一種基于peg修飾的j亞群禽白血病病毒免疫抑制性多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種基于PEG修飾的J亞群禽 白血病病毒免疫抑制性多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病，主要 臨床表現(xiàn)為髓細(xì)胞性白血病，并以免疫耐受、高死亡率、生長(zhǎng)遲緩和多組織器官出現(xiàn)腫瘤等 為主要特征。持久的免疫應(yīng)答損害導(dǎo)致繼發(fā)感染和混合感染頻發(fā)，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的健 康發(fā)展。對(duì)我國(guó)近十年來(lái)J亞群禽白血病流行狀況跟蹤調(diào)查顯示，J亞群禽白血病的早期 感染、多重感染已相當(dāng)普遍，呈現(xiàn)高感染率、高發(fā)病率；混合感染多發(fā)/頻發(fā)；腫瘤譜擴(kuò)展； 病理變化日益復(fù)雜，加之嚴(yán)重的免疫抑制降低了群體疫病的基本抵抗力，不僅造成了疾病 的多樣性，增加了繼發(fā)其它疾病的機(jī)率，而且顯著降低了疫苗對(duì)禽群的免疫保護(hù)，致使新城 疫、禽流感等一類傳染病頻頻出現(xiàn)免疫失敗，對(duì)于禽群的健康養(yǎng)殖危害嚴(yán)重。
[0003] 由于ALV-J病毒囊膜蛋白的超變性及其自身的免疫逃避能力，加之藥物、疫苗研 制的周期性，至今尚無(wú)有效控制和防治的藥物或疫苗用于臨床使用。國(guó)外是通過(guò)凈化來(lái)控 制本病的發(fā)生。由于凈化周期長(zhǎng)、成本高、加之多元化的養(yǎng)殖模式，目前，凈化在我國(guó)還未能 有效實(shí)施，大型養(yǎng)殖公司采用凈化，但內(nèi)源性病毒的誤淘問(wèn)題嚴(yán)重；不合理、不科學(xué)的凈化 措施，還會(huì)加速病毒的進(jìn)化和突變，使疾病愈加復(fù)雜。中小型養(yǎng)殖公司只能通過(guò)臨床癥狀觀 察淘汰雞只。從1999年至2014年以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)J亞群禽白血病的研究顯示：ALV-J的 感染率從未低于10%，基于臨床上對(duì)J亞群禽白血病防控的技術(shù)需求，研制安全高效的抗J 亞群禽白血病毒藥物、疫苗成為有效控制J亞群禽白血病亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于PEG修飾的J亞群禽白血病病 毒免疫抑制性多肽，提供了一種基于N-末端a-NH2PEG修飾的免疫抑制性多肽（ISU)及 其制備方法，采用本發(fā)明提供的PEG修飾后的ISU肽與現(xiàn)有技術(shù)中ISU免疫抑制肽相比能 更為顯著地抑制ALV-J復(fù)制，為J亞群禽白血病的防治和制備PEG化多肽疫苗提供科學(xué)基 礎(chǔ)和技術(shù)支撐，有效降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 本發(fā)明是基于下述理論基礎(chǔ)進(jìn)行的深入研究獲得的：
[0006] 天然多肽參與調(diào)控各種生理功能，在臨床應(yīng)用上具有非常重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。隨著 小分子化學(xué)和大分子蛋白藥物開(kāi)發(fā)難度的增大，越來(lái)越多地人們把注意力投向多肽和蛋白 質(zhì)類藥物。多肽具有選擇性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，副作用小，在常溫下更穩(wěn)定，技術(shù)成熟且成本低等 特點(diǎn)。但相對(duì)半衰期短，體內(nèi)穩(wěn)定性差，改造修飾或與其他材料組成穩(wěn)定的復(fù)合物來(lái)提高其 穩(wěn)定性是目前多肽藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。其中應(yīng)用最廣泛的修飾劑為單甲氧基聚乙二醇（mPEG) 及其衍生物。目前，PEG已應(yīng)用于多種蛋白藥物的修飾，如PEG修飾的門(mén)冬酰胺酶、干擾素 a2a和2b等多種蛋白質(zhì)藥物已陸續(xù)通過(guò)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用與臨床。PEG修飾化藥物有如下優(yōu) 點(diǎn)：改善藥物的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)（半衰期延長(zhǎng)，清除率下降，血藥峰濃度下降）；血漿藥物濃度波 動(dòng)減小；增強(qiáng)藥物在體內(nèi)的活性；降低藥物的毒性及免疫原性；增強(qiáng)藥物的理化穩(wěn)定性并 避免蛋白藥物的水解；增加蛋白質(zhì)藥物的可溶性等。
[0007]ALV-J是具有囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒，ALV-J前病毒具有典型慢性轉(zhuǎn)化型反轉(zhuǎn)錄病毒 完整的基因結(jié)構(gòu)，基因排列順序?yàn)長(zhǎng)TR-Leader-gag-pol-env-LTR主要包含gag、pol和env 三個(gè)基因。其中，env基因含有表面膜蛋白合成的遺傳信息，能夠編碼病毒囊膜糖基化蛋白， 包括膜表面糖蛋白亞單位gp85和跨膜蛋白亞單位gp37。gp85蛋白是病毒的主要抗原，病 毒中和反應(yīng)的作用位點(diǎn)，含有病毒-受體決定簇，主要起病毒粘附于易感動(dòng)物細(xì)胞的作用， 同時(shí)也能誘導(dǎo)有免疫力的雞群產(chǎn)生特異性抗體，稱為表面膜蛋白（SU);gp37包含，介導(dǎo)病 毒與細(xì)胞的融合過(guò)程，稱為跨膜蛋白（TM)。TM內(nèi)包括折疊的一段高度保守的免疫抑制序列 (免疫抑制區(qū)）ISU，ISU肽稱為免疫抑制性多肽，可以在體內(nèi)、外抑制淋巴細(xì)胞的活性，由27 個(gè)氨基酸組成：LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，不同ALV毒株ISU不存在毒株之間的差異， 具有極為顯著的臨床學(xué)意義。（ok)
[0008] 基于上述的PEG修飾技術(shù)，以及J亞群禽白血病病毒免疫抑制性多肽ISU的研究， 發(fā)明人獲得了本發(fā)明的具體技術(shù)方案：
[0009] 人工合成ISU肽并對(duì)其鑒定；檢測(cè)ISU肽的免疫活性；優(yōu)化高修飾率的PEG-ISU肽 制備條件；檢測(cè)PEG-ISU肽的修飾率；確證ISU肽與PEG-ISU肽體外抑制病毒復(fù)制效果確定 其有效劑量，更為具體步驟如下：
[0010] 已知禽白血病病毒各亞群代表毒株中TM蛋白內(nèi)高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，該氨基酸序列如序列表SEQIDN0:1所示，采用現(xiàn)有技術(shù) 人工合成上述序列所示的ISU肽，經(jīng)高效液相色譜法分析純化，純度為97%以上；
[0011] 上述獲得的人工合成ISU肽的免疫活性檢測(cè)：
[0012] 通過(guò)無(wú)菌研磨SPF雞的脾臟細(xì)胞獲取實(shí)驗(yàn)所需要的淋巴細(xì)胞，分別加入人工合成 的ISU肽、ALV-JNX0101病毒液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組和雞IgG作為無(wú)關(guān)蛋白組，培養(yǎng)12h后 經(jīng)流式細(xì)胞定量檢測(cè)；結(jié)果顯示，接種人工合成ISU肽和ALV-JNX0101兩個(gè)組的⑶4+T淋 巴細(xì)胞和⑶S+T淋巴細(xì)胞明顯少于接種無(wú)關(guān)蛋白雞IgG和空白對(duì)照組。由此可見(jiàn)，人工合成 ISU肽對(duì)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)具有良好的抑制作用。由于ALV-JNX0101感染細(xì)胞后需要經(jīng)過(guò)對(duì) 淋巴細(xì)胞進(jìn)行一系列作用才能產(chǎn)生免疫抑制效果，因此，12h后檢測(cè)結(jié)果顯示人工合成ISU 肽直接作用于淋巴細(xì)胞的抑制效果比相同條件下ALV-JNX0101產(chǎn)生的抑制效果更明顯；
[0013] 對(duì)mPEG-ALD修飾ISU肽的制備條件篩選：首先設(shè)置mPEG-ALD的初始修飾條件： 蛋白質(zhì)的反應(yīng)濃度為I. 6mg/mL，反應(yīng)物摩爾質(zhì)量比ISU:PEG= 1:5,NaBH3CN的終濃度Img/ ml，反應(yīng)體系的pH為5,反應(yīng)溫度為4°C，修飾反應(yīng)時(shí)間為24h，加入過(guò)量甘氨酸終止反應(yīng)。 分別對(duì)初始修飾條件中的PH、反應(yīng)物的摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，在 50mmol/L磷酸鹽緩沖液中，pH= 6. 0、4°C(PEG/protein)摩爾比為 3: 1，反應(yīng) 24h為PEG-ALD 修飾的最優(yōu)條件。其具體過(guò)程如下：
[0014] 在pH=6的磷酸鹽緩沖液中，取適量的ISU肽，使其反應(yīng)濃度為1.6mg/mL;再 加入一定量NaBH3CN,使其終濃度為lmg/ml;之后按反應(yīng)物摩爾比ISU:PEG=1:3來(lái)稱取 mPEG-ALD并加入到上述溶液中，在4°C下充分?jǐn)嚢杌靹?4h后加入過(guò)量的甘氨酸終止反應(yīng) 即得PEG修飾后的ISU肽，即目標(biāo)產(chǎn)物PEG-ISU肽。
[0015]PEG-ISU肽與ISU肽在體外抑制病毒復(fù)制檢測(cè)：對(duì)ALV-JNXOlOl病毒進(jìn)行TCID5q 測(cè)定，結(jié)果顯示其TCID5q= 10 4'5/100yL，說(shuō)明ALV-JNX0101稀釋IO4'5接種100yL可使 50%的細(xì)胞感染該病毒。將ISU肽與PEG-ISU肽分別接種在已經(jīng)接種ALV-J中國(guó)野毒株 NX0101的DFl細(xì)胞上，以同等條件下只接種同劑量ALV-J中國(guó)野毒株NXO101的細(xì)胞作為陽(yáng) 性對(duì)照，正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照，提取細(xì)胞RNA，熒光定量PCR法進(jìn)行病毒含量檢測(cè)。結(jié)果 顯示，DFl細(xì)胞維持培養(yǎng)7天后，ISU組與PEG-ISU組病毒含量均低于僅接種ALV-J組，而 且PEG-ISU組病毒含量低于ISU組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)PEG修飾的ISU具有比單純的ISU更好的免 疫效果。
[0016] PEG-ISU抑制病毒復(fù)制有效劑量的檢測(cè)：將DFl細(xì)胞接種30yLTCIDm = 10 4'5/100yL的ALV-J中國(guó)野毒株NX0101，12h后接種2倍比稀釋的PEG-ISU，以同等條件 下只接種同等劑量ALV-J中國(guó)野毒株NX0101的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，正常細(xì)胞作為陰性對(duì) 照，培養(yǎng)2天后，提取細(xì)胞RNA，熒光定量PCR法檢測(cè)病毒含量。結(jié)果顯示，接種2倍比稀釋 PEG-ISU的4個(gè)組中，病毒含量均明顯低于僅接ALV-J的陽(yáng)性對(duì)照組。與正常組檢測(cè)結(jié)果 對(duì)比，發(fā)現(xiàn) 30yLI. 6mg/mL的PEG-ISU肽可以完全抑制 30yLTCID5q = 10 4'5/100yLALV-J 復(fù)制，并且在一定范圍內(nèi)隨著多抗接種量的減少病毒含量增多。由此可見(jiàn)，PEG-ISU肽能明 顯地抑制ALV-J復(fù)制，且PEG-ISU肽的最適濃度為I. 6mg/mL。
[0017] 綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了提供了mPEG-ALD修飾ISU肽的具體制 備條件和制病毒復(fù)制的有效劑量，進(jìn)而提供了一種可有效控制J亞群禽白血病病毒感染的 方法，解決了養(yǎng)禽業(yè)J亞群禽白血病病毒感染有效控制的難題，與傳統(tǒng)方法相比較，能大幅 度的降低J亞群禽白血病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失，開(kāi)創(chuàng)了禽腫瘤性病毒防治研究的新 思路。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為人工合成的ISU肽HPLC純化圖；
[0019] 圖2為人工合成的ISU肽的MS鑒定圖；
[0020] 圖3為人工合成的ISU肽I體外免疫活性流式細(xì)胞定量檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0021] 圖4和圖5為圖3的柱狀示意圖；
[0022] 圖6-10為mPEG-ALD修飾ISU肽的制備條件篩選過(guò)程參考圖；
[0023] 圖11為PEG單修飾率檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0024] 圖12為RNA電泳及熒光定量PCR結(jié)果結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本實(shí)施例中除特殊說(shuō)明外，其他均采用現(xiàn)有技術(shù)完成。
[0026] 實(shí)施例1人工合成ISU肽并對(duì)其鑒定
[0027] 根據(jù)已知禽白血病病毒各亞群代表毒株中TM蛋白內(nèi)高度保守氨基酸序列： LQNRAAIDFLLLAQGHGCQDVEGMCCF，該氨基酸序列如序列表SEQIDN0:1所示，采用現(xiàn)有技術(shù) 人工合成上述序列所示的ISU肽。經(jīng)高效液相色譜法分析純化（如圖1所示）和MS鑒定 (如圖2所示），鑒定其純度為97 %以上。
[0028] 實(shí)施例2ISU肽的免疫活性檢測(cè)
[0029] 通過(guò)無(wú)菌研磨SPF雞的脾臟細(xì)胞獲取實(shí)驗(yàn)所需要的淋巴細(xì)胞，為ISU免疫活性實(shí) 驗(yàn)提供所必需的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。將來(lái)源于脾臟的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì) 數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為I.OXIO6/孔，分成4個(gè)組別，組別1加入ISU肽濃度為每孔20yg/ml， 組別2加入30yIALV-JNX0101病毒液，組別3加入雞IgG作為無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照，濃度為每孔 20yg/ml，組別4以正常生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞作為空白對(duì)照，然后相同條件下，每組別做3個(gè)平 行對(duì)照，在37°C的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h后進(jìn)行流式細(xì)胞定量檢測(cè)。
[0030] 流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法
[0031] 收集脾細(xì)胞，分別加入2%?8〇8 131^€61'溶液11111，吹勾，4°〇 2000印1]1離心5111；[11，然 后倒掉上清液。加入2%FacsBuffer溶液200yL，吹勾。每管取出IOyL加入三管，作為 陰性對(duì)照組、⑶4+抗體單染組和⑶8 +抗體單染組，然后4°C2000rpm離心5min，然后倒掉上 清液，加入適量的⑶4+抗體和⑶8 +抗體混合液，⑶4 +抗體單染組和⑶8 +抗體單染組分別只 加入適量的⑶4+抗體液和⑶8 +抗體液，然后分別吹勻，4°