MIP3α-Fc融合蛋白及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白及其編碼核苷酸序列、以及該融合蛋白的制藥用途，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)是機體功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞生成，在啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的過程中處于中心環(huán)節(jié)。近年來大量的研究表明，通過腫瘤相關(guān)抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞，回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。同時樹突狀細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實體瘤內(nèi)浸潤的樹突狀細(xì)胞多，相對應(yīng)患者的預(yù)后也更好。因此，設(shè)法提供腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞的量，從而誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，是一種有效的治療腫瘤的手段。
[0003]趨化因子是一類控制細(xì)胞向炎性部位迀移的細(xì)胞因子，通過與其相應(yīng)受體的結(jié)合，調(diào)控免疫細(xì)胞分化、發(fā)育及定向迀移過程。巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-3a (macrophageinflammatory protein-3 α )，又稱趨化因子 20 (CCL20)，屬 CC 類趨化因子。ΜΙΡ-3 α 是目前最強的趨化樹突狀細(xì)胞的趨化因子，其特異性受體CCR6高表達(dá)于未成熟的DC細(xì)胞(imDCs)。這種未成熟的DC細(xì)胞捕獲抗原后轉(zhuǎn)而表達(dá)CCR7，分化成為成熟的樹突狀細(xì)胞。利用MIP_3a的這一特性，F(xiàn)ushimi等人將編碼ΜΙΡ-3 α的基因通過腺病毒轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤等四種惡性腫瘤中，結(jié)果這四種組織中都檢測到DC細(xì)胞的聚集，并且三種腫瘤生產(chǎn)受到明顯抑制。王甲南等人在小鼠肝癌模型上瘤內(nèi)注射ΜΙΡ-3α蛋白，明顯抑制了肝癌的生長。
[0004]然而，直接利用基因治療疾病的，目前尚未有臨床應(yīng)用，這主要涉及安全性問題。將外源的基因?qū)肷锛?xì)胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體，如Fushimi等人利用的腺病毒。問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險性。此外，無論哪種技術(shù)方法，外源基因都應(yīng)導(dǎo)入靶體細(xì)胞內(nèi)染色體特定基因座位，否則可能會導(dǎo)致正常細(xì)胞的基因突變，而目前尚未有成熟的方法解決這一問題。因此使用重組蛋白來進(jìn)行相關(guān)疾病的治療是更為合理的方法。但普通重組的ΜΙΡ-3α蛋白的體內(nèi)半衰期非常短，需要大劑量頻繁給藥，這大大限制了其臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服普通重組ΜΙΡ-3 α蛋白體內(nèi)半衰期短的不足之處，提供一種ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白及其用途。
[0006]本發(fā)明的MIP3a-Fc融合蛋白，所述的融合蛋白為巨噬細(xì)胞炎性蛋白ΜΙΡ3α和Fe的二聚體融合蛋白，所述的ΜΙΡ3 α與Fe之間通過免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)或柔性肽段連接。
[0007]所述MIP3a選自人或小鼠MIP3a ;所述的Fe選自人或小鼠的IgG、IgA、IgE、IgM及它們的亞型；所述Fe選自天然型或突變型免疫球蛋白Fe段。
[0008]所述的ΜΙΡ3α為人ΜΙΡ3α，其氨基酸序列如SEQ ID.1所示，所述的Fe為人IgGl-Fc，含鉸鏈區(qū)的的Fe的氨基酸序列如SEQ ID.2所示，所述的融合蛋白單鏈的氨基酸序列如SEQ ID.3所示，第70-71位氨基酸殘基為連接肽段。
[0009]所述的MIP3 α為小鼠ΜΙΡ3 α，其氨基酸序列如SEQ ID.4所示，所述的Fe為小鼠IgG2a-Fc，含鉸鏈區(qū)的Fe的氨基酸序列如SEQ ID.5所示，所述的融合蛋白單鏈的氨基酸序列如SEQ ID.6所示，第70-71位氨基酸殘基為連接肽段。
[0010]本發(fā)明提供了編碼融合蛋白的DNA分子，所述的DNA的核苷酸序列如SEQ ID.7所示。或如SEQ ID.8所示。
[0011]本發(fā)明提供了含有DNA分子的重組載體，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，如pcDNA3.1 (Invitrogen 公司)ο
[0012]本發(fā)明提供了含有重組載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物表達(dá)細(xì)胞，更為具體地優(yōu)選HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明提供了融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的腫瘤為肝癌。
[0014]本發(fā)明提供了含有融合蛋白的藥物組合物。
[0015]所述的藥物組合物還包括一種或幾種其他的誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟的組分或其它抗腫瘤藥物。
[0016]本發(fā)明提供了一種長效的ΜΙΡ3α-Fe融合蛋白。這種新型融合蛋白，在體內(nèi)外都體現(xiàn)出良好的生物活性和穩(wěn)定性，能夠趨化未成熟的樹突狀細(xì)胞，瘤內(nèi)注射ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白能有效抑制腫瘤的生長，同時具有長效血漿半衰期。
【附圖說明】
[0017]圖1是含有編碼ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白的核苷酸序列的重組載體結(jié)構(gòu)圖；
圖2是人ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖3是小鼠ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖4是純化后的人ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白的PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖5是純化后的小鼠ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白的PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖6為ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白的血漿半衰期測定結(jié)果；
圖7為ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白對樹突狀細(xì)胞的趨化作用圖；
圖8為ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白抑制腫瘤的生長曲線；
圖9為ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白的結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例1 ΜΙΡ3α-Fe融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 1、人ΜΙΡ3 α -Fe融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
以cDNA克隆(購自O(shè)rigene公司)為模板擴(kuò)增人MIP3 α基因(GeneBank:ΝΜ_001130046.1)，所用引物序列如下(包含Kozak序列、克隆位點、保護(hù)堿基)
上游引物:5’-ATATCCTTAAGCGGCCGCCGCCACCATGTGCTGTACCAAG-3’
下游引物:5’-ATATGGGATCCATGTTCTTGACTTTTTTACTG-3’
用50ul的PCR反應(yīng)體系，其中20mM的引物各加Iul ；10mM的dNTP加Iul ；pfu DNA聚合酶，2.5U/ul，加lul。反應(yīng)條件為95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 45秒，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期相符(320bp)。
[0019]將得到的PCR產(chǎn)物用凝膠回收后AfLII與BamHI限制性內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)酶切克隆至實驗室保存的pcDNA3.1-Fc表達(dá)載體中。篩選獲得的質(zhì)粒經(jīng)測序比對，與預(yù)期序列完全一致。結(jié)果如圖2所示。
[0020]2、小鼠MIP3 α -Fe融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
以cDNA克隆(購自O(shè)rigene公司)為模板擴(kuò)增小鼠MIP3 α基因(GeneBank:ΝΜ_016960.2)，所用引物序列如下(包含Kozak序列、克隆位點、保護(hù)堿基)
上游引物:5’-ATATCCTTAAGCGGCCGCCACCATGGCCTGCGGTGGCAAGCG-3’
下游引物:5’-ATATGGGATCCATCTTCTTGACTCTTAGGCTG-3’
用50ul的PCR反應(yīng)體系，其中20mM的引物各加lul ；10mM的dNTP加lul ；pfu DNA聚合酶，2.5U/ul，加lul。反應(yīng)條件為95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 45秒，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期相符(323bp)。
[0021]將得到的PCR產(chǎn)物用凝膠回收后AfLII與BamHI限制性內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)酶切克隆至實驗室保存的pcDNA3.1-Fc表達(dá)載體中。篩選獲得的質(zhì)粒經(jīng)測序比對，與預(yù)期序列完全一致。結(jié)果如圖3所示。
[0022]實施例2 Μ