專(zhuān)利名稱(chēng)：：植物細(xì)胞壁降解酶之間的融合蛋白及其用途的制作方法植物細(xì)胞壁降解酶之間的融合蛋白及其用途本發(fā)明涉及構(gòu)建并超量生產(chǎn)經(jīng)遺傳加工的多功能的植物細(xì)胞壁降解酶，以及它們作為用于回收再利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的改良的酶工具的用途。農(nóng)業(yè)廢物是用于木質(zhì)纖維生物轉(zhuǎn)化的巨大的可再生資源。食品工業(yè)的生產(chǎn)每天都生成了大量的這些被當(dāng)作需廢棄的污染性廢物的副產(chǎn)品。在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，己經(jīng)對(duì)這些副產(chǎn)品的回收再利用做了很多研究。在可回收再利用的組分中，阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基-肉桂酸)是非常吸引人的酚化合物，已知它是植物界中最為豐富的羥基肉桂酸。例如，阿魏酸可以用作抗氧化劑(23)或者可以通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)化成"天然的"香草醛，這是一種用于食品、化妝品和制藥工業(yè)中的昂貴的香料(4,26)。在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中，玉米和小麥麩皮都是潛在的底物，因?yàn)樗鼈兊闹参锛?xì)胞壁內(nèi)都有著高含量的阿魏酸，分別為3%和l%(w/w)(43)。在植物生理學(xué)中，阿魏酸是一種有著重要理化性能的植物細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)組分。事實(shí)上，它可以作為木質(zhì)素和碳水化合物之間或碳水化合物本身之間的交聯(lián)劑(16)，影響著細(xì)胞壁的完整性，并因此降低微生物酶造成的生物可降解性的程度(6)。微生物進(jìn)化出能夠水解將阿魏酸連接于植物細(xì)胞壁多糖上的酯鍵的酶，例如阿魏酸酯酶(EC3.1丄73)。這些酶為其他的木質(zhì)纖維素裂解酶提供了對(duì)多糖骨架的更為有利的可接近性(綜述見(jiàn)于12)。先前的研究證實(shí)阿魏酸酯酶與主鏈降解酶例如p-(l,4)-內(nèi)切木聚糖酶(p-(l,4)-endoxylanase)協(xié)同作用，以便增加植物細(xì)胞壁釋放阿魏酸，并生成應(yīng)用所必需的足夠量的阿魏酸(2,15,50)。絲狀真菌例如黑曲霉G4^^^7/usw/ger)是公知的植物細(xì)胞壁降解酶的生產(chǎn)者。己經(jīng)從黑曲霉中克隆出兩個(gè)不同的編碼阿魏酸酯酶的基因(10,11)，并在巴斯德畢赤氏酵母CP/c/^poston》和黑曲霉中超量生成了相應(yīng)的重組蛋白(24,30,41)。己經(jīng)純化并表征出一些真菌的阿魏酸酯酶(18,47)，但是還沒(méi)有克隆出基因。先前研究報(bào)道從繩狀青霉(PemW///"m/w"/cw/w謂)中分離出了第一個(gè)具有與碳水化合物結(jié)合分子(CBM)家族l非常相似的C末端區(qū)的真菌的肉桂酸酯酶(B型)(27)。許多來(lái)自厭氧和需氧微生物的糖基水解酶都有著模塊(modular)結(jié)構(gòu)。除了催化區(qū)外，一個(gè)或多個(gè)非催化的CBM可以位于N末端或C末端或者位于兩端。CBM已經(jīng)被分成具有相似的氨基酸序列和3D結(jié)構(gòu)的家族(http:〃afinb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html)。CBM在不可溶性底物的降解方面有著重要作用(45)。例如，它們負(fù)責(zé)保持催化核心區(qū)接近于底物，增加接觸的作用時(shí)間和親密性。此夕卜，在一些情況中，CBM也可以通過(guò)削弱簇集纖維素鏈的氫鍵來(lái)變更纖維素的微纖維結(jié)構(gòu)(13,14,33)。本發(fā)明涉及關(guān)于真菌例如黑曲霉的游離的和融合的細(xì)胞壁降解酶之間的協(xié)同作用的想法。在最近一個(gè)基于經(jīng)遺傳加工的細(xì)菌纖維素體的研究中，兩個(gè)催化組分的物理接近容許觀察到增加了對(duì)頑強(qiáng)底物的協(xié)同作用(17)。本發(fā)明者據(jù)此設(shè)計(jì)出了連接真菌的阿魏酸酯酶和梭狀芽孢桿菌的停靠蛋白(Dockerin)區(qū)的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白與第二種酶一起被植入到細(xì)菌的含CBM的骨架蛋白內(nèi)(31)。但是，重組蛋白的產(chǎn)量不足以進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的試驗(yàn)性應(yīng)用，還需要新的策略。在本研究中，發(fā)明者融合了經(jīng)高糖基化連接肽分離開(kāi)的兩個(gè)真菌酶黑曲霉的阿魏酸酯酶(FAEA)和木聚糖酶(XYNB)，獲得了具有增加了的阿魏酸釋放效率的雙功能酶(FLX)。此外，發(fā)明者在第二個(gè)構(gòu)建體中還在該雙功能酶的C末端添加了來(lái)自黑曲霉纖維二糖水解酶B(CBHB)的真菌CBM(FLXLC)。在黑曲霉中成功地生成了兩個(gè)雜交酶，并在生物化學(xué)和動(dòng)力學(xué)方面進(jìn)行了充分表征，最終將其用于釋放天然底物(玉米和小麥麩皮)中的阿魏酸。本研究的目的是通過(guò)使用游離的或融合的酶來(lái)比較阿魏酸釋放效率，以便研究通過(guò)真菌酶的物理接近所生成的酶的協(xié)同作用。此外，在FLXLC構(gòu)建體中還研究了在雙功能酶的C末端添加CBM的作用。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即與應(yīng)用游離的植物細(xì)胞壁降解酶相比較，在植物細(xì)胞壁降解酶(所述酶是那些本身不含CBM的斷的一種嵌合蛋白中，融合體產(chǎn)生了協(xié)同作用。本發(fā)明的主要目的因此是提供植物的不含CBM的細(xì)胞壁降解酶之間的新的融合蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于通過(guò)將所述融合蛋白應(yīng)用于作為底物的植物以及優(yōu)選地農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品來(lái)制備與植物細(xì)胞的細(xì)胞壁相連的感興趣的化合物的新方法。本發(fā)明涉及至少兩個(gè)植物細(xì)胞壁降解酶(所述酶是那些不含C末端的碳水化合物結(jié)合分子(CBM)的酶)和任選地CBM之間的融合蛋白(所述酶和CBM是對(duì)應(yīng)于真菌的天然蛋白或其突變形式的重組蛋白)用于在從植物或植物性副產(chǎn)品中制備位于植物細(xì)胞壁中的感興趣的化合物的過(guò)程中或者在漂白紙漿和紙的過(guò)程中進(jìn)行植物細(xì)胞壁降解的用途。術(shù)語(yǔ)"植物細(xì)胞壁降解酶"指的是能夠執(zhí)行細(xì)胞壁組分例如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的消化的酶。所述融合蛋白中的植物細(xì)胞壁降解酶彼此是相同的或不同的酶。術(shù)語(yǔ)"C末端的碳水化合物結(jié)合分子"指的是對(duì)纖維素具有親和力的分子，所述分子能夠?qū)⑴c其相連的酶靶向于纖維素。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶是選自如下的水解酶-纖維素酶，例如纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶、或(3-葡糖苷酶；-半纖維素酶，例如木聚糖酶；-能夠降解木質(zhì)素的木質(zhì)酶，例如漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、通用過(guò)氧化物酶(versatileperoxidase),或輔助酶例如纖維二糖脫氫酶、和芳香醇氧化酶；-能夠釋放肉桂酸例如阿魏酸并能夠水解半纖維素鏈之間的二阿魏酸交聯(lián)的肉桂酸酯水解酶，例如阿魏酸酯酶、肉桂酸酯酶、和綠原酸水解酶。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶選自阿魏酸酯酶和木聚糖酶。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶對(duì)應(yīng)于來(lái)自選自如下所述真菌的天然的酶或其突變形式-子囊菌綱，例如曲霉屬，更具體的是黑曲霉；-擔(dān)子菌綱，例如密孔菌屬或i/"/oo^/z/"a屬，更具體的是朱紅密孔菌(尸yc"o/omsc/""afZflr/"Mj)、血紅密孑L菌(/^c"o/orwjsa"gw/"e—、或//a/oc>p/'"aW〃osa;本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶對(duì)應(yīng)于來(lái)自曲霉屬例如黑曲霉的天然的酶或其突變形式。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中至少一種不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶是選自如下的阿魏酸酯酶-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A，由SEQIDNO:l表示的核酸編碼；-或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B，由SEQIDNO:3表示的核酸編碼。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途,其中至少一種不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶是如上定義的木聚糖酶，例如以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B，由SEQIDNO:5表示的核酸編碼。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中的CBM蛋白選自來(lái)自真菌的天然酶中或其突變形式中的CBM，所述真菌選自子囊菌綱例如曲霉屬以及更具體的黑曲霉?？梢杂糜诒景l(fā)明的CBM是家族1中的那些CBM。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中CBM是黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的CBM，以SEQIDNO:8表示，由以SEQIDNO:7表示的核酸編碼。本發(fā)明也涉及融合蛋白的如上定義的用途，所述融合蛋白在所述融合蛋白所包含的至少兩個(gè)蛋白之間包含連接物，所述連接物是10到100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，有利地是約為50個(gè)氨基酸的多肽。本發(fā)明更具體地涉及融合蛋白的如上定義的用途，其中在所述融合蛋白所包含的各個(gè)蛋白之間都含有連接物。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用途，其中連接物是高糖基化的多肽，例如黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的以SEQIDNO:10表示的序列，由以SEQIDNO:9表示的核酸編碼。本發(fā)明也更具體地涉及阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任選地CBM之間的融合蛋白的如上定義的用途。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白的如上定義的用途。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白的如上定義的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:10表示的作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示。本發(fā)明也涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的CBM之間的融合蛋白的如上定義的用途。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白的如上定義的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:IO表示的作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白的如上定義的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:10表示的作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的CBM之間的融合蛋白的如上定義的用途。本發(fā)明更具體地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白的如上定義的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:IO表示的作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。本發(fā)明也涉及如上定義的用途，其用于在制備以下感興趣的化合物的過(guò)程中或在漂白紙漿和紙的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞壁降解過(guò)程-生物乙醇；-抗氧化劑，例如阿魏酸或咖啡酸，其是肉桂酸、和羥基酪醇(hydroxytyrosol)、或沒(méi)食子酸；-香料，例如分別通過(guò)阿魏酸或?qū)ο愣顾岬纳镛D(zhuǎn)化而獲得的香草醛或?qū)αu基苯甲醛。本發(fā)明也涉及如上定義的用途，其中所述融合蛋白被直接加入到作為底物的植物或植物性副產(chǎn)品中，或者所述融合蛋白是由經(jīng)編碼所述融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞所分泌的，所述真菌是例如如上提及的真菌以及更具體的是黑曲霉和朱紅密孔菌，所述真菌與作為底物的所述植物或植物性副產(chǎn)品接觸。本發(fā)明也涉及用于從植物或植物性副產(chǎn)品中制備位于植物細(xì)胞壁的感興趣的化合物的植物細(xì)胞壁降解的方法，其中所述方法包括以下步驟-用如上定義的融合蛋白或如上定義的轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞酶性處理植物或植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物；-任選地，用蒸汽閃爆(steamexplosion)對(duì)植物或植物性副產(chǎn)品進(jìn)行物理性處理并聯(lián)合融合蛋白的作用；-任選地，用合適的微生物或酶對(duì)在上面的酶性處理期間從細(xì)胞壁中釋放出的化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；-對(duì)在上面的酶性處理期間從細(xì)胞壁中釋放出的或在上面的生物轉(zhuǎn)化步驟中獲得的感興趣的化合物的回收，以及必要時(shí)的純化。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，經(jīng)融合蛋白處理的植物選自甜菜、小麥、玉米、水稻、或所有用于造紙工業(yè)的樹(shù)木。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，經(jīng)融合蛋白處理的植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物選自麥稈、玉米麩皮、小麥麩皮、水稻麩皮、蘋(píng)果渣、咖啡渣、咖啡副產(chǎn)品、橄欖壓榨廢液。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用于制備作為感興趣的化合物的抗氧化劑的方法，所述方法包括-用包含至少兩種如下的不含CBM的細(xì)胞壁降解酶的融合蛋白處理植物或植物性副產(chǎn)品阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、綠原酸水解酶、木聚糖酶，其中融合蛋白優(yōu)選地選自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、綠原酸水解酶-木聚糖酶；-對(duì)從所述植物或植物性副產(chǎn)品中釋放出的抗氧化劑的回收以及必要時(shí)的純化。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用于制備作為感興趣的抗氧化劑的肉桂酸例如阿魏酸的方法，其中所用的融合蛋白含有如上定義的阿魏酸酯酶和木聚糖酶、以及任選地CBM,且更優(yōu)選地選自SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。有利地，在制備抗氧化劑例如阿魏酸的過(guò)程中，經(jīng)如上定義的融合蛋白處理的植物選自以下植物甜菜、小麥、玉米、水稻；或者經(jīng)如上定義的融合蛋白處理的植物副產(chǎn)品或工業(yè)廢物選自以下副產(chǎn)品或廢物小麥麥稈、玉米麩皮、小麥麩皮、水稻麩皮、蘋(píng)果渣、咖啡渣、咖啡副產(chǎn)品、橄欖壓榨廢液。本發(fā)明也涉及如上定義的用于制備作為感興趣的化合物的香料的方法，所述方法包括-用在如上定義的制備抗氧化劑過(guò)程中使用的融合蛋白處理植物或植物性副產(chǎn)品；.-通過(guò)用選自子囊菌或擔(dān)子菌例如分別為黑曲霉或朱紅密孔菌的微生物產(chǎn)生的非限定的酶接觸所述化合物對(duì)在前述步驟期間從細(xì)胞壁中釋放出的化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；-對(duì)在前述的生物轉(zhuǎn)化步驟中獲得的香料的回收以及必要時(shí)的純化。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用于制備作為感興趣的香料的香草醛的方法，其中所用的融合蛋白選自那些用于制備如上定義的阿魏酸的融合蛋白，以及通過(guò)用由子囊菌或擔(dān)子菌例如分別為黑曲霉或朱紅密孔菌產(chǎn)生的非限定的酶接觸從植物細(xì)胞壁中釋放出的阿魏酸來(lái)實(shí)施生物轉(zhuǎn)化步驟。有利地，在制備香料例如香草醛的過(guò)程中所用的植物和植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物選自上面提及的那些用于制備抗氧化劑的植物和植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物。本發(fā)明也涉及如上定義的用于制備作為感興趣的化合物的生物乙醇的方法，所述方法包括-用包含至少兩種如下的不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶的融合蛋白處理植物或植物性副產(chǎn)品纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、漆酶、過(guò)氧化物酶、芳香醇氧化酶，其中融合蛋白優(yōu)選地選自?xún)?nèi)切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、木聚糖酶-纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)，所述處理有利地可以聯(lián)合對(duì)所述植物或植物性副產(chǎn)品的物理性處理；-通過(guò)使用上述的融合蛋白或分泌融合蛋白的轉(zhuǎn)化的真菌，并聯(lián)合選自纖維素酶、半纖維素酶或酯酶的酶、或選自子囊菌的微生物例如黑曲霉或里氏木霉(7Hc/^Armawwez')，將從前述步驟中獲得的處理過(guò)的植物或植物性副產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖；-用酵母將可發(fā)酵糖生物轉(zhuǎn)化成生物乙醇。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用于制備用于后繼的生物乙醇生產(chǎn)的可發(fā)酵糖的方法，其中融合蛋白選自?xún)?nèi)切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、木聚糖酶-纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)。有利地，用于生物乙醇制備過(guò)程中的植物或植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物選自木材、一年生植物、或農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品。本發(fā)明也涉及用于漂白紙漿和紙的方法，所述方法包括-對(duì)植物或植物性副產(chǎn)品進(jìn)行化學(xué)和物理處理并聯(lián)合包含至少兩種如下的不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶的融合蛋白處理阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、通用過(guò)氧化物酶或纖維二糖脫氫酶；-任選地，用分泌包含至少兩個(gè)如下的不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶的融合蛋白的轉(zhuǎn)化的真菌對(duì)在前述步驟中獲得的處理過(guò)的植物或植物性副產(chǎn)品進(jìn)行生物制槳阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、通用過(guò)氧化物酶或纖維二糖脫氫酶；-用包含至少兩個(gè)如下的不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶的融合蛋白對(duì)在前述步驟中獲得的處理過(guò)的植物或植物性副產(chǎn)品進(jìn)行生物漂白阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、通用過(guò)氧化物酶或纖維二糖脫氫酶。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的用于漂白紙漿和紙的方法，其中在處理植物和植物性副產(chǎn)品的第一個(gè)步驟中所用的融合蛋白選自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-錳過(guò)氧化物酶；在生物制漿步驟中所用的轉(zhuǎn)化的真菌所分泌的融合蛋白選自朱紅密孔菌或黑曲霉過(guò)量產(chǎn)生的阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-錳過(guò)氧化物酶；以及生物漂白步驟所用的融合蛋白選自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-錳過(guò)氧化物酶。本發(fā)明也涉及至少兩種不含C末端的碳水化合物結(jié)合分子(CBM)的植物細(xì)胞壁降解酶和任選地CBM之間的融合蛋白，所述酶和CBM是如上定義的對(duì)應(yīng)于真菌中的天然蛋白或其突變形式的重組蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的融合蛋白，其在所述融合蛋白所包含的蛋白中的至少兩種蛋白之間包含連接物，所述連接物是如上定義的連接物。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任選地CBM之間的融合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的CBM之間的融合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示。本發(fā)明也涉及如上定義的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的CBM之間的融合蛋白。本發(fā)明更具體地涉及如上定義的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:6表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。本發(fā)明也涉及編碼如上定義的融合蛋白的核酸。本發(fā)明更具體地涉及編碼以SEQIDNO:12、14、16和18表示的融合蛋白的核酸，分別以SEQIDNO:ll、13、15和17表示。本發(fā)明也涉及以SEQIDNO:19和21表示的對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:ll和13的核酸，其中用編碼對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:24的阿魏酸酯酶A前體的序列SEQIDNO:23取代序列SEQIDNO:l，所述核酸SEQIDNO:19和21編碼對(duì)應(yīng)于序列SEQIDNO:20和22的融合蛋白的前體蛋白。本發(fā)明也涉及以SEQIDNO:25和27表示的對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:15和17的核酸，其中用編碼對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:30的阿魏酸酯酶B前體的序列SEQIDNO:29取代序列SEQIDNO:3，所述核酸SEQIDNO:25和27編碼對(duì)應(yīng)于序列SEQIDNO:20和22的融合蛋白的前體蛋白。本發(fā)明也涉及經(jīng)如上定義的核酸轉(zhuǎn)化的載體例如pAN52.3。本發(fā)明也涉及通過(guò)使用上面提及的載體經(jīng)如上定義的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞例如子囊菌或擔(dān)子菌，以及更具體地是黑曲霉或朱紅密孔菌。本發(fā)明也涉及用于制備如上定義的融合蛋白的方法，包括體外培養(yǎng)如上定義的宿主細(xì)胞，回收以及必要時(shí)純化經(jīng)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞生成的融合蛋白。通過(guò)對(duì)嵌合酶FLX(SEQIDNO:12)和FLXLC(SEQIDNO:14)的制備和性能的詳細(xì)描述進(jìn)一步地闡述了本發(fā)明。設(shè)計(jì)并在黑曲霉中成功地超量產(chǎn)生了兩種嵌合酶FLX和FLXLC。FLX構(gòu)建體是由編碼與黑曲霉的內(nèi)切木聚糖酶B(XYNB)相融合的阿魏酸酯酶A(FAEA)的序列組成的。將C末端的碳水化合物結(jié)合分子(家族ICBM)植入到FLX，生成了第二個(gè)雜交酶FLXLC。在各個(gè)伴侶之間都包括高糖基化連接物，以便穩(wěn)定構(gòu)建體。將雜交蛋白純化到均質(zhì)，估計(jì)FLX和FLXLC的分子量分別是72kDa和97kDa。用免疫檢測(cè)法檢査雜交酶的完整性，所述方法使用針對(duì)FAEA所產(chǎn)生的抗體和針對(duì)多His標(biāo)簽所產(chǎn)生的抗體，結(jié)果顯示出單一的形式。雙功能酶的各個(gè)催化模塊的理化性能對(duì)應(yīng)于那些游離酶的性能。另外，我們檢查發(fā)現(xiàn)FLXLC表現(xiàn)出對(duì)微晶體纖維素(Avicel)的強(qiáng)親和力，結(jié)合參數(shù)相當(dāng)于解離常數(shù)為Kd9.910_8M而結(jié)合力為0.98nmol/gAvicd。研究了兩個(gè)雙功能酶從天然底物玉米和小麥麩皮中釋放出阿魏酸的能力。與游離酶FAEA和XYNB相比較，通過(guò)使用FLX和FLXLC在兩個(gè)底物中都得到了更高的協(xié)同作用。此外，對(duì)于利用玉米作為底物的阿魏酸釋放而言，與FLX相比，F(xiàn)LXLC的協(xié)同作用是增加的，確認(rèn)了CBM的積極作用?？偠灾@些結(jié)果說(shuō)明黑曲霉的天然游離細(xì)胞壁水解酶的雙功能酶和CBM的融合能夠增加對(duì)降解復(fù)雜底物的協(xié)同作用。材科和方法茵抹和培養(yǎng)基大腸桿菌JM109(Promega)被用于構(gòu)建和繁殖載體，黑曲霉株D15弁26(22)被用于生產(chǎn)重組蛋白。在用分別含有p,G基因和表達(dá)盒FLX或FLXLC的載體共轉(zhuǎn)染之后(圖1)，在固體基本培養(yǎng)基(無(wú)尿嘧啶核苷)生長(zhǎng)黑曲霉進(jìn)行選擇，所述培養(yǎng)基含有70mMNaNO3、7mMKCl、11mMKH2HP04、2mMMgS04、1%葡萄糖(w/v)和微量元素[1000x母液76mMZnS04、25mMMnCl2、18mMFeS04、7.1mMCoCl2、6.4mMCuS04、6.2mMNa2Mo04、174mM乙二胺四乙酸(EDTA)]。為了在液體培養(yǎng)基中篩選出用于重組蛋白生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化體，在500mL帶擋板的燒瓶中，用lxlO6ml"個(gè)孢子接種100ml含有70mMNaN03、7mMKCl、200mMNa2HP04、2mMMgS04、6%葡萄糖(w/v)和微量元素的培養(yǎng)基。用黑曲霉BRFM131(BanquedeRessourcesFongiquesdeMarseille)進(jìn)《亍基因組DNA提取，并將所得到的DNA用作用于連接物-cbm序列的PCR擴(kuò)增策略中的模板。泉達(dá)我體的構(gòu)建和真菌祐化用重疊延伸PCR法(25)進(jìn)行來(lái)自黑曲霉的編碼FAEA(SEQIDNO:19;Y09330)、XYNB(SEQIDNO:5;AYl26481)和CBM(SEQIDNO:7;AF156269)的序列的融合。禾U用正向引物5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3,(fepM)和反向引物5'-擴(kuò)增出黑曲霉的FAEA編碼區(qū)。用正向引物5'-AGCGGAGCTTGTACTTGGGGCTCGACTTACTCCAGT曙3'和反向引物5'-GGTCGAGCTCGGGGTCGACGCCGCCGATGTCGAACT-3'從黑曲霉BRFM131中擴(kuò)增出編碼CBHB的連接物區(qū)的基因組DNA(SEQIDNO:9;AF156269)。最后，用正向引物5'-AGTTCGACATCGGCGGCGTCGACCCCGAGCTCGACC-3'和反向引物5'-GGCTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAACAGTGATGGACGAAG-3'(W"dl1)(在所有序列中都用點(diǎn)下劃線(xiàn)顯示出His標(biāo)簽)從cDNA(29)中擴(kuò)增出^"5基因。混合所形成的重疊片段，并通過(guò)使用兩個(gè)外引物在一步反應(yīng)中合成融合序列。將構(gòu)建體克隆到pGEM-T載體(Promega)內(nèi)，通過(guò)測(cè)序檢查所克隆的PCR產(chǎn)物。將所融合的片段克隆到經(jīng)M^I-77/mffll線(xiàn)性化的和去磷酸化的pAN52.3內(nèi)，以獲得pFLX質(zhì)粒(圖1A)。利用pFLX作為模板，用于經(jīng)正向引物5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3'(&piTI)和反向引物5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCTGAACAGTGATGGACGA-3'擴(kuò)增編碼重組體FAEA-連接物-XYNB的序列，構(gòu)建出FLXLC質(zhì)粒。將黑曲霉BRFM131的基因組DNA用作PCR擴(kuò)增連接物-CBM序列的模板，使用從已有的c6/^序列(AF15269)中設(shè)計(jì)出的兩個(gè)特異引物正向引物5'-TCGTCCATCACTGTTCAGGGCTCGACTTACTCCAGT-3'和反向引物5'-ATGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAAACACTGCGAGTAGTAC-3'(//z'^mi)。通過(guò)利用兩個(gè)外引物的重疊延伸PCR法合成融合片段，通過(guò)測(cè)序?qū)φ杖诤掀危⑵淇寺〉絧AN52.3內(nèi)，以獲得pFLXLC載體(圖1B)。在兩個(gè)表達(dá)載體中，黑曲霉的甘油醛-3磷酸脫氫酶基因(gpd^啟動(dòng)子、mRNA的5'非翻譯區(qū)、和黑曲霉的fr;C終止子都被用于驅(qū)動(dòng)重組序列的表達(dá)。另夕卜，F(xiàn)AEA的信號(hào)肽(21個(gè)氨基酸)被用于耙向兩種重組蛋白的分泌。如Punt和vandenHondel所述的那樣(39),通過(guò)分別使用pFLX或pFLXLC表達(dá)載體與含/,(選擇標(biāo)記物的pAB4-l(48)(比例為10:1)進(jìn)行兩個(gè)真菌共轉(zhuǎn)化。此外，使用基因而非上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化黑曲霉D15#26，用于對(duì)照試驗(yàn)。在選擇性基礎(chǔ)培養(yǎng)基板(無(wú)尿噴瞎核苷)上選擇出尿嘧啶核苷原養(yǎng)型的共轉(zhuǎn)化體，并在30°C下溫育8天。為了篩選轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)并每天檢查每種構(gòu)建體的40個(gè)單個(gè)克隆。阿魏脧酯酶和木聚錄酶活性的辟逸在30。C的震蕩培養(yǎng)箱(130rpm)中監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物14天。每天都用1M檸檬酸溶液將pH值調(diào)整為5.5。每個(gè)培養(yǎng)條件都一式兩份進(jìn)行。每天從液體培養(yǎng)基中收集到一部分培養(yǎng)基(1ml)，并通過(guò)離心去除菌絲。如先前所述的利用甲基阿魏酸(MFA)作為底物測(cè)定出酯酶活性(40)以及根據(jù)Bailey等的方法(1)通過(guò)測(cè)定從l%(w/v)白樺樹(shù)木聚糖中釋放出的木糖的量可以計(jì)算出木聚糖酶活性。酶與木聚糖溶液(1%(W)白樺樹(shù)木聚糖，50mM檸檬酸鈉緩沖液，pH5.5)在45。C下溫育5分鐘。以木糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，用DNS法測(cè)定出所釋放出的還原糖(35)。所有的檢測(cè)均使用了空白，以便糾正酶和底物樣品中的任何背景。用納開(kāi)特(nkatal，nkat)表示活性，1nkat被定義為在給定的條件下每秒鐘催化釋放出1nmol阿魏酸或1nmol還原糖的酶的量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都一式兩份進(jìn)行，一式三份進(jìn)行測(cè)定，酯酶活性的標(biāo)準(zhǔn)差小于平均值的2%，木聚糖酶活性的標(biāo)準(zhǔn)差小于平均值的5%。重組蛋^/的純化在與篩選步驟中相同的條件下接種每種構(gòu)建體的最好的分離株。在生長(zhǎng)8天后收集培養(yǎng)物，過(guò)濾(0.7pm)并通過(guò)聚醚砜膜(分子量截?cái)嘀禐?0kDa)(Millipore)的超濾進(jìn)行濃縮。用30mMTrisHC1(pH值7.0)、結(jié)合緩沖液對(duì)濃縮部分進(jìn)行透析處理，并在螯合瓊脂糖快速流動(dòng)柱(13x15cm)(AmershamBiosciences)(38)上進(jìn)行His標(biāo)記的蛋白質(zhì)的純化。考慮到游離蛋白，也在如先前所述的(29)的螯合瓊脂糖快速流動(dòng)柱上純化含His-標(biāo)簽序列的重組木聚糖酶B。最后，如先前所述(41)用苯基瓊脂糖柱一步法純化重組FAEA。重組蚤47的表征蛋白分析和N末端氨基酸序列測(cè)定:根據(jù)Lowry等的方法(34)用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定出蛋白濃度。用經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE(11%聚丙烯酰胺)平板凝膠檢查的蛋白產(chǎn)生和純化。根據(jù)Edman降解作用，從被電印跡到聚偏氟乙烯膜(Millipore)上的FLX和FLXLC樣品(IOO嗎)中測(cè)定出N末端序列。在AppliedBiosystem470A上進(jìn)行分析。Western印跡分析:根據(jù)Laemmli的方法(28)在11%SDS/聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行總蛋白和純化蛋白的電泳，并將其在室溫下電印跡到BA85硝基纖維素膜(Schleicher和Schuell)上45分鐘。將膜在封閉液(50mMTris、150mMNaCl和2%(v/v)牛奶，pH7.5)中4。C溫育過(guò)夜。用TBS-0.2%Tween洗滌膜，并用含按1/8000稀釋的抗FAEA血清或含抗聚組氨酸過(guò)氧化物酶血清(Sigma)的封閉液處理膜。對(duì)于抗FAEA抗體，隨后用綴合有辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗兔免疫球蛋白G(Promega)溫育膜。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，用化學(xué)發(fā)光法Western印跡試劑盒(Roche)檢測(cè)信號(hào)。重組蛋白的溫度和PH穩(wěn)定性:在30°C到70°C的范圍內(nèi)測(cè)試純化的重組蛋白的熱穩(wěn)定性。將等分樣品在給定溫度下預(yù)溫育，在冷卻到0。C之后，然后在先前所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)試酯酶和木聚糖酶活性。在溫育之后用SDS-PAGE分析樣品，以便驗(yàn)證雙功能蛋白的完整性。通過(guò)在擰檬酸-磷酸緩沖液(pH2.5-7.0)和磷酸鈉(pH7.0-8.0)中溫育純化的重組蛋白來(lái)研究pH值對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響。所有溫育都進(jìn)行90分鐘，然后將等分樣品轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中，以測(cè)定出剩余活性的量。在預(yù)溫育之前測(cè)定出的活性作為100%。溫度和PH值對(duì)酯酶和木聚糖酶活性的作用:為了測(cè)定出在所用條件下的最佳溫度，在不同溫度下(30。C到70。C)溫育等分的純化重組蛋白，并檢測(cè)酯酶和木聚糖酶活性。用檸檬酸-磷酸緩沖液(pH2.5-7.0)和磷酸鈉(PH7.0-8.0)作為標(biāo)準(zhǔn)條件測(cè)定出最佳pH值。纖維素結(jié)合能力和解離常數(shù)的測(cè)定:將純化的FLX和FLXLC樣品加入到2ml含有25mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中的纖維素的微量離心管內(nèi)，終體積為lml。通過(guò)使用各種量的重組蛋白(30嗎和170)Lig之間)和恒量的纖維素(2mg)測(cè)定出FLX(對(duì)照)和FLXLC結(jié)合AvicelPH101(Fluka)的能力。兩種重組蛋白都在輕微攪拌下、4°C與纖維素溫育lh。在離心(4000g下10分鐘)之后，測(cè)定出上清液中的殘余蛋白(游離的酶)的量。通過(guò)用所加入的總量減去游離FLX或游離FLXLC的量計(jì)算出與纖維素結(jié)合的酶的量。通過(guò)繪制1/結(jié)合酶對(duì)1/游離酶的雙倒數(shù)曲線(xiàn)分析數(shù)據(jù)。解離常數(shù)被定義為1/B=(Kd/Bmaxx1/F)+1/Bmax，其中B為結(jié)合酶的濃度以及F是游離酶的濃度(21,37)。應(yīng)用測(cè)式酶水解:使小麥麩皮(WB)和玉米麩皮(MB)脫槳。將這些提取物在130°C下加熱處理10分鐘。在恒溫控制的搖晃培養(yǎng)箱、40。C下，在0.1M含0.0P/。疊氮化鈉的3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)緩沖液(pH值6.0)中進(jìn)行酶水解。將WB或MB(200mg)分別和純化的FAEA(SEQIDNO:2)、XYNB(SEQIDNO:6)、FLX和FLXLC—起溫育，終體積為5ml。游離酶和雙功能酶的純化的酶濃度是每個(gè)測(cè)試均為每200mg干麩皮11納開(kāi)特酯酶活性和6496納開(kāi)特木聚糖酶活性。該比例對(duì)應(yīng)于在純化的雙功能酶中所見(jiàn)的摩爾對(duì)摩爾條件。每個(gè)測(cè)試都一式兩份進(jìn)行，WB和MB的標(biāo)準(zhǔn)誤都小于平均值的5%。堿可萃取的羥基肉桂酸的制備:通過(guò)在2NNaOH中加入20mgWB或MB并在暗處35°C下溫育30分鐘測(cè)定出堿可萃取的羥基肉桂酸的總含量。用2NHCl將pH值調(diào)整到2。用3ml醚萃取酚酸3次。將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管內(nèi)，并在40。C下干燥。向干燥的萃取物中加入lml甲醇/1120(50:50)(v/v)，并如下一部分所述的將樣品注射到HPLC系統(tǒng)內(nèi)。將總的堿可萃取的阿魏酸含量當(dāng)作100%酶水解。阿魏酸測(cè)定:用100%甲醇將酶水解物稀釋到1/2，并在12,000xg離心5分f中，經(jīng)0.2fim尼龍濾器(GelmanSciences,Acrodisc13,AnnArbor,MI)過(guò)濾上清液。用HPLC分析過(guò)濾液(注射液為25|il)。在裝配有可調(diào)的UV/VIS檢測(cè)儀、100位自動(dòng)取樣器-自動(dòng)注射器的HP1100模塊(Hewlett-PackardRockville，MD)上、280nm和30°C下進(jìn)行HPLC分析。在MerckRP-18反相柱(Chromolith3.5|im,4.6*100mm，Merck)上實(shí)現(xiàn)分離。流速為L(zhǎng)4ml/分鐘。所用的流動(dòng)相是1%乙酸和10%乙腈水溶液(A)對(duì)100%乙腈(B)，總運(yùn)行時(shí)間為20分鐘，梯度如下變化溶劑B開(kāi)始于0。/。持續(xù)2分鐘，然后在10分鐘內(nèi)增加到50%，3分鐘內(nèi)增加到100%，直到運(yùn)行結(jié)束。用HP3365ChemStation處理數(shù)據(jù)，以及用外標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)進(jìn)行定量。結(jié)果;又，力能酶,品的4殳計(jì)和研免通過(guò)在兩個(gè)伴侶之間加入來(lái)自編碼高糖基化連接物的纖維二糖水解酶B基因(cM5)的序列遺傳學(xué)融合編碼阿魏酸酯酶(FAEA)和木聚糖酶B(XYNB)的黑曲霉序列(圖1A)。對(duì)于第二個(gè)構(gòu)建體FLXLC，將相應(yīng)的融合物FLX與編碼連接物-CBM的黑曲霉基因的部分序列相融合(圖1B)。兩個(gè)翻譯融合物都被放置于強(qiáng)的組成型g/^4啟動(dòng)子和^C終止子的控制之下，具有內(nèi)源性/a"信號(hào)序列，以靶向分泌。用表達(dá)載體pFLX或pFLXLC和含pyK的質(zhì)粒pAB4-l的混合物共轉(zhuǎn)化黑曲霉D15#26原生質(zhì)體。根據(jù)其在無(wú)尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力選擇轉(zhuǎn)化體。將每種構(gòu)建體的40個(gè)轉(zhuǎn)化體接種到抑制內(nèi)源性和;qv"^基因表達(dá)的葡萄糖基本培養(yǎng)基內(nèi)。對(duì)于經(jīng)pAB4-l轉(zhuǎn)化的對(duì)照宿主，沒(méi)有檢測(cè)到酯酶或木聚糖酶活性。對(duì)于兩個(gè)構(gòu)建體，在生長(zhǎng)兩天后的轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞外培養(yǎng)基中都檢測(cè)到了酯酶和木聚糖酶活性(圖2)。在培養(yǎng)期間，以同步的方式檢測(cè)阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性。最好的FLXLC和FLX轉(zhuǎn)化體的活性分別從第10天和第11天開(kāi)始增加，到第14天達(dá)到基本上穩(wěn)定的水平。FLX和FLXLC轉(zhuǎn)化體的最大酯酶活性分別達(dá)到13.0nkat/ml和9.8nkat/ml。對(duì)于木聚糖酶活性而言，所獲得的FLX和FLXLC的最大活性分別是2870nkat/ml和2038nkat/ml?？紤]到被結(jié)合于雙功能酶中的FAEA伴侶的比活性，估計(jì)FLX和FLXLC轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)量分別是1.4g/L和1.5g/L。;又勸能酶的生化和動(dòng)力學(xué)泉4正SDS-PAGE和Western印跡分析:在兩種情況中，都用SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查所產(chǎn)生的蛋白(圖3，泳道1和3)。在分別來(lái)自FLX和FLXLC轉(zhuǎn)化體的總細(xì)胞外蛋白中觀察到了72kDa和97kDa附近的主要條帶。所觀察到的FLX和FLXLC的分子量與理論分子量之間的差異說(shuō)明分別約為12%(w/w)和26%(w/w)的糖基化。用螯合瓊脂糖快流柱純化出重組蛋白，并用SDS-PAGE對(duì)照組分的均質(zhì)性(泳道2和4)。通過(guò)使用所生成的抗FAEA的抗體可以免疫檢測(cè)出來(lái)自總蛋白上清液和純化部分中的兩種嵌合酶(圖4A)。在FLX和FLXLC轉(zhuǎn)化體的總蛋白提取物(泳道1和3)以及純化樣品(泳道2、4)中分別都顯示出單一條帶。也用所生成的抗C末端His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)，以便對(duì)照重組蛋白的完整性，因?yàn)椴荒艿玫娇鼓揪厶敲富駽BM的抗體(圖4B)。在FLX和FLXLC中都檢測(cè)到了單一條帶，證實(shí)產(chǎn)生了作為沒(méi)有任何降解形式的完整蛋白的雙功能酶(泳道5到8)。陰性對(duì)照(C)證實(shí)兩種抗體都是表位特異性抗體，在這些培養(yǎng)條件下都沒(méi)有產(chǎn)生內(nèi)源性FAEA。N末端測(cè)序:測(cè)序出FLX和FLXLC的頭5個(gè)氨基酸(ASTQG)，并與天然FAEA進(jìn)行排列比較。排列比較發(fā)現(xiàn)重組蛋白和天然FAEA之間的相同性為100%。這些結(jié)果證實(shí)FLX和FLXLC都受到了正確的加工處理。雙功能酶-纖維素親和力和結(jié)合力的分析:與FLX不同的是，F(xiàn)LXLC在其C末端含有來(lái)自黑曲霉纖維二糖水解酶B的CBM。進(jìn)行了FLXLC與纖維素之間的相互作用檢測(cè)，以便確定出CBM的結(jié)合參數(shù)。測(cè)定出FLXLC針對(duì)微晶體纖維素即AvicdPH101的纖維素結(jié)合親和力和結(jié)合能力。所測(cè)定到的解離常數(shù)(Kd)和結(jié)合力的數(shù)值分別是9.910—8M和0.98pmol/gAvicel。如所預(yù)期的那樣，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嵌合酶FLX(無(wú)CBM)與纖維素之間的相互作用。生化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)為了對(duì)照有或沒(méi)有CBM的兩種酶伴侶的融合物是否具有每種酶的改良的特征，根據(jù)酯酶和木聚糖酶活性，對(duì)FLX和FLXLC與游離重組物FAEA和XYNB的生化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較(表1)。在pH優(yōu)化和穩(wěn)定性方面，在兩種雙功能酶和游離FAEA或XYNB之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。在溫度優(yōu)化和穩(wěn)定性方面，只在木聚糖酶活性方面測(cè)定到了輕微改變的差異。另外，在不同的溫度下溫育之后，用SDS-PAGE對(duì)照FLX和FLXLC的完整性，兩種雙功能酶最高到45。C都是十分穩(wěn)定的，在50。C發(fā)生部分裂解。測(cè)序出裂解形式的頭幾個(gè)氨基酸，并被鑒定為GSGSS。該序列與FLX和FLXLC的比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與在連接物中發(fā)現(xiàn)的序列有著100%相同性。這些結(jié)果表明高糖基化連接物在最高到45°C時(shí)都是穩(wěn)定的，在50°C下在GSGSS序列之前出現(xiàn)裂解。只在C末端裂解物(XYNB和CBM)之間裂解含有兩個(gè)連接物序列的嵌合FLXLC蛋白。用肽切割器工具(19)檢査兩個(gè)雜合蛋白的氨基酸序列上的潛在的蛋白酶的裂解位點(diǎn)，在GSGSS附近沒(méi)有發(fā)現(xiàn)裂解位點(diǎn)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)性能，通過(guò)用MFA和白樺樹(shù)木聚糖作為底物從Lineweaver-Burk曲線(xiàn)中計(jì)算出了FLX和FLXLC的Michaelis常數(shù)。發(fā)現(xiàn)FLX和FLXLC的這些數(shù)值與游離的重組物FAEA和XYNB的數(shù)值相一致(表l)。依據(jù)阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性測(cè)定出雙功能酶的比活性，并與游離的FAEA和XYNB進(jìn)行比較(表1)。雙功能酶的數(shù)值接近游離FAE和XYNB的那些數(shù)值?？傊@些結(jié)果證實(shí)融合的酶模塊(FAEA和XYNB)的生化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)大部分都被轉(zhuǎn)化到了雙功能復(fù)合物FLX和FLXLC內(nèi)。小支和玉米拔支的阿魏脧的酶性幹玫為了研究雙功能蛋白內(nèi)的兩種酶的物理接近性所生成的協(xié)同作用以及添加CBM的影響，比較了FLX和FLXLC與游離酶FAEA和XYNB的FA釋放效率。所有酶都被純化到均質(zhì)，并與WB和MB相溫育，因?yàn)閃B和MB的細(xì)胞壁都天然地含有大量的FA。通過(guò)使用游離FAEA4禾Q16個(gè)小時(shí)之后，分別從WB中釋放出4ie/。和5ie/。的總堿可提取性FA(圖5A)。加入游離的XYNB使得這些百分比輕微地增加到了51%(4h)和54%(16h)。對(duì)于FLX或FLXLC的作用，我們只觀察了4h溫育后的總FA釋放。用MB作為底物(圖5B)，游離FAEA在4h和16h之后分別釋放出4.2%和4.8%FA，加入XYNB不增加這些百分比。但是，F(xiàn)LX和FLXLC在4h水解之后分別能夠釋放出6.2%和7.2%。測(cè)定出協(xié)同系數(shù)(synergyfactor),并在游離(FAEA+XYNB)和融合酶(FLC禾BFLXLC)之間進(jìn)行比較。如在表2中所計(jì)算出的那樣，如果所計(jì)算出的比例大于l，雙功能酶對(duì)于兩種底物的協(xié)同作用要優(yōu)于相應(yīng)的游離酶。對(duì)于4h和16h后的MB的FA釋放,FLXLC(1.8和1.62)的協(xié)同作用要高于FLX(1.53和1.30)?？傊@些結(jié)果顯示對(duì)于兩種底物的FA釋放而言，雙功能酶FLX和FLXLC都要比相應(yīng)的游離酶(FAEA+XYNB)更為有效。此外，這些結(jié)果似乎顯示出FLXLC更適用于MB作為底物的FA釋放，說(shuō)明了CBM生成的正面作用。結(jié)論由于其組成和結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，植物細(xì)胞壁的生物降解需要多種酶。不同的主鏈和輔助水解酶之間的一些組合顯示出了導(dǎo)致有效降解細(xì)胞壁的重要的協(xié)同作用(9，12)。在本研究中，融合了黑曲霉的兩種細(xì)胞壁降解酶和碳水化合物結(jié)合模塊，以研究對(duì)天然底物降解的協(xié)同作用。這種雜合蛋白的構(gòu)建是蛋白遺傳加工的起始部分，提供了大量潛在的應(yīng)用。在此，本發(fā)明的構(gòu)思在于使用兩種功能單元以產(chǎn)生改良的雙功能蛋白(3，36)。常?？梢栽谧匀唤缯业竭@種多模塊的結(jié)構(gòu)，造成了具有一種以上酶活性或蛋白功能的酶生成。在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，已經(jīng)研究了一些雙功能蛋白，包括例如a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的雜合體(44)。這個(gè)研究的結(jié)果顯示與游離酶相比較，增加了在消化生淀粉方面的酶效率。在另一個(gè)研究中，構(gòu)建出嵌合的木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶(XynCenA)和內(nèi)在CBM，但是結(jié)果顯示與游離酶相比，雜合酶沒(méi)有顯著地影響對(duì)均質(zhì)的木聚糖或纖維素底物的水解作用，但是沒(méi)有研究過(guò)對(duì)天然底物的應(yīng)用性測(cè)試(46)。為了評(píng)價(jià)兩者細(xì)胞壁水解酶的物理接近性所形成的作用，融合了FAEA和XYNB(構(gòu)建體FLX)。在第二個(gè)構(gòu)建體(FLXLC)的C末端遠(yuǎn)端融合了來(lái)自黑曲霉CBHB的真菌CBM，使得雙功能酶靶向于纖維素。對(duì)于兩種構(gòu)建體，在各個(gè)模塊(FAEA、XYNB或CBM)之間都融合了高糖基化連接物肽，這基于三個(gè)主要理由。首先，已知連接物能夠保留模塊自由折疊以及保存彼此相對(duì)的構(gòu)象自由度的能力(36)。在本研究中，兩種阿魏酸酯酶和木聚糖酶都能夠采用這種構(gòu)象，以及遺傳加工的雙功能蛋白是有活性的且具有對(duì)應(yīng)于游離酶的生化和動(dòng)力學(xué)性能。其次，連接物的高度糖基化容許通過(guò)保護(hù)連接物避免蛋白酶活性以及最終通過(guò)避免所融合的模塊之間的頻繁的裂解問(wèn)題(8,36)來(lái)增加蛋白序列的穩(wěn)定性。觀察到了這種作用，因?yàn)镾DS-PAGE和Western印跡分析都顯示出兩種雙功能酶都是穩(wěn)定的。但是，雜合酶的穩(wěn)定性在熱處理方面顯示出一些局限性。事實(shí)上，熱處理對(duì)FLX和FLXLC完整性的影響顯示出它們?cè)谧罡叩?5°C都是穩(wěn)定的，然后在50。C發(fā)生連接物序列的裂解。最后，如黑曲霉葡萄糖淀粉酶的高糖基化連接物所顯示的那樣(32)，高糖基化連接物可能對(duì)分泌有著正面作用，增加了產(chǎn)品產(chǎn)率。事實(shí)上，由于FLX和FLXLC分別存在的一個(gè)或兩個(gè)連接物所形成的糖基化位點(diǎn)可以延長(zhǎng)重組蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留，據(jù)此提供附加的正確折疊所需的時(shí)間，并造成產(chǎn)量的增加(42)。后一理論可以解釋兩種雙功能酶的產(chǎn)率都要高于相應(yīng)的游離重組酶所獲得的產(chǎn)率(29,41)的原因。為了研究協(xié)同作用是由兩個(gè)酶模塊的接近性所形成的，而不是在折疊期間由于蛋白構(gòu)象改變所造成的酶性能的修飾形成的增益的結(jié)果，仔細(xì)地對(duì)照了各個(gè)模塊的生化和動(dòng)力學(xué)特征。兩種雙功能蛋白FLX和FLXLC的所有主要的生化和動(dòng)力學(xué)性能即溫度和pH穩(wěn)定性、最優(yōu)溫度和pH,Km和比活性都處于與游離酶相同的范圍之內(nèi)。對(duì)于源自黑曲霉CBHB的CBM，用纖維素進(jìn)行了結(jié)合檢測(cè)，這種檢測(cè)在過(guò)去沒(méi)有被表征過(guò)(20)。Avicd纖維素有著重要的100-250個(gè)吡喃葡萄糖單位的聚合度，以及結(jié)晶相的50-60%結(jié)晶形式主要是由高等植物特征性的Ip型組成的(49)。結(jié)果顯示FLXLC具有針對(duì)Avicel的親和力，證實(shí)了CBM的結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到干擾，并且CBM將其功能保留到了雜合酶內(nèi)。最后測(cè)試了兩種雙功能蛋白FLX和FLXLC，以便研究?jī)煞N互補(bǔ)的真菌酶的物理接近性對(duì)酶協(xié)同作用的作用以及加入CBM的影響。應(yīng)用測(cè)試是基于兩種天然和典型底物WB和MB的FA釋放，已知WB和MB的植物細(xì)胞壁有著高含量的FA，分別接近1%和3%(w/w)(43)。兩種底物都可以來(lái)自農(nóng)業(yè)，并且可以回收再利用于農(nóng)業(yè)-食品、化妝品和制藥領(lǐng)域(4,26)。游離酶能夠分別從WB和MB中釋放出54%和4.8%的FA含量。相反的，雙功能酶能夠有效地釋放出WB中的所有FA，以及釋放出MB中最高6.3%或7.9。/。的FA，這取決于是否存在CBM。至今為止，已經(jīng)用綠色木霉木聚糖酶和來(lái)自黑曲霉的FAEA獲得了先前已知的WB的FA釋放的結(jié)果，其中釋放出了最高95。/。(w/w)總阿魏酸(15)。對(duì)于MB而言，用來(lái)自7/"脂'co/fl/rao/ms的商品化制劑Novozym342釋放出了較多的FA量(最高為13.6%)(5)。但是，我們應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到這種商品化制劑含有不同類(lèi)型的酶活性。在本研究中，用雙功能酶處理釋放出了WB中的所有FA，而用MB獲得了不到8%的FA。盡管玉米麩皮中的阿魏酸含量要高于小麥麩皮中的含量，但是玉米麩皮中的木聚糖更多地是被木糖、阿拉伯糖和半乳糖殘基(7,15)所取代。因此，用玉米的異木聚糖骨架中的取代數(shù)目、側(cè)鏈存在高度分支的木糖、以及在鄰近FA基團(tuán)的阿拉伯糖和木糖之間存在著連接物(這嚴(yán)重地限制了酶的可接近性)都可以解釋這種差異。最后，如果我們認(rèn)為在FLXLC對(duì)MB的水解作用中CBM對(duì)FA釋放顯示出正面作用，那么可能是因?yàn)?i)纖維素靶向作用增加了接近于底物的酶濃度和/或(ii)纖維素結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定性使得底物是更可接近的。因此，應(yīng)用測(cè)試的結(jié)論是通過(guò)使用FLX或FLXLC獲得了比游離酶FAEA和XYNB更好的針對(duì)兩種底物的FA釋放的協(xié)同作用。普遍增強(qiáng)的協(xié)同作用可能是雙功能酶內(nèi)的各個(gè)酶伴侶的物理接近性造成的，因?yàn)殡s合蛋白內(nèi)的各個(gè)伴侶的所有主要生化和動(dòng)力學(xué)性能都沒(méi)有改變。在FLXLC中，加入C末端的CBM正面地影響著協(xié)同作用。此外，也可認(rèn)為是融合模塊之間的活性位點(diǎn)的空間定位沒(méi)有受到干擾。綜上所示，將互補(bǔ)性細(xì)胞壁水解酶例如輔助酶(FAEA)與主鏈裂解酶(XYNB)相結(jié)合來(lái)構(gòu)建用于植物細(xì)胞壁降解的新的酶工具顯示出是一種增加酶伴侶的協(xié)同作用的感興趣的策略。對(duì)于生物技術(shù)應(yīng)用而言，這種雜合蛋白的應(yīng)用是對(duì)昂貴的和有污染的化學(xué)處理的替代方案或者能夠提高現(xiàn)有的用于植物性副產(chǎn)品在紙漿和造紙、農(nóng)業(yè)和生物燃料生產(chǎn)領(lǐng)域的回收再利用的酶方法。參者丈坎1.Bailey,M.J.，P.Biely，andK.Poutanen.1992.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J.Biotechnol.23:257-270.2.Bartobme,B.,C.B.Faulds，P.A.Kroon,K.Waldron，H.J.Gilbert,G.Hazlewood，andG.Williamson.1997.AnJ印ergi〃wsm'geresterase(feralicacidesteraseIII)andarecombinant尸sei/(io/nowas^/7即wsce/wsubsp.cellulosaesterase(XyID)releasea5-5'ferulicdehydrodimer(diferulicacid)frombarleyandwheatcellwalls.Appl.Environ.Microbiol.63:208-12.3.Beguin,P.1999.Hybridenzymes.Curr.Opin.Biotechnol.10:336-340.4.Bonnin,E.,L.Lesage-Meesen,C.Stentelaire，M.Asther，andJ.F.Thibault.1999.MethodforobtainingAw/gerculturesandtheirusesforproducingferulicacidandvanillicacid.PatentN°99/04644.5.Bonnin,E.,L.Saulnier,M.Brunei,C.Marot,L.Lesage-Meessen，M.AstherandJ.F.Thibault.2002.Releaseofferulicacidfromagroindustrialby-productsbythecellwall-degradingenzymesproducedby^戸^gz7/zwm'ger1-1472.EnzymeMicrob.Technol.31:1000-1005.6.Bunzel,M.，J.Ralph,J.M.Marita，R.D.Hatfield,andH.Steinhart.2001.Diferulatesasstructuralcomponentsinsolubleandinsolublecerealdietaryfibre.J.Sci.FoodAgric.81:653-660.7.ChanliaudE.，L.Saulnier,andJ.F.Thibault.1995.Alkalineextractionandcharacterisationofheteroxyl咖frommaizebran.J.CerealSci"21:195-203.8.Conesa，A.，P.J.Punt，N.vanLuijkandC.A.M.丄J.vandenHondel.2001.TheSecretionPathwayinFilamentousFungi:ABiotechnologicalView.FungalGenet.Biol.33:155-171.9.deVries,R.,H,C.M.Kester,C.H.Poulsen,J.A.E.Benen,andJ.Visser.2000.Synergybetweenenzymesftomv45/ergz7/iwinvolvedinthedegradationofplantcellwallpolysaccharides.Carbohydr.Res.327:401-410.10.deVriesR.P.,B.Michelsen，C.H,Poulsen,，P.A.Kroon，R,H.H.vandenHeuvel，C.B.Faulds，GWilliamson,J.P.T,W.vandenHombergh，andJ.Visser.1997,ThefaeAgenesfrom爿5^^7/w51w/gerand丄peA^7/w51ft/Z)/wge肌iencodeferulicacidesterasesinvolvedindegradationofcomplexcellwallpolysaccharides.Appl.Environ.MicrobioL63:4638-4644.11.deVriesR.P,，P.A.vanKuyk，H,C.Kester，andJ.Visser.2002.They^/erg7/wsw/g"faeBgeneencodesas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QIDNO:10表示的序列。14.權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的用途，其中融合蛋白是阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任選地CBM之間的融合蛋白，例如是-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的序列作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的序列作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。15.權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的用途，用于在制備以下感興趣的化合物的過(guò)程中或在紙漿或紙的漂白過(guò)程中進(jìn)行植物細(xì)胞壁降解-生物乙醇；-抗氧化劑，例如屬于肉桂酸的阿魏酸或咖啡酸、和羥基酪醇或沒(méi)食子酸；-香料，例如分別通過(guò)阿魏酸或?qū)ο愣顾岬纳镛D(zhuǎn)化而獲得的香草醛或?qū)αu基苯甲醛。16.在從植物或植物性副產(chǎn)品中制備位于植物細(xì)胞壁中的感興趣的化合物的過(guò)程中的植物細(xì)胞壁降解方法，特征在于所述方法包括以下步驟-用如上定義的融合蛋白或用如上定義的經(jīng)轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞對(duì)植物或植物性副產(chǎn)品或工業(yè)廢物進(jìn)行酶性處理；-任選地，通過(guò)蒸汽閃爆對(duì)植物或植物性副產(chǎn)品進(jìn)行物理處理并聯(lián)合融合蛋白的作用；-任選地，用合適的微生物或酶對(duì)在上面的酶性處理期間從細(xì)胞壁中釋放出的化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；-回收以及必要時(shí)純化在上面的酶性處理期間從細(xì)胞壁中釋放出的或在上面的生物轉(zhuǎn)化步驟期間獲得的感興趣的化合物。17.權(quán)利要求16的方法，用于制備抗氧化劑例如屬于肉桂酸的阿魏酸或咖啡酸和羥基酪醇或沒(méi)食子酸、香料例如分別通過(guò)阿魏酸或?qū)ο愣顾岬纳镛D(zhuǎn)化而獲得的香草醛或?qū)αu基苯甲醛、生物乙醇；或者用于漂白紙漿和紙。18.至少兩種不含C末端的碳水化合物結(jié)合分子(CBM)的植物細(xì)胞壁降解酶和任選地CBM之間的融合蛋白，所述酶和CBM是對(duì)應(yīng)于真菌天然蛋白或其突變形式的重組蛋白。19.權(quán)利要求18的融合蛋白，其中-不含CBM的植物細(xì)胞壁降解酶是如權(quán)利要求2到8中任一項(xiàng)所定義的酶；-所述CBM是如權(quán)利要求9或10所定義的CBM。20.權(quán)利要求18或19的融合蛋白，其在所述融合蛋白所包括的蛋白中的至少兩種蛋白之間包括連接物，所述連接物是如權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)所定義的連接物。21.權(quán)利要求18到20中任一項(xiàng)的融合蛋白，其是阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任選地CBM之間的融合蛋白，例如是-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO"0表示的序列作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的序列作為前述兩個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纖維二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之間的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作為前述三個(gè)蛋白中各個(gè)蛋白之間的高糖基化連接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。22.編碼如權(quán)利要求18到21中任一項(xiàng)所定義的融合蛋白的核酸。23.經(jīng)如權(quán)利要求22所定義的核酸所轉(zhuǎn)化的載體。24.利用如權(quán)利要求23所定義的載體、以如權(quán)利要求22所定義的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。25.用于制備如權(quán)利要求18到21中任一項(xiàng)所定義的融合蛋白的方法，包括體外培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，回收以及必要時(shí)純化由培養(yǎng)物中的所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的融合蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及至少兩種植物細(xì)胞壁降解酶和任選地CBM之間的融合蛋白用于在從植物或植物性副產(chǎn)品中制備位于植物細(xì)胞壁內(nèi)的感興趣的化合物的過(guò)程中或紙漿和紙的漂白過(guò)程中進(jìn)行植物細(xì)胞壁降解的用途，所述酶是不含C末端碳水化合物結(jié)合分子(CBM)的酶，所述酶和CBM是對(duì)應(yīng)于真菌天然蛋白或其突變形式的重組蛋白。文檔編號(hào)C12N15/62GK101283092SQ200680037689公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年7月26日優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日發(fā)明者A·勒瓦瑟,D·納瓦羅,E·勒科爾,F·莫諾,J-P·貝萊什,M·艾瑟爾,P·蓬特申請(qǐng)人:國(guó)立農(nóng)業(yè)研究所;法國(guó)石油研究院