殺蟲蛋白的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Vip3A蛋白質(zhì)通過(guò)在植物中表 達(dá)來(lái)控制二化螟為害植物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis屬鱗翅目，螟蛾科，在我國(guó)南北稻區(qū)廣泛分布的常發(fā) 性害蟲之一。在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白穗，一般年份減 產(chǎn)3% -5%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)在3成以上，給當(dāng)前的水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。
[0003] 水稻是中國(guó)重要的糧食作物，隨著全球溫室效應(yīng)的加強(qiáng)，近兩年溫度不斷上升，蟲 害發(fā)生種類及數(shù)量都有所提高。每年因二化螟造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當(dāng)?shù)厝?口的生存狀況。為了防治二化螟，人們通常采用的主要防治方法有：農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和 物理防治。
[0004] 農(nóng)業(yè)防治是把整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因 素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長(zhǎng)而不利于二化螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境?？梢圆扇≌{(diào)整水稻播 種期、處理稻茬、灌水滅蟲、拔出白穗等措施，以達(dá)到消滅一定數(shù)量害蟲的目的。因農(nóng)業(yè)防治 必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作為應(yīng)急措施，在二化螟爆發(fā) 時(shí)就顯得無(wú)能為力。
[0005] 化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲劑來(lái)殺滅害蟲，是二化螟綜合治理的重要 組成部分，它具有快速、方便、簡(jiǎn)便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是二化螟大發(fā)生的情況下，是 必不可少的應(yīng)急措施。二化螟作為蛀莖害蟲，對(duì)其的防治時(shí)期把握非常重要，用藥最佳時(shí)期 是卵孵盛期至幼蟲蛀莖之前，否則高齡幼蟲蛀入莖桿之后，將很難達(dá)到防治的目的。目前化 學(xué)防治方法主要是藥液噴霧。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不當(dāng)往往會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā) 生藥害、害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及減少天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留 對(duì)人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
[0006] 物理防治主要根據(jù)害蟲對(duì)環(huán)境條件中各種物理因素的反應(yīng)，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等以及機(jī)械設(shè)備進(jìn)行誘殺、輻射不育等方法來(lái)防治害蟲。目前應(yīng)用最廣泛 的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠(yuǎn)距離用波，引誘害蟲靠 近，對(duì)二化螟成蟲的防治具有一定的效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時(shí)清理高壓電網(wǎng) 上的污垢，否則會(huì)影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危險(xiǎn)； 此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和物理防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò) 研宄發(fā)現(xiàn)將來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗 蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。Vip3A殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蠟狀芽孢桿 菌產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)。
[0008] Vip3A蛋白通過(guò)激發(fā)凋亡類型的細(xì)胞程序性死亡對(duì)敏感性昆蟲具有毒殺效應(yīng)。 Vip3A蛋白在昆蟲腸道內(nèi)被水解為4種主要蛋白產(chǎn)物，其中只有一種蛋白水解產(chǎn)物（33KD) 為Vip3A蛋白的毒性核心結(jié)構(gòu)。Vip3A蛋白結(jié)合敏感昆蟲的中腸上皮細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞程序性 死亡，造成中腸上皮細(xì)胞的溶解導(dǎo)致昆蟲死亡。對(duì)非敏感昆蟲不產(chǎn)生任何病癥，不會(huì)導(dǎo)致中 腸上皮細(xì)胞的凋亡和溶解。
[0009] 已證明轉(zhuǎn)Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地貪夜蛾、大螟、水稻夜蛾等鱗 翅目Lepidoptera害蟲的侵害，然而，至今尚無(wú)關(guān)于通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Vip3A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株 來(lái)控制二化螟對(duì)植物危害的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)Vip3A蛋白 的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制二化螟對(duì)植物危害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治 和物理防治等技術(shù)缺陷。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制二化螟害蟲的方法，包括將二化螟害蟲 至少與Vip3A蛋白接觸。
[0012] 進(jìn)一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Vip3A蛋白的宿主細(xì)胞中，所述二 化螟害蟲通過(guò)攝食所述宿主細(xì)胞至少與所述Vip3A蛋白接觸。
[0013] 更進(jìn)一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Vip3A蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因植 物中，所述二化螟害蟲通過(guò)攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Vip3A蛋白 接觸，接觸后所述二化螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對(duì)二化螟危害植物的 控制。
[0014] 所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
[0015] 所述轉(zhuǎn)基因植物的組織為根、葉片、莖桿、果實(shí)、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0016] 所述對(duì)二化螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
[0017] 所述植物來(lái)自水稻、甘蔗、茭白、玉米、高粱、大豆、油菜、麥類、粟或稗。
[0018] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Vip3A蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 優(yōu)選地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的 氨基酸序列。所述Vip3A蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4所示的核苷 酸序列。
[0020] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述Vip3A 蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0021] 進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶 抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
[0022] 優(yōu)選地，所述第二種核苷酸編碼CrylAb蛋白。
[0023] 更進(jìn)一步地，所述CrylAb蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序 列，所述第二種核苷酸具有SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0024] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0025] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Vip3A蛋白質(zhì)控制二化螟害蟲的用途。
[0026] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制二化螟害蟲的植物的方法，包括 向所述植物的基因組中引入編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制二化螟害蟲的植物繁殖體的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由權(quán)利要求18所述方 法獲得的植株上具有繁殖能力的組織進(jìn)行培養(yǎng)，從而產(chǎn)生含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸 序列的植物繁殖體。
[0028] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)控制二化螟害蟲的植物的方法，包 括：
[0029] 種植至少一個(gè)植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼Vip3A蛋白的多 核苷酸序列；
[0030] 使所述植物繁殖體長(zhǎng)成植株；
[0031] 使所述植株在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下生 長(zhǎng)，收獲與其他不具有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和 /或具有增加的植物產(chǎn)量的植株。
[0032] 本發(fā)明中所述的"植物繁殖體"包括但不限于植物有性繁殖體和植物無(wú)性繁殖體。 所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無(wú)性繁殖體是指植物體的營(yíng)養(yǎng)器官 或某種特殊組織，其可以在離體條件下產(chǎn)生新植株；所述營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織包括但 不限于根、莖和葉，例如：以根為無(wú)性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無(wú)性繁殖體 的植物包括甘蔗和馬鈴薯（塊莖）等；以葉為無(wú)性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。
[0033] 本發(fā)明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細(xì)胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞既可以是其體內(nèi)表達(dá) 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產(chǎn)生殺蟲蛋白的微生物。
[0034] 本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"控制"和/或"防治"是指二化螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸，接觸 后二化螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳觥＿M(jìn)一步地，二化螟害蟲通過(guò)攝食植物組織至 少與Vip3A蛋白接觸，接觸后全部或部分二化螟害蟲生長(zhǎng)受到抑制和/或?qū)е滤劳?。抑?是指亞致死，即尚未致死但能引起生長(zhǎng)發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應(yīng)，如 生長(zhǎng)發(fā)育緩慢和/或停止。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用 于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的控制二化螟害蟲 的植物和/或植物繁殖體，在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發(fā)生危害的條件 下，與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包括但不限于改善的莖 桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產(chǎn)等。Vip3A蛋白對(duì)二化螟的"控制"和/或"防 治"作用是可以獨(dú)立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"二化螟害蟲的物質(zhì)的存在而 減弱和/或消失。具體地，轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何組 織同時(shí)和/或不同步地，存在和/或產(chǎn)生，Vip3A蛋白和/或可控制二化螟害蟲的另一種物 質(zhì)，則所述另一種物質(zhì)的存在既不影響Vip3A蛋白對(duì)二化螟的"控制"和/或"防治"作用， 也不能導(dǎo)致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而與 Vip3A蛋白無(wú)關(guān)。通常情況下，在大田，二化螟害蟲攝食植物組織的過(guò)程短暫且很難用肉眼 觀察到，因此，在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下，如轉(zhuǎn)基因 植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何組織存在死亡的二化螟害蟲、和/或 在其上停留生長(zhǎng)受到抑制的二化螟害蟲、和/或與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的 植物損傷，即為實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的方法和/或用途，即通過(guò)二化螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸 以實(shí)現(xiàn)控制二化螟害蟲的方法和/或用途。
[0035] 在本發(fā)明中，Vip3A蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry 類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因 植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物 (第1親本）可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Vip3A蛋白質(zhì)，第二種植物（第2親本）可以通過(guò) 遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過(guò)第1親本和第2親本 雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本 發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲害蟲中特定基因的表達(dá)。
[0037] 在分類系統(tǒng)上，一般主要根據(jù)成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態(tài)特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而螟蛾科是鱗翅目中種類最多的科之一，全