專利名稱：表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物以及表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開內(nèi)容涉及表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物、載體、核酸、蛋白質(zhì)、相關(guān)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
·水解酶具有重要的工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用，但是它們依賴于表達(dá)宿主的的表達(dá)和生產(chǎn)可能會(huì)產(chǎn)生不良的表型效應(yīng)。具體而言，當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，細(xì)胞壁降解酶，例如纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)酶、酯酶、過氧化物酶以及其它水解酶，的表達(dá)常常對生長、生理以及農(nóng)藝性質(zhì)產(chǎn)生不利影響。由于其中的一些酶的水解活性，它們在微生物宿主中的表達(dá)可能較弱。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包括一種核酸，所述核酸編碼與選自SEQ ID NOS:44-115的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包括在中嚴(yán)格度條件下能夠與第二核酸雜交的第一核酸，所述第二核酸由選自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列構(gòu)成?！矫?，本發(fā)明涉及包括第一核酸的載體，所述第一核酸在低、中或高嚴(yán)格度之一的條件下能夠與由SEQ ID N0S: 116-187的一個(gè)序列組成的第二核酸雜交。一方面，本發(fā)明涉及包括核酸的載體，所述核酸具有與選自SEQ ID N0S: 188-283的參照序列具有至少90%同一性的序列。一方面，本發(fā)明涉及處理植物生物量的方法。所述方法包括通過將植物或其部分與液體混合形成液固比小于或等于15的混合物，從而對植物或其部分進(jìn)行預(yù)處理。所述預(yù)處理還包括提供條件以在小于或等于100°C的溫度下保持混合物。所述方法還包括提供一種或多種酶用來修飾植物或其部分的至少一種組分。


本專利或申請文件包括至少一個(gè)彩色附圖。根據(jù)要求和支付必要的費(fèi)用，官方將會(huì)提供本專利的副本或帶有彩色附圖的專利申請出版物。 結(jié)合附圖將會(huì)更好地理解下述對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的具體說明。為了闡明本發(fā)明，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)該理解的是本發(fā)明并不局限于所顯示的精確的設(shè)置和手段。附圖如下所示圖I為pSBll的載體圖譜。圖2A為AG1000的載體圖譜。圖2B為pAGlOOl的載體圖譜。圖2C為pAG1002的載體圖譜。圖3A為pAG1003的載體圖譜。圖3B為pAG2000的載體圖譜。圖3C為pAG2004的載體圖譜。圖4為pAG2014的載體圖譜。圖5 為 pBSK:0sUbi3P:XmaI:AvrII:NosT 的載體圖譜。圖6 % pBSK: 0sUbi3P: XmaI: Avr11: NosT: LI 的載體圖譜。圖7顯示登錄號(hào)為P40942、P77853以及030700的三種木聚糖酶的比活性。圖8顯示不同轉(zhuǎn)基因植物樣品表達(dá)木聚糖酶P77853的活性。圖9顯示030700、P77853以及P40942的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。圖10為宏觀尺度過程的工藝流程圖。圖11為微觀尺度過程的工藝流程圖。圖12顯示來自預(yù)處理的玉米秸桿(2015. 05和2004. 8. 4)的酶促水解的葡萄糖和
木糖的產(chǎn)率(生物量重量百分比)。圖13顯示來自預(yù)處理的玉米秸桿(2004. 8. 4、2063. 13和2063. 17)的酶促水解的
葡萄糖和木糖的產(chǎn)率(生物量重量百分比)。圖14顯示來自預(yù)處理的玉米秸桿(2015. 05和2004. 8. 4)的酶促水解的葡萄糖和 木糖的產(chǎn)率(生物量重量百分比)。圖15顯示來自預(yù)處理的玉米秸桿(2064. 17和2004. 8. 4)的酶促水解的葡萄糖和木糖的產(chǎn)率(生物量重量百分比)。圖16顯示來自預(yù)處理的玉米秸桿(2042. 02,2042. 03,2042. 06和2004. 8. 4)的酶促水解的葡萄糖的產(chǎn)率(生物量重量百分比)。圖17A顯示用pAG3000制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖17B顯示用pAG3001制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖18A顯示用pAG2004制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖18B顯示來自pAG2004制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖18C顯示來自pAG2004制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖19A顯示用pAG2005制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖19B顯示用pAG2005制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖20顯示用pAG2004轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物事件#15的還原糖的測量。圖21A顯示用pAG201 6制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖21B顯示來自pAG2016制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖22顯示轉(zhuǎn)基因植物的還原糖的測量。圖23顯示來自干的、衰老的玉米秸桿樣品的酶活性的測量。
圖24顯示用pAG2015 pAG2014或pAG2004制備的轉(zhuǎn)基因植物的葉組織樣品的酶
活性的測量。圖25A顯示用pAG2014制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖25B顯示用pAG2014制備的轉(zhuǎn)基因植物·。圖25C顯示來自pAG2014制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖26A顯示用pAG2015制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖26B顯示用pAG2015制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖26C顯示來自pAG2015制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖26D顯示來自pAG2015制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖27A顯示用pAG2020制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖27B顯示用pAG2020制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖27C顯示來自pAG2020制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖28A顯示用pAG2025制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖28B顯示用pAG2025制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖28C顯示用pAG2025制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖29A顯示用pAG2017制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖29B顯示用pAG2017制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖29C顯示來自pAG2017制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖29D顯示來自pAG2017制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖30A顯示用pAG2019制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖30B顯示用pAG2019制備的轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物的比較。圖31顯示用pAG2019或pAG2027制備的轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物的比較。左邊的三株植物是用PAG2019制備的。右邊的三株植物是用pAG2027制備的。圖32A顯示左邊的用pAG2018制備的兩株轉(zhuǎn)基因植物以及右邊的兩株表達(dá)非水解酶的植物。圖32B顯示用pAG2018制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖32C顯示用pAG2018制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖33A顯示用pAG2026制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖33B顯示用pAG2026制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖33C顯示用pAG2026制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖34A顯示用pAG2021制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖34B顯示用pAG2021制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖34C顯示來自pAG2021制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖34D顯示來自pAG2021制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖35A顯示用pAG2022制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖35B顯示用pAG2022制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖35C顯示來自pAG2022制備的轉(zhuǎn)基因植物的穗軸。圖36A顯示用pAG2023制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖36B顯示用pAG2023制備的轉(zhuǎn)基因植物。
圖36C顯示用pAG2023制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖37A顯示用pAG2024制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖37B顯示用pAG2024制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖37C顯示用pAG2024制備的轉(zhuǎn)基因植物。圖38顯示來自一些pAG2021事件的活性數(shù)據(jù)，以及來自pAG2004事件(木聚糖酶活性的陰性對照)和PAG20014事件(木聚糖酶活性的陽性對照)的測量。
具體實(shí)施方式

下述說明書中使用了特定的術(shù)語，但這僅是為了方便而并非為了限制。詞語“右”、“左”、“頂部”以及“底部”指定了附圖中的或所引用的具體實(shí)施例中的方向。除非特別說明，否則權(quán)利要求書和說明書的相應(yīng)部分中使用的詞語“一”和“一個(gè)”被定義為包括一個(gè)或多個(gè)所引用的項(xiàng)目。短語“至少一個(gè)”后面的一系列兩個(gè)或多個(gè)項(xiàng)目，如“A、B或C”，指的是A、B、或C中的任何單獨(dú)的個(gè)體，以及它們?nèi)我獾慕M合。盡管酶類對于表達(dá)宿主具有潛在的不良效應(yīng)，但是在植物、微生物以及其它生物體中生產(chǎn)酶類在制備燃料、纖維、化學(xué)品、糖類、紡織品、紙漿、紙以及動(dòng)物飼料中能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。不管是農(nóng)藝效應(yīng)或是表型效應(yīng)，有時(shí)候在植物中生產(chǎn)酶類具有經(jīng)濟(jì)效益。而且，可使用保護(hù)植物免受酶活性影響的各種策略來克服一些表型效應(yīng)。本文所述的具體實(shí)施方式
包括但不限于這些策略。植物表達(dá)酶的策略可能會(huì)依賴于作物的種類。一種特定的酶在一種作物中表達(dá)時(shí)可能具有很小的或沒有價(jià)值或效益，但在另一種作物中表達(dá)時(shí)卻具有顯著的價(jià)值或效益。也就是說，工程植物的性質(zhì)可能不僅取決于特定的酶，還取決于表達(dá)該酶的特定植物。例如，植物中木聚糖酶的表達(dá)能夠促進(jìn)植物細(xì)胞壁半纖維素和植物纖維水解為可發(fā)酵的糖類(用于生產(chǎn)燃料和化學(xué)品)或可消化的糖類(用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料和肉類)。然而，當(dāng)在玉米中表達(dá)時(shí)，特異性木聚糖酶也會(huì)降低谷物產(chǎn)量并可能導(dǎo)致不育，從而阻止了玉米作為酶表達(dá)的宿主的用途。盡管在玉米中木聚糖酶對谷物產(chǎn)量和繁殖會(huì)有負(fù)面影響，這可能降低工程植物與非工程植物相比的凈經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是同一種木聚糖酶在別的作物如柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱中的表達(dá)實(shí)際上可能是有益的，這是因?yàn)檫@些作物的不育會(huì)阻止木聚糖酶基因的異型雜交，而可以用組織培養(yǎng)或無性繁殖來產(chǎn)生商業(yè)用量的植物繁殖體。雖然在玉米中繁殖、谷物產(chǎn)量或干物質(zhì)生物量的降低可能阻止或降低特定的木聚糖酶的表達(dá)的價(jià)值，否則特定的木聚糖酶的表達(dá)在化學(xué)加工和動(dòng)物飼料工業(yè)中將是有價(jià)值的，但是同樣的酶在柳枝稷、芒草、高粱或甘蔗中的表達(dá)可能不僅提供由酶本身產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且從監(jiān)管和安全角度來說也可以具有益處。同樣地，當(dāng)在不同組織中表達(dá)，或在不同作物的同一組織中表達(dá)時(shí)，作物組織中表達(dá)的酶的價(jià)值可能不同。取決于作物的種類和酶表達(dá)所賦予的新性質(zhì)，特定的作物組織(如谷物、種子、樹葉、莖桿、根、花、花粉等)可能具有不同的價(jià)值，從而產(chǎn)生了不同的效益。當(dāng)在玉米中組成型表達(dá)時(shí)，特異性木聚糖酶和纖維素酶具有顯著的農(nóng)藝效應(yīng)和表型效應(yīng)。這些酶單獨(dú)或結(jié)合地組成型表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致矮化植物、不育植物或低產(chǎn)量和農(nóng)藝性能的植物。然而，特異性木聚糖酶和纖維素酶的種子特異性表達(dá)可能降低或消除任何不良農(nóng)藝效應(yīng)或產(chǎn)量的降低，卻仍然能夠提供高水平的酶。這在玉米中是有益的。在柳枝稷、芒草、飼料或甜高粱或甘蔗中生產(chǎn)相同的酶可能導(dǎo)致木聚糖酶或纖維素酶的種子特異性表達(dá)具有不同的屬性，其中，與玉米相比較時(shí)，基于每英畝的谷物產(chǎn)量可能相當(dāng)?shù)汀?br> 具體實(shí)施方式
包括在任何種類轉(zhuǎn)基因植物中的CWDE種子特異性地表達(dá)。根據(jù)應(yīng)用，如生產(chǎn)動(dòng)物飼料、生產(chǎn)肉或乳制品、生產(chǎn)禽肉、生產(chǎn)紙或生產(chǎn)發(fā)酵性糖，其中，含有酶的谷物可以與其它收獲原料(經(jīng)預(yù)處理的或未經(jīng)預(yù)處理的)混合，這是在玉米或其它谷物和種子中提供有效劑量的酶的非常有效的方式。植物表達(dá)酶的凈經(jīng)濟(jì)價(jià)值可能不同，這取決于酶被設(shè)計(jì)為定位和積累在哪里，以及酶的靶標(biāo)位置在哪。例如，當(dāng)特異性木聚糖酶和纖維素酶被靶向至植物細(xì)胞壁時(shí)，它們可能具有顯著的表型效應(yīng)和農(nóng)藝效應(yīng)，但當(dāng)將它們保持在細(xì)胞內(nèi)或靶向至液泡時(shí)，效應(yīng)就很小或沒有效應(yīng)。將細(xì)胞內(nèi)包含的酶的來源應(yīng)用到需要把酶和底物混合的情況，可能會(huì)創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。相反，相同的酶可能在混合應(yīng)用中，如在動(dòng)物飼料或處理經(jīng)預(yù)處理的生物量中提供價(jià)值，這些酶在自處理應(yīng)用中可能提供很小的價(jià)值或不提供價(jià)值，其中，對于植物細(xì)胞壁的靶向性優(yōu)選地形成可發(fā)酵的糖類或易消化的糖類，但由于表型或農(nóng)藝效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生問題。如上所述，外源酶能夠在特定的植物、植物器官、植物組織、植物細(xì)胞或植物亞細(xì)胞區(qū)域或區(qū)室中表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方式包括在植物、植物區(qū)域、植物器官、植物組織或植物亞細(xì)胞區(qū)域或區(qū)室中表達(dá)外源酶。實(shí)施方式還包括具有外源酶的植物，其中，所述外源酶存在于整個(gè)植物中或定位于植物區(qū)域、植物器官、植物組織或植物亞細(xì)胞區(qū)域或區(qū)室中?？梢蕴峁┻m于或具有外源CWDE在細(xì)胞質(zhì)中積累的轉(zhuǎn)基因植物?？梢栽O(shè)計(jì)外源酶在植物的什么位置表達(dá)以及在何種植物中表達(dá)，設(shè)計(jì)要考慮的因素包括但并不局限于以上所述的表型、安全、經(jīng)濟(jì)或監(jiān)管問題。本發(fā)明的實(shí)施方式中提供了植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體。所述蛋白質(zhì)可以是酶，所述酶可以是但不局限于細(xì)胞壁降解酶。提供了一些被設(shè)計(jì)為表達(dá)特異性細(xì)胞壁降解酶的植物。所述植物可能具有工業(yè)和/或農(nóng)業(yè)應(yīng)用。提供了制備表達(dá)載體和植物的方法和材料。還提供了在工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中使用植物的工藝。提供了載體,該載體在植物中(in planta)用于表達(dá)細(xì)胞壁降解酶(或CWDE)或是內(nèi)含子修飾的CWDE變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體適用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體適用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。CWDEs可以選自但不限于木聚糖酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶(arabinofuranosidase)以及阿魏酸酯酶，其中，載體或植物中的CWDE來自所述CWDEs。在一個(gè)實(shí)施方式中，CffDE編碼序列被嵌入的內(nèi)含子序列中斷。嵌入的內(nèi)含子序列可能使相應(yīng)的CWDE的功能失活。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體設(shè)計(jì)允許嵌入至少三至四個(gè)基因表達(dá)盒和/或基因沉默盒。每個(gè)所述盒可以包括CWDE或內(nèi)含子修飾的CWDE。在一個(gè)實(shí)施方式中，在本發(fā)明的載體或其構(gòu)建過程中所使用的遺傳元件能夠提供至少一種下述特性植物轉(zhuǎn)化后篩選轉(zhuǎn)基因事件的能力，在細(xì)胞中影響基因表達(dá)的最佳水平的能力或影響所需亞細(xì)胞酶靶向的能力。載體可以包括篩選標(biāo)記，所述篩選標(biāo)記可以是但不限于大腸桿菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)基因。除了或代替PMI標(biāo)記的其它可被包括的篩選標(biāo)記(如但不限于EPSPS、BAR、npt-II、⑶S等)是本領(lǐng)域所熟知的。所述載體還可以 包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是組成型的或是整體型的、組織特異性的、種子特異性的、葉子特異性的、器官特異性的、亞細(xì)胞區(qū)域或區(qū)室特異性的或發(fā)育階段特異性的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括帶有第一內(nèi)含子(登錄號(hào)為AY954394，SEQ ID NO: I)的水稻泛素3基因啟動(dòng)子(OsUbi3P)或水稻肌動(dòng)蛋白I基因啟動(dòng)子(登錄號(hào)為S44221，SEQ ID NO:2)。也可以使用其它組成型啟動(dòng)子，例如但不限于玉米泛素啟動(dòng)子(SEQ ID N0:3)，并且用于代替OsUbi3P或水稻肌動(dòng)蛋白I啟動(dòng)子。泛素3基因啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白I基因啟動(dòng)子是組成型和整體型啟動(dòng)子，能夠用于在轉(zhuǎn)基因植物中提供基因表達(dá)。在載體中還可以提供來自帶有自身信號(hào)序列的水稻GluB-4基因(登錄號(hào)為AY427571，SEQ ID NO:4)的谷蛋白啟 動(dòng)子。所述谷蛋白啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子。在載體中可以提供其它種子特異性啟動(dòng)子(例如但不限于玉米醇溶蛋白Zc2啟動(dòng)子，SEQ ID N0:5)。為了將酶送遞到它們相應(yīng)的底物或位置為了實(shí)現(xiàn)高水平的酶積累(如液泡)，在載體中可提供各種靶向信號(hào)序列。可在CffDE或編碼CWDE的載體中提供的靶向信號(hào)序列包括但不限于PRla(SEQ ID NO:6，由SEQID NO:7的核酸序列編碼)，BAASS(SEQ ID NO:8，由SEQ ID NO:9的核酸序列編碼)，以及大麥半胱氨酸蛋白酶(aleurain) (SEQ ID N0:10，由SEQ ID NOill的核酸編碼)。其它可以被包括的靶向序列包括但不限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留序列SEKDEL(SEQ ID NO: 12，由SEQIDNO: 13 的核酸編碼)，以及消減(abridged)序列 KDEL(SEQ ID NO: 10，由 SEQID NO: 16 的核酸編碼)。也可以提供不帶有靶向序列的酶?？梢蕴峁┟敢允沟盟鼈冊诩?xì)胞質(zhì)內(nèi)積累?？梢蕴峁┺D(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明的基因表達(dá)盒實(shí)施例中使用了來自農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂堿合成酶基因的有效的轉(zhuǎn)錄終止子序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包括編碼CWDE的核酸或編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CWDE的核酸。所述編碼CWDE的核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列。編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CWDE的核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一個(gè)信號(hào)序列或任何一個(gè)內(nèi)含子。核酸可以編碼與選自 SEQ ID N0S:44-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQIDN0S:44-45、49-54、57_59、85-86,94-96,104-109 和 113-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQ ID N0S:47和55的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQ ID N0S:46、48和56的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、
93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQID NOS:60-67,70 和 75 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQID N0S:68-69、71-74、76-77和112的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自 SEQ ID N0S:78-84 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、
98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQID N0S:97_103的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自 SEQ ID NOS:87-93 110-111 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、
94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQID N0S:44、45、49和 54 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQ ID N0S:45、87、104-106和113的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自 SEQ ID NOS:50-53、57-59、94-96、104-109 和 113-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。核酸可以編碼與選自SEQID NOS:54-56 和 60-65 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的蛋白質(zhì)。編碼與所引用的參照序列具有小于100%同一性的蛋白質(zhì)的上述任何核酸可以編碼這樣一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)具有相同或基本相同的活性?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的測定方法對任何特定的蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行評估。可以使用在本發(fā)明的實(shí)施例或?qū)嵤├囊徊糠种兴龅姆椒▽钚赃M(jìn)行評估。所謂基本相同的活性也是本 領(lǐng)域所熟知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在20%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在15%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在10%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在5%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和與所引用的參照序列具有100%同一性的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在1%以內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方式中可以單獨(dú)，或作為其他核酸的一部分，或作為載體的一部分或如上所述作為轉(zhuǎn)基因植物的一部分提供上述核酸?？梢杂檬访芩?沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)測量同一性(Smith TF, Waterman MS (1981),“Identification of Common Molecular Subsequences, ”Journal of Molecular Biology147:195-197，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過援弓I的方式納入本文，如同將其全文抄錄在此一樣)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物可以源自玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱的其中一種。轉(zhuǎn)基因植物可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化使用具有如上所述的核酸序列的質(zhì)粒來制備。所述質(zhì)粒具有與選自 SEQ ID N0S:188-283 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的序列。所述質(zhì)?；旧嫌膳c選自SEQ ID N0S: 188-283的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列組成。所述質(zhì)粒由與選自SEQ ID N0S:188-283的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物包括與編碼CWDE或編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CWDE的參照核酸相雜交的核酸。編碼CWDE的參照核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列。編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CffDE的參照核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一個(gè)信號(hào)序列或任何一個(gè)內(nèi)含子。包括在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的核酸可以被稱為第一核酸。所述第一核酸能夠在低嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。所述第一核酸能夠在中嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ IDN0S: 116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。所述第一核酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。所述第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S:116-117、121-126、129-131、157-158、166-168、176-181和185-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 119和127的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQID NOS: 118、120和128的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 132-139、142和147的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQID N0S: 140-141、143-146、148-149和184的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 150-156的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 169-175的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 159-165和182-183的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S:116、117、121和126的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S:117、159、176-178和185的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自 SEQ IDN0S: 122-125、129-131、166-168、176-181 和 185-187 的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。第一核酸能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與由選自SEQ ID N0S: 126-128和132-137的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列所組成的第二核酸雜交。用于最佳雜交試驗(yàn)的雜交試驗(yàn)和方法的實(shí)例在下列書中有記載由冷泉港實(shí)驗(yàn)室的T. Maniatis, E.F. Fritsch,和 J. Sambrook 撰寫的《分子克隆》，1982 出版；由 F. M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl 撰寫的《分子生物學(xué)中的當(dāng)前協(xié)議(Current Protocols in Molecular Biology)》，卷 I, John Wiley & Sons,2000，所述文獻(xiàn)通過援引的方式納入本文，如同將其全文抄錄在此一樣。通過示例而不是限制的方式，中嚴(yán)格度條件下的雜交程序如下在含有6X SSC(Amresco, Inc.，Solon, 0H)、0. 5%SDS (Amersco, Inc. , Solon, OH)、5X Denhardt 溶液(Amersco, Inc. , Solon, OH)、以及100 u g/mL 變性的鮭魚精 DNA(Invitrogen Life Technologies, Inc. , Carlsbad, CA)的溶液中，于68°C預(yù)處理含有DNA的過濾器(filters) 2-4小時(shí)。使用的每平方厘米的膜使用大約0. 2mL的預(yù)處理的溶液。在相同的溶液中進(jìn)行雜交并具有以下修飾使用0. OlMEDTA (Amersco, Inc. , Solon, OH) > 100 u g/mL 娃魚精 DNA、以及 5_20X106cpm32P-標(biāo)記或突光標(biāo)記探針。在雜交混合物中于68°C培養(yǎng)過濾器16-20小時(shí)，然后在含有2X SSC和0. 1%SDS的溶液中在室溫下(25°C ±5°C)輕微攪拌清洗過濾器15分鐘。用含有0. IX SSC^PO. 5%SDS的溶液代替清洗液，輕微攪拌下于68°C再培養(yǎng)2小時(shí)。涂抹干燥過濾器，暴露于成像器中或通過放射自顯影成像(development)。如果需要的話，可以第三次清洗過濾器并再次暴露成像。通過示例而不是限制的方式，低嚴(yán)格度涉及使用低溫進(jìn)行雜交的雜交條件，例如在370C _60°C之間的溫度。通過示例而不是限制的方式，高嚴(yán)格度涉及如上所述的雜交條件，但是不同的是使用高溫，例如雜交溫度高于68°C。與所引用的參照序列具有小于100%同一性的如上所述的任何核酸可以編碼這樣一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有相同或基本相同的活性?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的測定方法對任何特定的蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行評估?？梢允褂迷诒景l(fā)明的實(shí)施例或?qū)嵤├囊徊糠种兴龅姆椒▽钚赃M(jìn)行評估。所謂基本相同的活性也是本領(lǐng)域所熟知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在20%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在15%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在10%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在5%以內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，基本相同的活性是指所述蛋白質(zhì)的活性和由與所引用的參照序列具有100%同一性的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相比，其活性差異在1%以內(nèi)。轉(zhuǎn)基因植物可以源自玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱的其中一種。轉(zhuǎn)基因植物可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化使用包括任何上述的核酸的質(zhì)粒制備。·在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種載體，所述載體包括編碼CWDE或編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CWDE的核酸。編碼CWDE的核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列。編碼被至少一個(gè)信號(hào)序列或內(nèi)含子修飾的CWDE的核酸序列可以編碼任何CWDE氨基酸序列以及至少任何一個(gè)信號(hào)序列或任何一個(gè)內(nèi)含子。核酸可以編碼與選自SEQ IDN0S:44-115 的序列具有至少 70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的蛋白質(zhì)。核酸序列可以在低嚴(yán)格度條件下與由SEQID N0S: 116-187或其互補(bǔ)序列之一的序列組成的參照核酸雜交。核酸序列可以在中嚴(yán)格度條件下與由SEQ ID N0S: 116-187或其互補(bǔ)序列之一的序列組成的參照核酸雜交。核酸序列可以在高嚴(yán)格度條件下與由SEQID N0S: 116-187或其互補(bǔ)序列之一的序列組成的參照核酸雜交。載體可以包括與選自SEQ ID N0S: 188-283 的序列具有 70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%同一性的序列。載體基本上可以由與選自SEQID N0S:188-283的序列具有70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的序列組成。載體可以由與選自SEQ IDN0S: 188-283 的序列具有 70、72、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的序列組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將編碼SEQ ID NOS:44-115的任何氨基酸序列的至少一部分的分離的核酸、多核苷酸或寡核苷酸用作雜交探針或引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將所述分離的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的互補(bǔ)序列用作雜交探針或引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將包括一個(gè)序列的分離的核酸用作雜交探針或弓I物，所述序列能夠在低、中或高嚴(yán)格度條件下與具有SEQ ID N0S: 116-187和188-283的或其互補(bǔ)的任何一個(gè)序列的核酸的至少一部分雜交。這些分離的核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有但不限于10-100、10_90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20 或 10-15 個(gè)核苷酸的長度，或20-30個(gè)核苷酸的長度，或25個(gè)核苷酸的長度。本文所述的核苷酸序列的長度范圍包括在所述范圍內(nèi)的核苷酸序列的每個(gè)長度，也包括所述范圍的終點(diǎn)。所述核苷酸的長度可以從參照序列內(nèi)的任何單一位置開始，只要該位置之后的核苷酸長度還能夠滿足所述長度。在一個(gè)實(shí)施方式中，在編碼選自SEQ ID N0S:44-115其中之一的蛋白質(zhì)的核酸或其互補(bǔ)序列中，雜交探針或引物與一種核酸具有85-100%、90-100%、91-100%、92-100%、93-100%、
94-100%、95-100%、96-100%、97-100%、98-100%、99-100% 或 100% 的互補(bǔ)性，所述核酸具有與所述探針或引物相同的長度并具有選自與所述探針或引物的長度相應(yīng)的核苷酸的長度的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，在具有SEQ ID N0S:116-283的其中之一的序列的核酸中，雜交探針或引物與一種核酸具有 85-100%、90-100%、91-100%、92-100%、93-100%、94-100%、
95-100%,96-100%,97-100%,98-100%,99-100%或100%的互補(bǔ)性，所述核酸具有與所述探針
或引物相同的長度并具有選自與所述探針或引物的長度相應(yīng)的核苷酸的長度的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交探針或弓I物沿著它的長度與相應(yīng)長度的編碼SEQID NOS: 44-115的之一的序列的核酸或所述核酸的互補(bǔ)序列雜交。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交探針或引物沿著它的長度與相應(yīng)長度的具有SEQ ID N0S: 116-187的之一的序列的核酸或其互補(bǔ)序列雜交。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交可能在低嚴(yán)格度條件下發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交可能在中嚴(yán)格度條件下發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交可能在高嚴(yán)格度條件下發(fā)生。本發(fā)明實(shí)施方式中的分離的核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括天然核苷酸、天然核苷酸類似物或合成的核苷酸類似物。本發(fā)明實(shí)施方式中的核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)的任何種類的核酸。本發(fā) 明列舉的核酸序列被列為DNA序列，但本發(fā)明的實(shí)施方式還考慮到了其它核酸，包括其中以U替代T的RNA序列。盡管在本發(fā)明的實(shí)施方式中可以使用未標(biāo)記的雜交探針或引物，但是雜交探針或引物也可以帶有可檢測的標(biāo)記，并能夠用于檢測、測序或合成核酸。示例性標(biāo)記包括但不限于放射性核素、光吸收性化學(xué)基團(tuán)、染料以及熒光基團(tuán)。標(biāo)記可以是熒光基團(tuán)，如6-羧基熒光素(FAM)、6_羧基-4，7，2，，7，-四氯熒光素(TET)、羅丹明、JOE (2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基熒光素)、HEX (六氯-6-羧基熒光素)或VIC。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了處理植物生物量的方法。所述方法可以包括通過將植物或其部分與液體混合形成液固比小于或等于15的混合物，來預(yù)處理植物或其部分。所述預(yù)處理可以包括提供條件以保持混合物在小于或等于100°C的溫度下。所述方法可以包括提供一種或多種酶的步驟。植物生物量可以是或源自任何植物或其部分。植物生物量可以是或源自本發(fā)明所描述、說明或要求保護(hù)的任何轉(zhuǎn)基因植物或其部分。所述方法可以包括不是本發(fā)明所描述、說明或要求保護(hù)的任何轉(zhuǎn)基因植物或其部分，并且與本發(fā)明所描述、說明或要求保護(hù)的任何轉(zhuǎn)基因植物或其部分相結(jié)合?；旌衔镏械囊汗瘫鹊谋戎悼梢孕∮诨虻扔?25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I。液固比可以是8或更小。液固比可以是8。預(yù)處理的步驟可以包括保持溫度小于或等于100°C至少4小時(shí)。預(yù)處理的步驟可以包括保持溫度40°C-90°C。制備混合物所使用的液體可以是任何液體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述液體是水。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述液體包括水、亞硫酸氫銨以及碳酸銨。亞硫酸氫銨可以是任何適合的濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中，亞硫酸氫銨的濃度值為植物或其部分的8%-38%重量百分比(包括端點(diǎn)的濃度值)。碳酸銨可以是任何適合的pH。在一個(gè)實(shí)施方式中，碳酸銨的pH在7. 6-8. 5范圍內(nèi)，包括端點(diǎn)的pH值。碳酸銨的濃度可以是任何適合的濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中，碳酸銨的濃度值為植物或其部分的4%-19%重量百分比(包括端點(diǎn)的濃度值)。所述提供一種或多種酶的步驟可以包括提供任何適合處理植物生物量的酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述一種或多種酶包括至少一種能夠水解木質(zhì)素纖維物質(zhì)的酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或多種酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、3 -葡糖苷酶、纖維二糖水解酶或木聚糖酶中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或多種酶包括木聚糖酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶(arabinofuronosidase)或阿魏酸酯酶中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括提供一種或多種酶的步驟，其中所述一種或多種酶不是木聚糖酶，然后將添加木聚糖酶作為另外的步驟。本發(fā)明的任何單一的實(shí)施方式可以用本發(fā)明任何一個(gè)或多個(gè)其它實(shí)施方式中的一個(gè)或多個(gè)要素進(jìn)行補(bǔ)充。實(shí)施例——提供下述非限制性的實(shí)施例以說明具體的實(shí)施方式。整個(gè)實(shí)施方式都可以用下面任何一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)節(jié)進(jìn)行補(bǔ)充。實(shí)施例1-pSBll參見圖I,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中的載體可以以pSBll中間質(zhì)粒(pBR322的一 種衍生物)為基礎(chǔ)。pSBll從日本煙草公司(Japan Tobacco)獲得。pSBll質(zhì)粒適合克隆并容易在大腸桿菌中維持。通過使用PSBll與pSBl “超二元”受體載體(非致瘤Ti質(zhì)粒)中都存在的cos和ori位點(diǎn)進(jìn)行的同源重組，從而將兩個(gè)載體相偶聯(lián)，能夠維持在LB4404農(nóng)桿菌菌株內(nèi)。集成產(chǎn)品代表了能夠用于隨后的植物轉(zhuǎn)化的雜交載體。PSBl包括毒力基因如virB、virC和virG，這些基因?qū)τ赥-DNA的處理和送遞至植物細(xì)胞是必需的。pSBll具有多重克隆位點(diǎn)，所述克隆位點(diǎn)包括用于克隆帶有目標(biāo)基因序列的表達(dá)盒的獨(dú)特的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。實(shí)施例2-pAG1000參見圖2A，通過對pSBll進(jìn)行修飾以便使其能夠接受幾個(gè)基因表達(dá)盒，從而形成pAGlOOO。首先，從pN0V2819質(zhì)粒(Syngenta Biotechnology)中克隆出原始表達(dá)盒，并以HindIII-KpnI片段的形式克隆至pSBll中以形成pAGlOOO，所述原始表達(dá)盒包括陽性篩選標(biāo)記基因manA，所述基因編碼由夜香木黃曲葉病毒啟動(dòng)子(CMPS)驅(qū)動(dòng)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)。實(shí)施例3-pAG1001，pAG1002 和 pAG1003通過將pAGlOOO進(jìn)一步修飾，移除EcoRI位點(diǎn)(核苷酸位置#7)從而形成PAG1001 (圖2B)，然后移除KpnI位點(diǎn)(核苷酸位置#1)從而形成pAG1002 (圖2C)。這些修飾使得EcoRI和KpnI位點(diǎn)可以用于后續(xù)克隆帶有所關(guān)注基因(GOI)的表達(dá)盒。參見圖3A，下述的新多重克隆位點(diǎn)(MCS)序列,包括 PacI、XhoI、SnaBI、NcoI、KpnI、XmaI、AvrII、EcoRI位點(diǎn)，是通過PCR合成為249bp的PmeI-HindIII片段，并被克隆至pAG1002的PmeI-HindIII位點(diǎn)中，從而提供PAG1003載體。> MCSGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAACCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCTTAATTAAGTCTAACTCGAGTTACTGGTACGTACCAAATCCATGGAATCAAGGTACCATCAATCCCGGGTATTCATCCTAGGTATCCAAGAATTCATACTAAAGCTT(SEQ ID NO: 17)實(shí)施例4_pAG2000參見圖3B，可以通過用水稻泛素3啟動(dòng)子(SEQ ID NO: I)代替pAG1003中的病毒CMPS啟動(dòng)子來提供高表達(dá)水平，水稻泛素3啟動(dòng)子(SEQ ID NO: I)是一個(gè)被廣泛研究并被證明在單子葉植物中對基因表達(dá)有效的啟動(dòng)子。0sUbi3P已經(jīng)從pRESQlOl質(zhì)粒中被克隆。pRESQlOl記載于E. Sivamani> J. D. Starmer和R. Qu的“用于改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水稻泛素3啟動(dòng)子基因表達(dá)盒的序列分析”，植物科學(xué)，177(6) :549-556，2009,該文獻(xiàn)通過援引的方式納入本文，如同將其全文抄錄在此一樣。為了進(jìn)行克隆，對OsUbi3P進(jìn)行了如下的修飾1)通過PCR方法將EcoRI位點(diǎn)引入5’端；2)移除XmaI位點(diǎn)，將BamHI位點(diǎn)加入到3’端。0sUbi3P的部分序列被組裝為pBluescript中的ApaI-BamHI片段，然后克隆為HindIII-BamHI的整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，所述區(qū)域包括與pAG1003經(jīng)HindIII-SpeI消化后產(chǎn)生的PMI相融合的第一泛素內(nèi)含子。這后一次克隆產(chǎn)生了 PAG2000載體。實(shí)施例5-pAG2004 和 pAG2005將pAG2000載體進(jìn)行進(jìn)一步修飾，以便形成克隆載體，所述克隆載體適于接受GOI表達(dá)盒，而且能提供用于植物轉(zhuǎn)化的PMI篩選標(biāo)記的增強(qiáng)表達(dá)。PMI表達(dá)的優(yōu)化過程包括用新的9nt序列替代pAG2000中連接0sUbi3內(nèi)含子與起始PMI基因密碼子的原始連接序列(如下SEQ ID NO: 18所示)。下述SEQ ID NO: 18中，用下劃線標(biāo)注的是原始連接序列，用粗體標(biāo)注的是起始密碼子。下述SEQ ID N0:19中，用方框標(biāo)注的是新的9nt序列。據(jù)E. Sivamani和R. Qu (2006)報(bào)道，用方框標(biāo)注的序列作為有效序列能夠有效地在pRESQ48中提供高水平的瞬間GUS表達(dá)，該文獻(xiàn)通過援引的方式納入本文，如同將其全文抄錄在此一 樣。這個(gè)9nt序列代表了水稻泛素3基因的三個(gè)起始密碼子，其中起始密碼子ATG已經(jīng)被修飾為ATC以便消除附加的翻譯起始位點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)這一修飾，PAG2000中的BglII-XcmI片段(核苷酸位置9726-105)被PCR合成的片段代替，所述PCR合成的片段包括所需的9nt連接序列，并在連續(xù)反應(yīng)中使用引物P64/P68、P64/P66和P64/P67形成。pAG2000 的 BglII-XcmI 片段(核苷酸位置 9726-105)AgatctgttgtcctgtagttacttatgtcagttttgttattatctgaagatatttttggttgttgcttgttgatgtggtgtgagctgtgagcagcgctcttatgattaatgatgctgtccaattgtagtgtagtatgatgtgattgatatgttcatctattttgagctgacagtaccgatatcgtaggatctggtgccaacttattctccagctgcttttttttacctatgttaattccaatcctttcttgcctcttccagGGATCCCCGATC ATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGGGCAGCAAAACGGCGTTGACTGAACTTTATGGTATGGAAAATCCGTCCAGCCAGCCGATGG(SEQ ID NO :18)用于pAG2004構(gòu)建的PCR合成的BglII-XcmI片段Agatctgttgtcctgtagttacttatgtcagttttgttattatctgaagatatttttggttgttgcttgttgatgtggtgtgagctgtgagcagcgctcttatgattaatgatgctgtccaattgtagtgtagtatgatgtgattgatatgttcatctattttgagctgacagtaccgatatcgtaggatctggtgccaacttattctccagctgcttttttttacctatgttaattccaatcctttcttgcctcttccag {aIc5\(]AT/\{ATG CAGAAACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGGGCAGCAAAACGGCGTTGACTGAACTTTATGGTATGGAAAATCCGTCCAGCCAGCCGATGG(SEQ ID NO :19)
權(quán)利要求
1.ー種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括編碼氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列與選自SEQ ID NOS:44-115的序列具有至少90%的同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDN0S: 44-45、49-54、57-59、85-86、94-96、104-109 和 113-115 的序列具有至少 90% 的同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQID N0S:47和55的序列具有至少90%的同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQID NOS:46,48和56的序列具有至少90%的同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDN0S:60-67、70和75的序列具有至少90%的同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDN0S:68-69、71-74、76-77和112的序列具有至少90%的同一性。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDNOS:78-84的序列具有至少90%的同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDNOS:97-103的序列具有至少90%的同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDNOS:87-93和110-111的序列具有至少90%的同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQID NOS:44,45、49和54的序列具有至少90%的同一性。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQID NOS:45,87、104-106和113的序列具有至少90%的同一性。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDN0S:50-53、57-59、94-96、104-109 和 113-115 的序列具有至少 90% 的同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDNOS:44-115的序列具有至少95%的同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述氨基酸序列與選自SEQIDNOS:44-115的序列具有100%的同一性。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱中的ー種。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是柳枝稷。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物通過使用質(zhì)粒由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化制得，所述質(zhì)粒含有與SEQ IDNOS:188-283之一的序列具有至少90%的同一'注的核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物通過使用質(zhì)粒由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化制得，所述質(zhì)粒含有與SEQ IDNO: 207的序列具有至少90%的同一性的核苷酸序列。
20.ー種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括第一核酸，所述第一核酸能夠在中嚴(yán)格度條件下與第二核酸雜交，所述第二核酸由選自SEQ IDNOS:116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述第一核酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與所述第二核酸雜交，所述第二核酸由選自SEQ IDN0S: 116-187的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米、柳枝稷、芒草、甘蔗或高粱中的ー種。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米。
24.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物是柳枝稷。
25.根據(jù)權(quán)利要求20-24中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物通過使用質(zhì)粒由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化制得，所述質(zhì)粒含有第一核酸，所述第一核酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與第二核酸雜交，所述第二核酸由SEQID N0S: 116-187之一的序列組成。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-24中任意ー項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物通過使用質(zhì)粒由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化制得，所述質(zhì)粒含有SEQ IDNOS:188-283之一的序列。
27.ー種載體，該載體包括第一核酸，所述第一核酸能夠在高嚴(yán)格度條件下與第二核酸雜交，所述第二核酸由SEQ ID N0S: 116-187之一的序列組成。
28.—種載體，該載體包括核酸，所述核酸具有與選自SEQ ID N0S: 188-283的參照序列具有至少90%的同一性的序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的載體，其中，所述核酸具有與SEQID N0S:207的參照序列具有至少90%的同一性的序列。
30.一種處理植物生物量的方法，該方法包括 通過將植物或其部分與液體混合，形成液固比小于或等于15的混合物，并提供條件使所述混合物的溫度保持在小于或等于100°C，從而對植物或其部分進(jìn)行預(yù)處理；以及 提供ー種或多種酶，以進(jìn)行木質(zhì)纖維素材料的酶促水解。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述植物是權(quán)利要求1-26中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，所述方法還包括提供權(quán)利要求1-26中任意一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液固比選自小于或等于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液固比為8或更小。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-34中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述預(yù)處理的步驟包括保持溫度小于或等于100°c至少4小時(shí)。
36.根據(jù)權(quán)利要求30-35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述小于或等于100°C的溫度范圍為 40°C -90°C。
37.根據(jù)權(quán)利要求30-36中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體是水。
38.根據(jù)權(quán)利要求30-36中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述液體包括水、亞硫酸氫銨和碳酸銨。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，按照wt./wt.計(jì)算，以所述植物或其部分為基準(zhǔn)，所述亞硫酸氫銨的濃度是8%-38%。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的方法，其中，按照wt./wt.計(jì)算，以所述植物或其部分為基準(zhǔn)，所述碳酸銨的濃度是4%-19%，溶液的pH為7. 6-8. 5。
41.根據(jù)權(quán)利要求30-40中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述提供ー種或多種酶的步驟包括提供內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纖維ニ糖水解酶中的至少ー種。
42.根據(jù)權(quán)利要求30-41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述提供ー種或多種酶的步驟包括提供木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體。所述蛋白質(zhì)可以是酶類，所述酶可以是但不限于細(xì)胞壁降解酶。本發(fā)明提供了多種被設(shè)計(jì)用來表達(dá)特異性細(xì)胞壁降解酶的植物。所述植物可具有工業(yè)和/或農(nóng)業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明提供了用于制備表達(dá)載體和植物的方法和材料。還提供了植物在工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的工藝。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102711446SQ201080060542
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者N·?？吮? O·布格瑞, R·M·萊布, V·薩莫伊洛夫 申請人:谷萬達(dá)公司