產(chǎn)生化產(chǎn)品。或者，在所述方法中，可以同步糖化和發(fā)酵可溶性糖以形成生化產(chǎn)品。生化產(chǎn)品可以是但不限于丁烷、丁二醇、丁二烯、丁醇、異丁醇、丙烷、丙二醇、丙烯、丙醇、異丙醇、甲烷、甲醇、乙醇、苯酚、丙三醇、乙烯、甲苯、乙酯(ethyl)、苯、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、環(huán)氧乙烷、甲酸、二氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、維生素、乙烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、醋酸、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、胡索酸、蘋果酸、呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、羥基內(nèi)丁酯、甘油、山梨醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、葡糖酸、乳酸、丙二酸、丙酸、檸檬酸、烏頭酸、木糖酸、糠醛、左旋葡聚糖、丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸(參見T.Werpy和G.Petersen,TopValueAddedChemicalsFromBiomass,VolumeljResultsofScreeningforPotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisGas，2004年8月，Report，PNNL&NREL，在此以全文引用的方式納入本文)。所述方法可以包括同步糖化和發(fā)酵可溶性糖生產(chǎn)乙醇。同步糖化和發(fā)酵生產(chǎn)乙醇可以包括在預(yù)處理之前、期間或之后提供釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A或提供水解條件。[0083]可以通過任何合適的發(fā)酵生物將糖類轉(zhuǎn)換成所需的生化產(chǎn)品。發(fā)酵生物可以根據(jù)所需的生化產(chǎn)品來選擇。發(fā)酵生物可以是酵母。酵母可以是但并不僅限于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichiai)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、刀抱酵母屬(Spathaspora)或發(fā)酵酵母屬(Scheffersomyces)各屬種中的一種。發(fā)酵的生物可以是細(xì)菌。細(xì)菌可以是但不限于單胞發(fā)酵菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)或梭菌屬(Clostridium)各屬種中的一種。發(fā)酵生物可以是野生型生物或基因工程重組生物。[0084]一種實(shí)施方式包括含有編碼第一蛋白的第一多核苷酸序列的基因工程植物。第一蛋白可以是CWD蛋白。第一蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第一蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第一蛋白可以包括、基本上由或由與第一參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述第一參考序列選自由SEQIDNO:I[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100_101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897]、SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所組成的組中。所述第一蛋白可以包括，基本上由或由與參考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列組成。[0085]基因工程植物還可以包括編碼第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD酶。第二蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第二蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第二蛋白可以包括、基本上由或由與第二參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述第二參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA],SEQIDNO:3[AnfaeB],SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101],SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438],SEQIDNO:11[P54583]和SEQID:12[BD22308所組成的組中。被選定為第二參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第一參考序列的SEQIDN0。[0086]基因工程植物還可以包括編碼第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD酶。第三蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第三蛋白可以通過任何一種描述的有關(guān)從基因工程植物材料生產(chǎn)可溶性糖的方法中獲得。第三蛋白可以包括與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與第三參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述第三參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438],SEQIDNO:11[P54583]和SEQID:12[BD22308]所組成的組中。被選定為第三參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第一參考序列的SEQIDN0。被選定為第三參考序列的SEQIDNO可以不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。[0087]基因工程植物中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。各自靶向肽可以獨(dú)立地選自但不限于造粉體靶向信號、細(xì)胞壁肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號，葉綠體靶向信號，細(xì)胞核靶向肽或液泡靶向肽。[0088]每條單獨(dú)的靶向肽可以融合到相應(yīng)的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白上。靶向肽可以與SEQIDNO:13[BAASS]、SEQIDNO:14[HvAleSP]、SEQIDNO:15[PRla]、SEQIDNO:16[xGZein27ss-02]或SEQIDNO:17[GluB4SP]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。[0089]基因工程植物的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEQIDNO:22[SEKDEL]、縮減的SEQIDNO:23[KDEL]或SEQIDNO:24[大麥液泡分類決定序列HvVSD-Ol]中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一種上。[0090]基因工程植物可以包括至少一種編碼氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包括與選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm],SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:25[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列、基本上由或由與選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列組成。[0091]基因工程植物可以包括至少一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包括與選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:25[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列、基本上由或由與選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所組成的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列組成。[0092]基因工程植物可以是轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物的子代，轉(zhuǎn)基因植物的后代，或上述的任何一部分。基因工程植物可以包括不在植物中天然存在的CWD蛋白，或編碼相同CWD蛋白的基因。CWD蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。轉(zhuǎn)基因植物可以是任何類型的植物。轉(zhuǎn)基因植物類型可以是玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉樹、柳樹或楊樹。轉(zhuǎn)基因植物可以通過已知的方法創(chuàng)建，用來表達(dá)任何形式的CWD酶或CWD蛋白。所述植物可以使用載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化來創(chuàng)建，所述載體包括編碼酶的多核苷酸序列。還可以通過用于轉(zhuǎn)基因植物的其他方法來創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物，例如，基因槍法或直接吸收DNA法。本文所述的轉(zhuǎn)基因植物可以含有任何單獨(dú)的核酸、氨基酸序列、表達(dá)盒或載體。[0093]在一種實(shí)施方式中提供了一種表達(dá)盒，包括第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種，分別編碼第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是從基因工程植物材料或基因工程植物中生產(chǎn)可溶性糖的方法中描述的一種蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以是木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶。被選定為第二蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第一蛋白的蛋白。被選定為第三蛋白的蛋白可以不同于被選定為第二蛋白的蛋白。[0094]在表達(dá)盒中編碼CWD蛋白的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中至少有一種可以通過插入編碼內(nèi)含肽的核酸序列被修飾。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的多核苷酸可以使用修飾功能編碼經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白。修飾功能可以使CWD蛋白失活而內(nèi)含肽仍然融合到或在CWD蛋白中。存在于經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白中的內(nèi)含肽可以誘導(dǎo)剪接形成非經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白。剪接的誘導(dǎo)條件可以是但并不局限于提供一定的溫度。提供的溫度可以是用于從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法中描述的預(yù)處理或水解條件中至少一種中提供的溫度。誘導(dǎo)條件可以是與選定的內(nèi)含肽相匹配的任何其他誘導(dǎo)條件。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是iXynA:即，經(jīng)內(nèi)含肽修飾的XynA。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是經(jīng)內(nèi)含肽修飾的P77853。經(jīng)內(nèi)含肽修飾的蛋白可以是P77853:T134-100-101或P77853:S158-30-108-35。[0095]在表達(dá)盒中的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以包括與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列組成，所述參考序列選自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA],SEQIDNO:3[AnfaeB],SEQIDNO:4[NtEGm],SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101],SEQIDNO:8[P77853:SI58-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897]、SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所組成的組中。所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一種或多種可以包括、基本上由或由與參考序列SEQID:12(BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列組成。[0096]表達(dá)盒中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列其中至少有一種還可以包括編碼各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第一靶向多核苷酸序列可以被包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一種上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立地來自第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一種。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每種各自的靶向肽可以獨(dú)立選自但不限于造粉體靶向信號、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號、葉綠體靶向信號、細(xì)胞核靶向肽和液泡靶向肽。第一靶向多核苷酸可以位于第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以與BAASS(SEQIDNO:13)、大麥糊粉序列HVAlePS(SEQIDNO:14),PRla(SEQIDNO:15),Y玉米蛋白序列xGZein27ss_02(SEQIDNO:16)或GluB4SP(SEQIDNO:17)中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一'丨生。第一祀向多核苷酸序列與第一多核苷酸序列,第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列結(jié)合在一起可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO:21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所組成的組中。[0097]表達(dá)盒中的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少有一種還可以包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。對于缺乏第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列上。對于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以選自但不限于與SEKDEL(SEQIDNO:22)，縮減的KDEL(SEQIDNO:23)或大麥液泡分類決定序列HvVSD-01(SEQIDNO:24)中的一種具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100同一性的序列。羧基靶向肽可以與所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種相融合。[0098]表達(dá)盒可以配置為提供第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種，不含有用于在細(xì)胞質(zhì)中積累的靶向肽。[0099]在表達(dá)盒中，與第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三核苷酸序列中的一種結(jié)合到一起的第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列可以編碼與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]，SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]，SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-OI]所組成的組中。[0100]實(shí)施方式包括編碼與靶向肽或羧基靶向肽中的至少一種相融合的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或者它們的變體中的至少一種的表達(dá)盒。[0101]在一種實(shí)施方式中，在表達(dá)盒中，編碼與所引用的氨基酸參考序列具有低于100%同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以編碼具有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，與所引用的氨基酸參考序列具有低于100%的同一性的蛋白可以是具有氨基酸參考序列的蛋白的變體。在一種實(shí)施方式中，編碼與所引用核酸參考序列編碼的蛋白具有低于100%同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以編碼所述參考序列編碼的蛋白的變體。[0102]在一種表達(dá)盒中，所述第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種能夠與在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下編碼CWD蛋白或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD蛋白的參考序列雜交。所述第一，第二或第三多核苷酸中的至少一種能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交，所述參考序列選自由SEQIDNO:32[WTP77853]、SEQIDNO:33[AnfaeA]、SEQIDNO:34[AnfaeB]、SEQIDNO:35[NtEGm]、SEQIDNO:36[EU591743]、SEQIDNO:37[043097]、SEQIDNO:38[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:40[033897]、SEQIDNO:41[068438]、SEQIDNO:42[P54583]和SEQIDNO:43[BD22308]的所組成的組中。表達(dá)盒可以包括能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交的多核苷酸序列，所述參考序列選自由含有SEQIDNO:52[BAASS:P77853]、SEQIDNO:53[BAASS:033897]、SEQIDNO:54[HVAIePS:NtEGm]、SEQIDNO:55[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:56[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:58[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:59[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL],SEQIDNO:60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:61[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]的序列所組成的組中。[0103]本文的表達(dá)盒可以包括調(diào)控元件。[0104]在一種實(shí)施方式中，提供了包括本文所述的任何分離的核酸，多核苷酸序列或表達(dá)盒的載體。本文的實(shí)施方式包括其中結(jié)合有至少一種本文所述的表達(dá)盒的質(zhì)粒，染色體，線粒體DNA，質(zhì)體DNA，病毒或核酸片段。一種實(shí)施方式提供了用于在植物中表達(dá)CWD蛋白的載體。一種實(shí)施方式提供了植物轉(zhuǎn)化載體。所述植物轉(zhuǎn)化載體可以是但并不僅限于T-DNA載體，雙運(yùn)載體或共整合載體。轉(zhuǎn)化載體可以包括本文所述的任何分離的核酸，多核苷酸序列或表達(dá)盒。[0105]—種實(shí)施方式包括含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸能夠在低度、中度或高度嚴(yán)格條件下與含有以下序列的核酸雜交，所述序列包括、基本上由或由選自由SEQIDNO:63[pAG2015],SEQIDNO:64[pAG2048],SEQIDNO:65[pAG2049]、SEQIDNO:66[pAG2063],SEQIDNO:67[pAG2069],SEQIDNO:68[pAG2091],SEQIDNO:69[pAG2092],SEQIDNO:70[pAG2096],SEQIDNO:71[pAG2201]、SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242]、SEQIDNO:76[pAG2252]、SEQIDNO:77[pAG2253]、SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]所組成的組中的序列組成。[0106]—種實(shí)施方式包括含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，所述多核苷酸序列與選自由SEQIDNO:63[pAG2015]、SEQIDNO:64[pAG2048]、SEQIDNO:65[pAG2049]、SEQIDNO:66[pAG2063]、SEQIDNO:67[pAG2069]、SEQIDNO:68[pAG2091]、SEQIDNO:69[pAG2092],SEQIDNO:70[pAG2096],SEQIDNO:71[pAG2201],SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242],SEQIDNO:76[pAG2252],SEQIDNO:77[pAG2253],SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]所組中的組中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。[0107]雜交的方法和嚴(yán)格度條件為本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】所公知，并且在以下書籍中有所描述:MolecularCloning,T.Maniatis,Ε.F.Fritsch和J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratory,1982,以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,K.Struhl,Volumel,Johnffiley&Sons,2000，在此以全文援引的方式納入本文。[0108]溫和的條件可以如下:將裝有DNA樣品的過濾器在含有6x檸檬酸鹽緩沖鹽水(SSC；Amresco,Inc.,Solon,0Η)、0.5%十二烷基硫酸納(SDS；Amresco,Inc.,Solon,OH),5xDenhardt’s溶液(Amresco,Inc.，Solon,OH)以及和變性鮭魚精子(InvitrogenLifeTechnologies,Inc.Carlsbad，CA)的溶液中68°C預(yù)處理2_4小時。雜交是在同樣的溶液中并稍加以下改動:0.01MEDTA(Amresco,Inc.，Solon,0H)>100μg/ml鮭魚精子DNA以及5-20xl06cpm的32P-標(biāo)記或熒光標(biāo)記探針。過濾器先在雜交混合物中孵育16-20小時，然后用含有2xSSC和0.1%SDS的溶液洗15分鐘。第二次清洗更換含有0.1xSSC和0.5%SDS的洗液，并且在Tm(融化溫度。C)以下20°C至29°C下額外培養(yǎng)2小時。Tm=81.5+16.61Log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.41(%[G+C])-(500/n)-P-F0[Na+]=鈉離子的摩爾濃度。％[G+C]=DNA序列中G+C堿基的百分比。N=DNA序列的堿基長度。P=錯配堿基對百分比的溫度校正(每1%的錯配約1°C)。F=甲酰胺濃度的校正海1%甲酰胺=0.63°C)。過濾器暴露在成像儀中或者通過放射自顯影法顯影。低嚴(yán)格度條件是指低溫雜交條件，例如，在37°C和60°C之間，第二次洗滌在低于Tm的40°C至48°C的溫度下用高濃度[Na+](高達(dá)0.825M)。高嚴(yán)格度是指在高溫雜交條件，例如，高于68°C，第二次洗滌在低于Tm的5°C至I(TC的溫度下用0.0165至0.0330M的[Na+]。[0109]一種實(shí)施方式提供了分離的核酸序列，所述核酸序列在低度、中度和高度嚴(yán)格條件下與含有選自SEQIDNO:32[WTP77853]、SEQIDNO:33[AnfaeA]、SEQIDNO:34[AnfaeB]、SEQIDNO:35[NtEGm]、SEQIDNO:36[EU591743]、SEQIDNO:37[043097]、SEQIDNO:38[P77853:T134-100-101]和SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:40[033897]、SEQIDNO:41[068438]、SEQIDNO:42[P54583]和SEQID:43[BD22308]、SEQIDNO:52[BAASS:P77853]、SEQIDNO:53[BAASS:033897]、SEQIDNO:54[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:55[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:56[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:58[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:59[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL],SEQIDNO:60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:61[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01],SEQIDNO:63[pAG2015],SEQIDNO:64[pAG2048]、SEQIDNO:65[pAG2049],SEQIDNO:66[pAG2063],SEQIDNO:67[pAG2069]、SEQIDNO:68[pAG2091]、SEQIDNO:69[pAG2092]、SEQIDNO:70[pAG2096]、SEQIDNO:71[pAG2201],SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242]、SEQIDNO:76[pAG2252]、SEQIDNO:77[pAG2253]、SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]的序列或它們的互補(bǔ)序列的核酸雜交。[0110]一種實(shí)施方式提供了上述任何分離的核酸的片段。所述片段可以是雜交探針或引物。所述探針或引物的長度不限。所述探針或引物可以是6，10，15，20，25，30，35，40，45或50個核苷酸長度，或者是前述任意兩長度之間的長度(包括端點(diǎn))。片段可以有小于全長的長度，和/或包括與引用的參考序列相比的堿基的替換或缺失。所述片段可以是所述引用的參考序列的變體。由片段編碼的肽的長度可以小于全長，和/或包括與引用的參考序列編碼的氨基酸序列相比的氨基酸的替換或缺失。長度小于全長的肽可以是由所述引用的參考序列編碼的氨基酸序列的變體。[0111]表達(dá)盒可以由已知方法通過基因重組產(chǎn)生。表達(dá)盒可以包括一系列特定的核酸元件，它使得植物細(xì)胞或植物組織中特定核酸被轉(zhuǎn)錄。所述表達(dá)盒可以包括編碼蛋白的多核苷酸序列。所述蛋白可以是CWD酶或經(jīng)內(nèi)含肽修飾的CWD酶。CWD酶可以從包括木聚糖酶酶，纖維素內(nèi)切酶，外切葡聚糖酶，木糖苷酶，葡糖苷酶和阿魏酸酯酶的一系列CWD酶中選取。[0112]本文中，表達(dá)盒中的多核苷酸序列，分離的核酸，載體，或其他任何DNA構(gòu)建體，或在本文所述的方法中應(yīng)用的，都可以可操作地與一種或多種調(diào)控元件相連接。調(diào)控元件可以是啟動子。啟動子可以是組成型啟動子，它在植物大部分細(xì)胞，組織和器官的整個發(fā)育過程以及許多但并非所有的發(fā)育階段的發(fā)育過程中提供多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子，僅當(dāng)其暴露在特定的化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境刺激時，才能啟動所述多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子對于特定的發(fā)育階段、器官或組織可以是特定的。組織特異性啟動子能夠啟動在特定的植物組織中的轉(zhuǎn)錄。由組織特異性啟動子靶向的植物組織可以是但不限于莖，葉，毛狀體，花藥或種子。本文中，組成型啟動子可以是大米泛素3啟動子(0sUbi3P)或大米肌動蛋白I啟動子。也可以使用其他已知的組成型啟動子，包括但不限于花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，夜香樹黃色葉卷曲病毒啟動子(CMP)或截短型CMP(CMPS)，二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動子和玉米泛素啟動子。組織特異性啟動子可以包括種子特異性啟動子。種子特異性啟動子可以是但不限于大米GluB4啟動子或玉米蛋白啟動子。提供的另一種調(diào)控元件可以是終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。終止序列可以被包括在表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄單元的3'端。終止子可以來自不同的植物基因。終止子可以是一種來自根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens.)的胭脂氨酸合成酶或章魚堿合成酶基因的終止序列。[0113]本文中，整合有表達(dá)盒的載體也可以包括另外的基因元件，如多個克隆位點(diǎn)來促進(jìn)分子克隆和篩選標(biāo)記以方便選擇。包括在載體中的可篩選標(biāo)記可以是來自大腸桿菌(Escherichiacoli)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因，該基因賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞利用甘露糖增殖的能力。包括在載體中的可篩選標(biāo)記可以包括但不限于能賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt)基因，能賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因和能賦予草甘膦抗性的3-磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶基因。[0114]在一種實(shí)施方式中，可以構(gòu)建包括編碼多種CWD酶的多核苷酸序列的載體。本文所述的載體還可以包括多核苷酸序列，其目的在于沉默植物中的一種或多種基因。[0115]表達(dá)載體可以導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞，組織，器官和/或生物體中。合適的宿主細(xì)胞可以是雙子葉(dicots)或單子葉(monocots)的植物。[0116]本文的其他實(shí)施方式可以通過補(bǔ)充實(shí)施方式來構(gòu)成，補(bǔ)充的實(shí)施方式有一種或多種來源于本文中一種或多種其他實(shí)施方式的兀件，和/或使用來自本文中一種或多種其他實(shí)施方式的一種或多種元件替換來自一種實(shí)施方式的一種或多種元件。本文進(jìn)一步的實(shí)施方式可以通過參考權(quán)利要求1后的任何一條從屬權(quán)利要求和閱讀從任何一條或多條前述的權(quán)利要求中選出的權(quán)利要求來描述。[0117]實(shí)施例[0118]下面提供非限制性的實(shí)施例來說明具體的實(shí)施方式。全部實(shí)施方式都可以由來自下面的一種或多種實(shí)施例來補(bǔ)充一處或多處細(xì)節(jié)，和/或一種或多種來自一種實(shí)施方式的元件可被來自下面的一種或多種實(shí)施例中的一處或多處細(xì)節(jié)替換。[0119]實(shí)施例1-材料和方法[0120]載體[0121]本文中設(shè)計(jì)的載體是根據(jù)從日本煙草購買的過渡質(zhì)粒(intermediateplasmid)pSBll進(jìn)行的，并且已在2010.11.5提交的申請N0.PCT/US10/55746、2010.11.5提交的申請N0.PCT/US10/55669和2010.11.5提交的申請N0.PCT/US10/55751的國際申請中做出了描述，這些文獻(xiàn)以全文援引的方式納入本文。簡單地說，所述用于克隆的質(zhì)粒PSBll與pSBl受體載體結(jié)合，所述PSBl受體載體是在利用pSBll和pSBl都存在的cos和ori位點(diǎn)通過同源重組的卸甲Ti質(zhì)粒(disarmedTiplasmid)。整合載體包括諸如virB,virC和virG的毒性基因，這些毒性基因用于T-DNA轉(zhuǎn)移并且可以用于植物轉(zhuǎn)化?；A(chǔ)轉(zhuǎn)化載體含有表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有在0sUbi3P啟動子后續(xù)取代了CMPS啟動子的控制下編碼PMI的人A基因。該基礎(chǔ)載體用來獲取以下列出的載體，這些載體用于植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁降解酶在植物中的表達(dá):[0122]1.pAG2015(SEQIDNO:63):0sUbi3P:P77853；[0123]2.pAG2048(SEQIDNO:64):OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm，在水稻Ubi3啟動子之間與液泡融合；[0124]3.pAG2049(SEQIDNO:65):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL；[0125]4.pAG2063(SEQIDNO:66):0sUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0126]5.pAG2069(SEQIDNO:67):0sUbi3P:068438；[0127]6.pAG209I(SEQIDN0:68):0sUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0128]7.pAG2092(SEQIDN0:69):0sUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0129]8.pAG2096(SEQIDNO:70):OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0130]9.pAG2201(SEQIDNO:71):0sUbi3P:ZmUBQm:P77853；[0131]10.pAG2229(SEQIDNO:72):0sUbi3P:BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL(經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶);[0132]11.pAG2233(SEQIDNO:73)0sUbi3P:P77853:S158-30-108_35;[0133]12.pAG2234(SEQIDNO:74)0sUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35;[0134]13.pAG2242(SEQIDNO:75):0sUbi3P:PRlaSP=NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:ZmUBQm:P77853；[0135]14.pAG2252(SEQIDNO:76):0sUbi3P:033897(內(nèi)切葡聚糖酶);[0136]15.pAG2253(SEQIDNO:77):0sUbi3P:BAASS:033897；[0137]16.pAG2309(SEQIDNO:78):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm+0sUbi3P:P77853；[0138]17.pAG2310(SEQIDNO:79):0sUbi3P:EU591743(木聚糖酶);[0139]18.pAG2339(SEQIDNO:80):0sUbi3P:068438+0sUbi3P:BAASS:033897+0sUbi3P:EU591743；[0140]19.pAG2342(SEQIDNO:81):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:P77853;[0141]20.pAG2345(SEQIDNO:82):OsUbi3P:068438+0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0142]21.pAG2349(SEQIDNO:83)=ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0143]22.pAG2042(SEQIDNO:84):P54583(內(nèi)切葡聚糖酶EGB)[0144]轉(zhuǎn)基因玉米植物的生產(chǎn)[0145]玉米和柳枝稷轉(zhuǎn)化的方法在2010.11.5提交的申請的N0.PCT/US10/55746，2010.11.5提交的申請N0.PCT/US10/55669，2010.11.5提交的申請N0.PCT/US10/55751的國際申請以及Gray等2011PlantBiotechJ9:1100中有所描述，在此以全文援引的方式納入本文。簡單地說，將含有合適轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞LBA4404接種到野生型AxB玉米胚性愈傷組織中。未成熟的玉米胚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化按照前面描述的方法進(jìn)行(NegrottoD等.2000PlantCellRepl9:798；IshidaYetal.1996NatBiotechl4:745)。酶基因的表達(dá)盒被克隆到PAG2004(SEQIDNO:85)載體的Kpnl-EcoRI位點(diǎn)，以便生成過渡載體，使用之前報(bào)道的方法(IshidaY等.1996NatBiotechl4:745；HieiYetal.1994PlantJ6:271；HieiY和KomariT2006PlantCellTissueOrganCult.85:27；KomariTetal.1996PlantJlO:165)，所述中間載體能夠與農(nóng)桿菌菌株LBA4404三親雜交的pSBl載體重組。玉米(玉米品種HiII，A188或B73)母株生長在28°C、16小時光照的溫室中。未成熟合子胚從玉米粒中分離出來，并用含有目的基因的農(nóng)桿菌溶液接種。接種后的未成熟胚在10-12周的組織培養(yǎng)過程中生長。對發(fā)育成具有葉和根的幼苗取樣進(jìn)行PCR分析來鑒定含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。用水清洗PCR陽性并且生根的植物，以洗掉瓊脂培養(yǎng)基，移植到土壤中并在溫室中生長，以廣生種子和稻桿。[0146]本文中，特定的轉(zhuǎn)基因植物是指由酶所標(biāo)示(如:“P77853”、“P40942”、“030700”、“NtEGm”等)或轉(zhuǎn)基因?qū)φ?如:“TGC”等)，然后從以億計(jì)的質(zhì)粒中指定用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)粒(如:“2014”、“2015”、“2229”、“2092”等)。在上下文中，除i)酶或?qū)φ蘸蚷i)質(zhì)粒名稱外，偶爾插入的附加字符是清楚的。提及的質(zhì)粒以pAGXXXX命名。例如，在轉(zhuǎn)基因植物名稱中“2229”、“2252”、“2253”、“2092”、“2096”或“2042”的名字的意思是所述轉(zhuǎn)基因植物分別由“？八62229”、、八62252”、、八62253”、、八62092”、、八62096”或、八62042”制備。可以參考納入的用質(zhì)粒名稱標(biāo)記的序列來確定用于制備特定的轉(zhuǎn)基因植物的序列。[0147]對于轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株的制備，柳枝稷(Panicumvirgatum、cv.)的種子用于胚性愈傷組織的啟動，隨后使用含有PSBl質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404用于轉(zhuǎn)化。目的基因的存在使用基因特異性引物通過PCR來驗(yàn)證。[0148]以下表達(dá)一種或多種CWD酶的轉(zhuǎn)基因植物及對照植物用來于聯(lián)合預(yù)處理和水解。[0149]1.野生型玉米植株用作陰性對照(AxB;BxA);[0150]2.使用空載體轉(zhuǎn)化的玉米植株，用作陰性對照(TGC.4000.12；TGC.4000.11；TGC.2004.8.02；TGC.2004.8.04；TGC.2243.01)；[0151]3.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA.2015.05，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)；[0152]4.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的第二代轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA.2015.5T1，表達(dá)木聚糖酶A(P77853)；[0153]5.通過使用pAG2063轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB.2063.17，表達(dá)木聚糖酶XynB(043097)；[0154]6.通過使用pAG2049轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGA.2049.02和EGA.2049.10，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)；[0155]7.通過使用pAG2042轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGB.2042.03，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGB(P54583)；[0156]8.通過使用pAG2253轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGC.2253.4b，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGC(033897)；[0157]9.通過使用pAG2242轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株EGA/XynA.2242.09，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；[0158]10.上面植株9的第二代轉(zhuǎn)基因玉米植株，命名為EGA/XynA.2242.09.16T1，表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；[0159]11.通過使用pAG2092轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/AccB.2092.103，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)HE來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B;[0160]12.通過使用pAG2096轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01和XynA/AccA/B.2096.05,表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853),來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A和來自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B；[0161]13.通過使用pAG2069轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株CBHA.2069.3.17，表達(dá)外切葡聚糖酶CBH(068438)；[0162]14.通過使用pAG2015轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因柳枝稷植株XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c，表達(dá)木聚糖酶XynA(P77853)；[0163]15.通過使用pAG2229轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株iXynA.2229.110是，表達(dá)經(jīng)內(nèi)含肽修飾的XynA(P77853)；[0164]16.通過使用pAG2309轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107，表達(dá)XynA(P77853),內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEGm)；[0165]17.通過使用pAG2342轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynA/EGA.2342.105，表達(dá)XynA(P77853)和EGA(NtEGm)；[0166]18.通過使用pAG2339轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05，表達(dá)XynE(EU591743)、內(nèi)切葡聚糖酶EGC(033897)和CBHA(068438)；[0167]19.通過使用pAG2345轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHA.2345.116，表達(dá)XynB(043097)、內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEGm)和CBHA(068438)；[0168]20.通過使用pAG2349轉(zhuǎn)化制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHB.2349.56，表達(dá)XyanB(043097)、內(nèi)切葡聚糖酶EGA(NtEG)XBHB(BD22308)和ZmUbiIP:ZmKozak:xGZein27ss_02:BD22308:HvVSD-01:NosT。[0169]植物秸桿[0170]收獲的溫室玉米秸桿在37°C條件下在空氣循環(huán)器中干燥1-2周。干燥后，手動把秸桿切成1.0-1.5英寸的碎片，然后使用0.5mm篩的UDY粉碎機(jī)(Model014，UDY公司，F(xiàn)ortCollins,CO)磨碎。[0171]植物蛋白提取物的制備[0172]將壓碎的谷粒或20mg磨碎的秸桿分別重懸在蛋白提取緩沖液中，所述蛋白提取緩沖液包括IOOmM磷酸鈉(pH值6.5)，乙二胺四乙酸(EDTA;ImM)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(0.1%，v/v)和苯甲基磺酰氟(PMSF;0.1mM)。將重懸的組織樣本充分混合，不溶性物質(zhì)通過離心沉淀。將含可溶性蛋白的上清液轉(zhuǎn)移至新管中。[0173]化學(xué)物質(zhì)和酶[0174]糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和纖維二糖)是從AciosOrganics(MorrisPlains,NJ)購買的。本研究所用的其他化學(xué)物質(zhì)均從Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)購買。用于自制復(fù)合酶(inhousecocktail)的內(nèi)切葡聚糖酶(C8546),β-糖苷酶(49291)和木聚糖內(nèi)切酶(X2753)都購自Sigma(St.Louis、M0)。所述外切纖維素酶(CBHI)(EC3.2.1.91)和β-木糖酶(EC32I37)均從Megazyme(威克洛，愛爾蘭)購買。AccelleraseK1500和AccellemseKXY均由杰能科國際(GenencorInternational)(Rochester,NY)惠贈。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),菌株D5A是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)(Manassas,VA)獲得的。[0175]秸桿酶測試[0176]從15mg于室溫下在500μI提取緩沖液(IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH6.5；NaOAc,pH,4.5或Tris,ρΗ8.0；EDTA(IOmM)和TritonX-100(0.1%)中孵育30min的秸桿中提取蛋白。通過離心分離秸桿。收集上層清液并轉(zhuǎn)移至新的微量離心管。在緩沖液中重浮50μI蛋白提取物用來進(jìn)行酶分析。通常，將含有Xylazyme的IOOmM的磷酸鈉溶液，pH6.5或含有Cellazyme的IOOmMNaOAc溶液，pH4.5,xylazymeAX或纖維素酶檢測底物藥片(cellazymetablets)的緩沖液適量加入到用于酶測試的每管中。在測試溫度下(通常約50-60°C，這取決于被測試酶)孵育進(jìn)行反應(yīng)，直至上清液有可見藍(lán)顏色出現(xiàn)。通過測定反應(yīng)產(chǎn)物在590納米下的吸光度來量化藍(lán)色染料的量。這些反應(yīng)的對照包括微生物提高的酶和野生型植物提取物。水解底物也可以通過使用AZCL綴合底物(Megazyme)替代xylazymeAX和纖維素酶檢測底物藥片的情況而定。使用AZCL綴合底物使得被測秸桿的體積和底物濃度最優(yōu)化。[0177]木聚糖酶活性的檢測[0178]50°C下在0.5ml反應(yīng)體系中使用XylazymeAX(Megazyme,Bray,C0.Wicklow,Ireland)作為底物進(jìn)行可溶性蛋白的測定，對于BSX使用HEPES緩沖液(100mM、ρΗ8.0)，對于XynB使用磷酸鈉(100mM、pH6.5)緩沖液。將Iml2%(w/v)的Tris堿加入到反應(yīng)體系中以終止XylazymeAX反應(yīng)。通過離心來沉淀來自XylazymeAX反應(yīng)的不溶性材料，使用分光光度計(jì)在590nm下測定100μL反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值，一式三份。對于BSX或XynB積累水平的量化，通過孵育已知量的純化的、使用含有XylazymeAX藥片的分析緩沖液稀釋的微生物提高的BSX或XynB，以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；與此同時，使用轉(zhuǎn)基因植物材料進(jìn)行XylazymeAX分析。[0179]下面表1說明了在轉(zhuǎn)基因植物中檢測的酶活性。如文中所述。檢測了幾種木聚糖酶，內(nèi)切葡聚糖酶，外切纖維酶和阿魏酸酯酶的酶活性。對于每一個轉(zhuǎn)基因事件，被測的酶活性同樣通過蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析加以驗(yàn)證?！癗/A”指的是沒有進(jìn)行的分析。[0180]表1[0181]【權(quán)利要求】1.一種從基因工程植物材料中生產(chǎn)可溶性糖的方法，該方法包括:通過將基因工程植物材料與制漿制劑混合形成混合物以進(jìn)行預(yù)處理，其中，所述基因工程植物材料包括編碼第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白選自由木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶和經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶所組成的組中；以及提供水解條件。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括在所述混合物中加入其它植物材料。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一蛋白包括與參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所組成的組中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一蛋白包括與參考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基因工程植物材料還包括編碼第二蛋白的第二多核苷酸序列，所述第二蛋白選自由木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶和經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶所組成的組中；其中，被選定為第二蛋白的蛋白不同于被選定為第一蛋白的蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白包括與第二參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述第二參考序列選自由SEQIDNO:USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所組成的組中。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白包括與參考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述基因工程植物材料還包括編碼第三蛋白的第三多核苷酸序列，所述第三蛋白選自由木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的木聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的內(nèi)切葡聚糖酶、經(jīng)內(nèi)含肽修飾的外切葡聚糖酶和經(jīng)內(nèi)含肽修飾的阿魏酸酯酶所組成的組中；其中，被選定為第三蛋白的蛋白不同于被選定為第一蛋白的蛋白，并且不同于被選定為第二蛋白的蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述第三蛋白包括與第三參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述第三參考序列選自由SEQIDNO:USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所組成的組中。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述第三蛋白包括與參考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1、5或8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種還包括第一祀向多核苷酸序列，所述第一靶向多核苷酸序列編碼與第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一種相應(yīng)的靶向肽，所述靶向肽獨(dú)立地選自由造粉體靶向信號、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號、葉綠體靶向信號、細(xì)胞核靶向肽和液泡靶向肽所組成的組中，其中，所述相應(yīng)的靶向肽與第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白相融合。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述第一靶向多核苷酸序列分別位于第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游，并且所述靶向肽獨(dú)立地選自由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所組成的組中。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，與第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一種相結(jié)合的所述第一祀向多核苷酸序列編碼與參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20和SEQIDNO:21所組成的組中。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述植物還包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列，所述羧基靶向肽選自由SEQIDNO:22,SEQIDNO:23和SEQIDNO:24[HvVSD-01]所組成的組中，其中，所述羧基靶向肽與第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一種相融合。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述植物還包括編碼羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列，其中，與第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一種相結(jié)合的所述第一靶向多核苷酸序列和所述第二靶向多核苷酸序列編碼與參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27,SEQIDNO:28、SEQIDNO:29,SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所組成的組中。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述制漿制劑包括至少一種組分，所述組分具有選自由亞硫酸根、亞硫酸氫根、硫酸根、碳酸根、氫氧根和氧負(fù)離子所組成的組中的離子。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述至少一種組分還包括選自由銨離子、氫離子、鈉離子、鎂離子和鈣離子所組成的組中的反荷離子。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述制漿制劑包括亞硫酸氫銨和碳酸銨中的至少一種。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，亞硫酸氫銨的濃度為0.02M至0.35M，碳酸銨的濃度為0.025M至0.25M。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述混合物的液固比選自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或I的值。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述預(yù)處理包括將混合物孵育處理，所述孵育處理的時間小于或等于16小時、15小時、14小時、13小時、12小時、11小時、10小時、9小時、8小時、7小時、6小時、5小時、4小時、3小時、2小時或I小時。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述預(yù)處理包括提供40°C至95°C的混合物溫度。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述預(yù)處理包括提供5.0至10.0的混合物pH值。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，該方法還包括通過機(jī)械研磨對混合物進(jìn)行精煉。25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述水解條件包括2%至25%的固含量。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述水解條件包括孵育混合物長達(dá)144小時。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述水解條件包括100°C或更低的混合物溫度。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述混合物溫度為65°C或更低。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述混合物溫度為48°C至50°C。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述水解條件包括4.8至5.0的混合物pH值。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，該方法還包括將混合物與發(fā)酵生物相接觸以生產(chǎn)生化產(chǎn)品。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述發(fā)酵生物為酵母，所述酵母選自由酵母屬(Saccharomyces),克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces),畢赤酵母屬(Pichia),耶氏酵母屬(Yarrowia),刀孢酵母屬(Spathaspora)和發(fā)酵酵母屬(Scheffersomyces)所組成的組中。33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括加入一種或多種外源酶。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述一種或多種外源酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切纖維素酶、糖苷酶和木聚糖酶。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述一種或多種外源酶還包括β-木糖苷酶。36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述一種或多種外源酶包括從里氏木霉(Trichodermareesii)中分離的纖維素酶。37.一種基因工程植物，該基因工程植物包括編碼與第一參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列選自由SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所組成的組中。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的基因工程植物，其中，該植物還包括編碼與第二參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列選自由SEQIDNO:USEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQID:12所組成的組中，其中，被選定為第二參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第一參考序列的SEQIDNO。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的基因工程植物，該植物還包括編碼與第三參考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列選自由SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQID:12所組成的組中，其中，被選定為第三參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第一參考序列的SEQIDNO，也不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。40.根據(jù)權(quán)利要求37、38或39中任意一項(xiàng)所述的基因工程植物，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列還包括編碼靶向肽的靶向多核苷酸序列，所述靶向肽選自由造粉體靶向信號、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號、葉綠體靶向信號、細(xì)胞核靶向肽以及液泡靶向肽所組成的組中。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的基因工程植物，其中，所述靶向肽選自由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23和SEQIDNO:24[HvVSD-OI]所組成的組中。42.根據(jù)權(quán)利要求37、38或39中任意一項(xiàng)所述的基因工程植物，其中，所述基因工程植物選自由玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉樹、柳樹和楊樹所組成的組中。43.一種基因工程植物，該植物包括至少一種編碼氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列與選自由SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所組成的組中的序列具有至少90%的同一性。44.一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括:第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第一參考序列的核酸雜交，所述第一參考序列選自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38和SEQIDNO:39所組成的組中；第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有第二參考序列的核酸雜交，所述第二參考序列選自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39,SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42和SEQID:43所組成的組中，其中，被選定為第一參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的表達(dá)盒，其中，該表達(dá)盒還包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與第三參考序列雜交，所述第三參考序列選自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37、SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:4USEQIDNO:42[P54583]和SEQID:43所組成的組中，其中，被選定為第三參考序列的SEQIDNO不同于被選定為第一參考序列的SEQIDNO，并且不同于被選定為第二參考序列的SEQIDNO。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)盒,其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列還包括編碼靶向肽的靶向多核苷酸序列，所述靶向肽選自由造粉體靶向信號、細(xì)胞壁靶向肽、線粒體靶向肽、細(xì)胞質(zhì)定位信號、葉綠體靶向信號、細(xì)胞核靶向肽和液泡靶向肽所組成的組中。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)盒，其中，所述靶向多核苷酸序列選自由SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51所組成的組中。48.一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有參考序列的核酸雜交，所述參考序列選自由含有SEQIDNO:52,SEQIDNO:53、SEQIDNO:54,SEQIDNO:55,SEQIDNO:56,SEQIDNO:57,SEQIDNO:58,SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61和SEQIDNO:62的序列所組成的組中。49.一種表達(dá)載體,該表達(dá)載體包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能夠在中度嚴(yán)格條件下與含有選自由SEQIDNO:68,SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78,SEQIDNO:79,SEQIDNO:80,SEQIDNO:8USEQIDNO:82和SEQIDNO:83所組成的組中的序列的核酸雜交?！疚臋n編號】C10L5/44GK103547659SQ201280021388【公開日】2014年1月29日申請日期:2012年3月7日優(yōu)先權(quán)日:2011年3月7日【發(fā)明者】R·M·萊布,張東成,O·布格瑞申請人:谷萬達(dá)公司