截短的輪狀病毒vp8蛋白及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉 及一種截短的輪狀病毒VP8蛋白，包含所述截短蛋白的融合蛋白，包含所述截短蛋白的綴 合物，所述截短蛋白和融合蛋白的編碼序列和制備方法，包含所述截短蛋白、融合蛋白或綴 合物的藥物組合物和疫苗，所述截短蛋白、融合蛋白、綴合物、藥物組合物和疫苗可用于預(yù) 防、減輕或治療輪狀病毒的感染及由輪狀病毒的感染所導(dǎo)致的疾病，例如輪狀病毒性胃腸 炎和腹瀉等。本發(fā)明還涉及上述截短蛋白、融合蛋白、綴合物用于制備藥物組合物或疫苗的 用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防、減輕或治療輪狀病毒的感染及由輪狀病毒的感染 所導(dǎo)致的疾病，例如輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉等。
【背景技術(shù)】
[0002] 輪狀病毒性腹瀉，是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒最主要的急性腸道傳染病，以腹瀉和脫 水為特征，死亡率高，造成了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。全世界每年大約有I. 1億5歲 以下兒童患輪狀病毒性胃腸炎，其中200萬(wàn)兒童必須住院治療，每年約453000兒童死于輪 狀病毒性腹瀉，其中發(fā)展中國(guó)家和欠發(fā)達(dá)國(guó)家的死亡病例占總數(shù)的85%以上（LeBaron，C. ff.etal. 1990)〇
[0003] 感染輪狀病毒（Rotavirus,RV)后，因脫水和電解質(zhì)紊亂導(dǎo)致重癥腹瀉和死亡，目 前尚無(wú)特效藥物，臨床治療也只是對(duì)癥治療，因此，急需開(kāi)發(fā)高效疫苗和治療策略，以降低 該病的發(fā)病率和死亡率，減輕該病所造成的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)（Parashar，U.D.etal. 2003)。
[0004] 然而，目前已上市的兩種輪狀病毒疫苗：RotaTeq (Merk)和Rotarix(GSK)，在輪狀 病毒威脅最嚴(yán)重的地方，疫苗免疫效力卻差強(qiáng)人意。同時(shí)，已報(bào)道，口服Rota Teq疫苗后可 能發(fā)生嚴(yán)重腹瀉以及疫苗株之間的分子重組；此外，RotaTeq和Rotarix與腸套疊的關(guān)聯(lián)性 并沒(méi)有被排除（L印age，P.et al.2007)。因此，本領(lǐng)域急需開(kāi)發(fā)新一代替代疫苗，所述疫苗 能夠同時(shí)引起顯著的細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答，產(chǎn)生能夠中和病毒感染性的抗體，從而可用于 預(yù)防、減輕或治療輪狀病毒的感染及由輪狀病毒的感染所導(dǎo)致的疾病。
[0005] 在最近幾年中，在輪狀病毒的疫苗研發(fā)上，注意力已從滅活和減毒病毒疫苗轉(zhuǎn)到 基因工程疫苗。
[0006] 輪狀病毒（Rotavirus，RV)屬于呼腸弧病毒科（Reoviridae)，其基因組由11節(jié)段 的dsRNA組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-4，VP6，VP7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1-6)。成熟的 病毒粒子為三層衣殼結(jié)構(gòu)，最外層由刺突狀蛋白VP4和糖蛋白VP7組成（Bridger，J.C.et al. 1976)。VP7與病毒在成熟的小腸上皮細(xì)胞中的復(fù)制直接相關(guān)。VP4蛋白不僅涉及RV的 粘附、侵入，而且與RV血凝性、中和活性、毒力以及蛋白酶裂解后的感染性增強(qiáng)等理化特性 相關(guān)。VP7和VP4都可獨(dú)立地誘導(dǎo)病毒中和抗體，抗VP7和VP4的抗體都可阻止病毒的侵 入。故VP7和VP4都成為疫苗開(kāi)發(fā)的首選目標(biāo)分子（Arias,C.F.etal. 2002)。
[0007]VP8蛋白是RV病毒顆粒的最外層結(jié)構(gòu)蛋白VP4(AAl-776)的一部分（AA1-231)。 VP4經(jīng)胰酶裂解后可形成VP8*和VP5*片段，而前者包含了VP4特異性的主要抗原表位 (Clark,S.M.etal. 1981)。這提示，可以利用VP8*蛋白來(lái)開(kāi)發(fā)新型RV亞單位疫苗。
[0008] 盡管已被分類(lèi)為結(jié)構(gòu)蛋白，現(xiàn)在已明確VP4在病毒入胞階段行使重要功能。因 此，VP4不僅在病毒結(jié)構(gòu)中，而且在RV復(fù)制過(guò)程中起到了極其重要的作用（Arias,C.F.et al. 1996) 〇
[0009]VP4在病毒入胞過(guò)程中發(fā)揮的作用取決于所述蛋白與靶細(xì)胞表面表達(dá)的特異性受 體的相互作用。在RV感染過(guò)程中，SA被認(rèn)為是第一個(gè)而且是最重要的細(xì)胞受體之一，它通 過(guò)與VP8結(jié)合而發(fā)揮作用。這種相互作用使得RV吸附至細(xì)胞表面，從而開(kāi)始了RV感染細(xì) 胞的第一步。對(duì)于NA敏感型的RV來(lái)說(shuō)，通過(guò)核磁共振光譜學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)，VP8*的核心部 位與a-N-乙酰神經(jīng)氨酸相結(jié)合，這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是高度保守的，不再需要其他糖基序的參 與；而對(duì)于NA非敏感型的RV株，VP8*是否也能利用相同的位點(diǎn)還不是很明確（Blanchard H,etal. 2007) 〇
[0010]VP8*與SA的第一步相互作用使得病毒粒子錨定在細(xì)胞表面。VP8*與SA基序相 互識(shí)別結(jié)合后，病毒外殼蛋白隨之發(fā)生構(gòu)象改變，以利于搜尋后續(xù)更多的特異性受體分子， 從而介導(dǎo)病毒下一步的入胞過(guò)程（DormitzerPR,etal. 2002)。
[0011] 針對(duì)VP8的中和免疫應(yīng)答能抑制病毒入胞，從而抑制靶細(xì)胞被感染，這使得該蛋 白被認(rèn)為是建立抗RV疫苗的優(yōu)秀靶標(biāo)。一個(gè)重要的先決條件是，VP8在病毒入胞前激起的 免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的中和抗體能與病毒的VP8相互作用，阻止病毒的VP8與細(xì)胞受體結(jié)合，從 而阻止VP8變構(gòu)，抑制病毒入胞。
[0012] 目前VP8的體外純化表達(dá)多基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，主要有可溶性表達(dá)純化和包 涵體純化兩種形式。
[0013] 可溶性表達(dá)純化雖然能保持VP8相對(duì)天然的構(gòu)象和高免疫中和活性，但可溶性表 達(dá)量低，純化方式相對(duì)復(fù)雜，純化所得的蛋白構(gòu)象不均一，存在多聚體，且穩(wěn)定性差，容易發(fā) 生降解（FavachoAR,etal. 2002)。特別地，本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)純化后的VP8在4°C 放置三天后，顯著降解（參見(jiàn)，下文實(shí)施例3和圖1)。這給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)VP8帶來(lái)了極 大的困難。
[0014] 包涵體純化方式雖然工藝相對(duì)比較簡(jiǎn)單，但純化所得的蛋白與天然蛋白在構(gòu)象上 存在差異，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力顯著減弱，不適宜用作疫苗。
[0015] 因此，如何獲得可溶性高表達(dá)的目的蛋白，并同時(shí)保持其天然構(gòu)象，成為了研究者 們的研究重點(diǎn)。
[0016] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN103319604A公開(kāi)了一種輪狀病毒VP8蛋白的亞單位重組蛋白， AVP8*，其由VP8全長(zhǎng)蛋白的AA64-223組成。通過(guò)體外純化表達(dá)該蛋白已發(fā)現(xiàn)，AVP8* 在穩(wěn)定性和均一性方面，明顯優(yōu)于VP8全長(zhǎng)蛋白。然而，本發(fā)明人在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)， AVP8*誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力明顯弱于VP8全長(zhǎng)蛋白（參見(jiàn)下文實(shí)施例6和圖5)。 這導(dǎo)致AVP8*不適宜用作高效的抗輪狀病毒疫苗。
[0017] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的VP8蛋白變體，其能夠通過(guò)可溶性表達(dá)純化 的方法方便地、高表達(dá)量地產(chǎn)生，能夠保持VP8蛋白的天然構(gòu)象，擁有良好的均一性和穩(wěn)定 性，并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的針對(duì)輪狀病毒的中和抗體，以便可開(kāi)發(fā)高效的抗輪狀 病毒疫苗，并使得大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效的抗輪狀病毒疫苗成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的發(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn)：N端截短了 21-60個(gè)氨基酸的VP8蛋白能夠 在大腸桿菌中以高表達(dá)量可溶性表達(dá)，且可通過(guò)色譜層析容易地進(jìn)行純化，并且由此所獲 得的高純度截短蛋白（純度可達(dá)到至少50 %或更高，例如60 %，70 %，80 %，90 %，95 %， 96%，97%，98%，99% )擁有良好的均一性和穩(wěn)定性（不易于降解），且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 高滴度的針對(duì)輪狀病毒的中和抗體，從而有效地解決了上述技術(shù)問(wèn)題。
[0019] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及N端截短了 21-60個(gè)氨基酸，例如21個(gè)、22個(gè)、23 個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37 個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、51 個(gè)、52個(gè)、53個(gè)、54個(gè)、55個(gè)、56個(gè)、57個(gè)、58個(gè)、59個(gè)或60個(gè)氨基酸的輪狀病毒VP8蛋白 或其變體。
[0020] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種截短的輪狀病毒VP8蛋白或其變體，其與野生型輪 狀病毒VP8蛋白相比，N端截短了 21-60個(gè)氨基酸，例如21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26 個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40 個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、51個(gè)、52個(gè)、53個(gè)、54 個(gè)、55個(gè)、56個(gè)、57個(gè)、58個(gè)、59個(gè)或60個(gè)氨基酸。
[0021] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型輪狀病毒VP8蛋白相比，該截短的輪狀病毒 VP8蛋白的N端截短了 21-60個(gè)氨基酸，例如21個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、 55個(gè)或60個(gè)氨基酸。
[0022] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該截短的輪狀病毒VP8蛋白（以下也簡(jiǎn)稱(chēng)為截短蛋白） 具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO: 6、SEQIDNO:7或者SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
[0023] 本發(fā)明人還對(duì)所獲得的截短蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果顯示，本發(fā)明的截短 蛋白與分子內(nèi)佐劑的組合可進(jìn)一步提高截短蛋白的免疫原性。特別地，當(dāng)將本發(fā)明的截短 蛋白與分子內(nèi)佐劑融合表達(dá)時(shí)，與單獨(dú)的VP8蛋白或截短蛋白相比，所獲得的融合蛋白具 有更高的免疫原性，且能夠?yàn)樗拗魈峁└叩拿庖弑Ｗo(hù)性。此外，還可通過(guò)將本發(fā)明的截短 蛋白與分子內(nèi)佐劑綴合來(lái)進(jìn)一步提高截短蛋白的免疫原性。
[0024] 因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽， 其中，所述第一多肽為如上所述的截短的輪狀病毒VP8蛋白或其變體；并且，所述第二多肽 為分子內(nèi)佐劑。
[0025] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白任選地還包含肽接頭，標(biāo)簽，信號(hào)肽，蛋白酶切 割位點(diǎn)，或其任何組合。
[0026] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分子內(nèi)佐劑選自白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197及 其截短蛋白例如CRM197的A亞基，霍亂毒素，霍亂毒素B亞基CTB，霍亂毒素突變體例如 CTA112/KDEV和CTA1-DD，大腸桿菌不耐熱毒素（LT)及其無(wú)毒突變體LTR192G，大腸桿菌不 耐熱毒素B亞基LTB，破傷風(fēng)毒素，及其任何組合。
[0027] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一多肽通過(guò)直接融合的方式或通過(guò)肽接頭與所 述第二多肽進(jìn)行連接。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一多肽位于所述第二多肽的N末 端或C末端，并且二者任選地通過(guò)肽接頭連接。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽接頭選 自GS(SEQIDN0:32)，GGS(SEQIDN0:33)，GGGS(SEQIDN0:34)，SGGGS(SEQIDN0:35)，GGGG(SEQIDNO:36)，GGSS(SEQIDNO:37)，GGGGS(SEQIDNO:38)，（GGGGS)3(SEQID NO: 39)，及其任何組合。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白在其N(xiāo)末端和/或C末端還包含標(biāo)簽。在某些實(shí) 施方案中，所述標(biāo)簽選自組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST)標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP) 標(biāo)簽、硫氧還蛋白（Trx)標(biāo)簽、NusA標(biāo)簽、二硫鍵異構(gòu)酶標(biāo)簽、DsbA標(biāo)簽、DsbC標(biāo)簽、SUMO 標(biāo)簽、msyB標(biāo)簽、TF標(biāo)簽、引發(fā)因子標(biāo)簽、泛素標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、9?光蛋白（例如 GFP)標(biāo)簽、生物素標(biāo)簽、親和素標(biāo)簽、及其任何組合。
[0029] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白還在其N(xiāo)末端包含信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中， 所述信號(hào)肽選自 0mpA，0mpT，pelB，CSP，mschito，MF-a，phol，HBM，t-pA，以及IL-3 的信號(hào) 肽。
[0030] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白還包含蛋白酶切割位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，所 述蛋白酶切割位點(diǎn)位于相鄰的兩個(gè)元件之間，所述元件選自所述第一多肽，第二多肽，肽接 頭，標(biāo)簽和信號(hào)肽。
[0031] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白具有SEQIDNO: 12-13和15-16任一項(xiàng) 所示的氨基酸序列。
[0032] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種綴合物，其包含如上所述的截短的輪狀病毒VP8 蛋白或其變體，以及與所述截短的VP8蛋白或其變體綴合的分子內(nèi)佐劑。
[0033] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分子內(nèi)佐劑選自白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197及 其截短蛋白例如CRM197的A亞基，霍亂毒素，霍亂毒素B亞基CTB，霍亂毒素突變體例如 CTA112/KDEV和CTA1-DD，大腸桿菌不耐熱毒素（LT)及其無(wú)毒突變體LTR192G，大腸桿菌不 耐熱毒素B亞基LTB，破傷風(fēng)毒素，及其任何組合。
[0034] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分子內(nèi)佐劑通過(guò)共價(jià)方式（例如化學(xué)偶聯(lián)）或非 共價(jià)方式（例如吸附）與所述輪狀病毒VP8蛋白或其變體綴合。
[0035] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的融合蛋 白的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。
[0036] 可用于插入目的多核苷酸的載體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于克隆載體和表達(dá) 載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體等等。
[0037] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。此類(lèi)宿主細(xì) 胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植 物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等）。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可 以是細(xì)胞系，例如293T細(xì)胞。
[0038] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上述截短蛋白或其變體，或上述融合蛋白，或上 述綴合物，或上述多核苷酸或載體或宿主細(xì)胞的組合物。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組 合物包含本發(fā)明的截短蛋白或其變體，或本發(fā)明的融合蛋白，或本發(fā)明的綴合物。
[0039] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含與野生型輪狀病毒VP8蛋白相 比，N端截短了 21-60個(gè)氨基酸，例如21個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、55個(gè)或 60個(gè)氨基酸的截短的輪狀病毒VP8蛋白。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含 具有選自SEQIDNO:1-8的序列的截短的輪狀病毒VP8蛋白。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的組合物包含具有選自SEQIDNO: 12-13和15-16的序列的融合蛋白。
[0040] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物或疫苗，其包含本發(fā)明的截短蛋白 或其變體，或本發(fā)明的融合蛋白，或本發(fā)明的綴合物，并且任選地還包含藥學(xué)可接受的載體 和/或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物或疫苗可以用于預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病 毒感染所導(dǎo)致的疾病例如輪狀病毒性胃腸炎或腹瀉等。
[0041] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物或疫苗還包含佐劑，例如鋁佐劑。
[0042] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的截短蛋白或其變體，或本發(fā)明的融合蛋白，或 本發(fā)明的綴合物以預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病的有