專利名稱：一種檢測Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
Bt蛋白是由蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成過程中產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白，其分子結(jié)構(gòu)復雜，在伴孢晶體內(nèi)是以毒素蛋白原的形式存在，在昆蟲腸道內(nèi)可被蛋白酶水解而被活化; 活化的Bt毒蛋白可與昆蟲腸道上皮細胞表面的特異受體相互作用，誘導并引起細胞膨脹甚至裂解，導致昆蟲停止進食而最終死亡。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將Bt毒蛋白基因引入農(nóng)作物中，為控制害蟲危害農(nóng)業(yè)提供了新的思路。目前應用最廣的主要是Cry類Bt毒蛋白，轉(zhuǎn)Cry類Bt抗蟲基因棉花、玉米和馬鈴薯等都已經(jīng)進入了商業(yè)化生產(chǎn)。對于轉(zhuǎn)基因植物，在實際大田生產(chǎn)過程中，抗蟲性的強弱與植物體內(nèi)的殺蟲蛋白含量直接相關(guān)，亦即與基因在植物體內(nèi)的表達水平直接相關(guān)，因此準確地定量出植物器官、組織中毒蛋白的含量，對于指導抗蟲作物生產(chǎn)具有特別重要的意義。殺蟲蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量極低，僅占植物組織中可溶性蛋白含量的 0. 001% -0. 3%，但迄今對于轉(zhuǎn)基因植物中Bt殺蟲蛋白的檢測方法不多，且檢測靈敏度、檢測限和抗干擾能力等亟待提高。目前，有關(guān)CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白免疫檢測技術(shù)的研究報告和相關(guān)專利技術(shù)國內(nèi)外報道很少，迫切需要開發(fā)高效、準確、快速的新型免疫檢測技術(shù)禾口廣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于進一步填補CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白免疫檢測技術(shù)的研發(fā)空白，提供一種檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。本發(fā)明的另一目的是提高該免疫納米磁顆粒的制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，該免疫納米磁顆粒由抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體包被，磁顆粒大小150 200nm,具體通過如下步驟制備(1)將 0. 85 1. 5g 無水 FeCl3 和 0. 6 1. 2g FeCl2 · 4H20 溶解于 IOOml 超純水中，加熱攪拌至完全溶解；(2)在溫度80-85°C時，加入15 20ml 2 5M NaOH溶液于步驟(1)所得混合液中，反應2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，得到水
溶性羧基納米磁顆粒；(3)將所述的水溶性羧基納米磁顆粒在外加磁場作用下用無水乙醇洗滌3 5次， 以超純水分散保存；(4)將鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體，通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)所述的
4水溶性羧基納米磁顆粒，得到檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。其中，步驟O)中所述的PAA溶液是分子量為1800 2000的短鏈聚丙烯酸溶液。 短鏈聚丙烯酸可以作為表面修飾劑和活性劑，其鏈上的羧基團結(jié)合于狗304納米磁顆粒表面，具有疏水性質(zhì)的羧基使納米磁顆粒穩(wěn)定分散于水性溶劑。步驟(3)中所述的外加磁場為恒流電磁場，磁感應強度為30mT。步驟中所述的羧基-氨基化學偶聯(lián)法是采用碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺活化法偶聯(lián)抗體首先用30mM、pH = 5的2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗所述的水溶性羧基納米磁顆粒，使所述的水溶性羧基納米磁顆粒分散于2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液中，終濃度為40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基納米磁顆粒的 2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亞胺、50mM N-羥基丁二酰亞胺溶液各50 100 μ 1，室溫震蕩30 40min，在磁場作用下棄上清，用2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的納米磁顆粒；取1. 09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體100 200 μ 1，加入所述的已活化的納米磁顆粒，室溫震蕩30 40min，磁性分離，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸緩沖液多次洗滌，得到所述的檢測CrylAb/ CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。步驟(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體優(yōu)選鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。所述的鼠抗Cry lAb/Cry IAc殺蟲蛋白多克隆抗體是將Cry lAb/Cry IAc殺蟲蛋白與弗氏佐劑混合后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。一種檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒的制備方法，包含如下步驟(1)將 0. 85 1. 5g 無水 FeCl3 和 0. 6 1. 2g FeCl2 · 4H20 溶解于 IOOml 超純水中，加熱攪拌至完全溶解；(2)在溫度80-85°C時，加入15 20ml 2 5M NaOH溶液于步驟(1)所得混合液中，反應2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，得到水
溶性羧基納米磁顆粒；(3)將所述的水溶性羧基納米磁顆粒在外加磁場作用下用無水乙醇洗滌3 5次， 以超純水分散保存；(4)將鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體，通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)所述的水溶性羧基納米磁顆粒，得到檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。其中，步驟O)中所述的PAA溶液是分子量為1800 2000的短鏈聚丙烯酸溶液。 短鏈聚丙烯酸可以作為表面修飾劑和活性劑，其鏈上的羧基團結(jié)合于狗304納米磁顆粒表面，具有疏水性質(zhì)的羧基使納米磁顆粒穩(wěn)定分散于水性溶劑。步驟(3)中所述的外加磁場為恒流電磁場，磁感應強度為30mT。步驟中所述的羧基-氨基化學偶聯(lián)法是采用碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺活化法偶聯(lián)抗體首先用30mM、pH = 5的2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗所述的水溶性羧基納米磁顆粒，使所述的水溶性羧基納米磁顆粒分散于2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液中，終濃度為40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基納米磁顆粒的 2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液100μ 1，依次加入50mM碳化二亞胺、50mM N-羥基丁二酰亞胺溶液各50 100 μ 1，室溫震蕩30 40min，在磁場作用下棄上清，用2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的納米磁顆粒；取1. 09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體100 200 μ 1，加入所述的已活化的納米磁顆粒，室溫震蕩30 40min，磁性分離，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸緩沖液多次洗滌，得到所述的檢測CrylAb/ CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。步驟(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體為鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。所述的鼠抗Cry lAb/Cry IAc殺蟲蛋白多克隆抗體是將Cry lAb/Cry IAc殺蟲蛋白與弗氏佐劑混合后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用水溶性羧基化納米!^e3O4磁顆粒為基質(zhì)材料，用化學偶聯(lián)方法偶聯(lián)抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體，首次制備成功了檢測CrylAb/ CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。該制備方法取材簡單、操作方便、重復性高；所制備的免疫納米磁顆粒粒徑小，品相均勻，使用該免疫納米磁顆粒通過化學發(fā)光EIA法檢測 CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白樣品，靈敏度較高，最大檢測到的蛋白濃度是lOOOng/ml，最小檢測濃度是lng/ml ；而且易于磁富集而排除雜質(zhì)分子干擾。


圖1水溶性羧基納米磁顆粒JEOL掃描電鏡照片。圖2水溶性羧基納米磁顆粒的FIlR光譜分析(紅色示對照)。圖3水溶性羧基納米磁顆粒的磁滯回線(紅色示對照)。圖4水溶性羧基納米磁顆粒的X射線衍射分析(紅色示對照)。圖 5CrylAb/CryIAc 殺蟲蛋白抗體 1Western Blotting 檢測分析。圖6抗血清效價測定。圖7免疫納米磁顆?；瘜W發(fā)光EIA法檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白。
具體實施例方式實施例1水溶性羧基納米磁顆粒的制備1、將0. 85g無水FeCl3和0. 6g FeCl2 · 4H20溶解于IOOml超純水中，加熱攪拌至
完全溶解，此時溶液呈透明黃色；2、以乙二醇為溶劑配制0. 05M的PAA溶液并配制5M的NaOH水溶液。當溫度維持在80 85°C時，加入15ml 5M的NaOH溶液于步驟1所得混合液中，溶液顏色變黑，待反應 2min后，加入20ml 0. 05M的PAA溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，得到水溶性羧基納米磁顆粒。 整個實驗過程在恒溫水浴和氮氣保護下進行；3、將上述水溶性羧基納米磁顆粒在外加磁場作用下(恒流電磁場，磁感應強度為 30mT)用無水乙醇洗滌3次，以超純水分散保存；4、制備完成的水溶性羧基納米磁顆粒形態(tài)和大小，結(jié)果如圖1所示。通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對制備完成的水溶性羧基納米磁顆粒進行表征，具體的操作步驟如下1)將制備好的水溶性羧基納米磁顆粒冷凍干燥后，加入KBr壓片；
2)以相同方法處理作為對照的Fe53O4粉末；3)通過傅里葉紅外變換光譜儀(FTIR-8400型)，記錄波數(shù)在OIOOOcnT1范圍內(nèi)的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)，結(jié)果如圖2所示。通過振動樣品磁強計(Model 4HF型)檢測制備完成的水溶性羧基納米磁顆粒的磁性(磁滯回線)，磁場強度范圍為-6000 60000e，結(jié)果如圖3所示。通過R-AXIS SPIDER衍射儀記錄制備完成的水溶性羧基納米磁顆粒衍射圖譜，具體的操作步驟如下1)采用 R-AXIS SPIDER 衍射儀，靶面為 Mo 和 Cu，λ = 1. 79025 X l(Tlclm，入射狹縫 1°，接受狹縫為0.6°，防散射狹縫1°，管壓為32. 5kV，管流30mA;2)將納米磁顆粒取適量裝到特制玻璃樣品板上，壓實后放入衍射儀中；3)啟動衍射儀，開始自動掃描記錄樣品衍射圖譜，結(jié)果如圖4所示。由圖1所示，制備的水溶性羧基納米磁顆粒直徑約150nm，分散性良好；由圖2磁滯回線顯示，樣品的矯頑力較小，磁滯不明顯，表現(xiàn)出良好的超順磁性；由圖3X射線衍射分析所示，樣品以I^e3O4為主，衍射峰比較尖銳，說明顆粒結(jié)晶性能良好；由圖4傅里葉變換紅外光譜檢測所示，PAA的FIlR中HlOcnT1處顯示出特征吸收峰，表明PAA已成功修飾于納米磁顆粒表面。綜合上述檢測結(jié)果顯示，制備的水溶性羧基納米磁顆粒性能良好，滿足目的需要。實施例2抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體的制備1、根據(jù) CrylAb/CrylAc 殺蟲蛋白(SEQ ID NO. 1)和基因(SEQ ID N0. 2)的一致序列，采用全基因合成技術(shù)構(gòu)建CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白基因，共660對堿基，克隆至融合表達載體pGEX-4T-2 (插入位點BamH I和Ml I)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞中，通過細菌體外表達、Glutathione Sepharose 4B親合層析和融合蛋白凝血酶在柱切割等操作步驟，得到CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白；2、將CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白5ml (濃度1. lmg/ml)與弗氏佐劑5ml混合后，充分乳化。采用背部多點注射法免疫BALB/c小鼠。每次免疫的抗原量約10 μ g，免疫三次。每次免疫兩周后經(jīng)尾動脈取血檢測抗體效價。收集抗體效價在1 51200以上的血清進行后續(xù)操作。3、以4μ g/ml濃度的抗原(CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白)包被酶標板，100 μ 1/孔， 4°C過夜；4、洗滌后，加入待檢的血清樣品，100 μ 1/孔，37°C 1小時；設陰性對照孔；5、洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100 μ 1/孔，37°C避光顯色15 分鐘；用2M H2SO4終止反應后，閱讀各孔的A490值。對制備的CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體做^festern Blotting分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體檢測目標蛋白分子大小正確，印跡清晰，對于不同濃度的目標蛋白檢測效果良好。經(jīng)ELISA法檢測，抗體能與CrylAb/CrylAc蛋白特異性結(jié)合，其相關(guān)系數(shù)達到顯著水平，效價> 1 6000，結(jié)果如圖6所示。實施例3免疫納米磁顆粒的制備1、用30mM、pH = 5的MES緩沖液在外加磁場作用下清洗實施例1制備的水溶性羧基納米磁顆粒，使水溶性羧基納米磁顆粒分散于MES緩沖液中，終濃度為40mg/ml ；
7
2、取水溶性羧基納米磁顆粒懸浮液100 μ 1，依次加入EDC(50mM)、NHS(50mM)溶液各50 μ 1，室溫震蕩30min ；3、在磁場作用下棄上清，用MES溶液清洗3次；4、取實施例2制備的抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的多克隆抗體(1. 09mg/ ml) 100 μ 1，加入已活化的水溶性羧基納米磁顆粒，室溫震蕩30min ；5、磁性分離，收集上清，用0. 02M磷酸緩沖液多次洗滌，得到免疫納米磁顆粒。實施例4用本發(fā)明所述的制備方法制備完成的用于檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，利用化學發(fā)光EIA進行檢測，具體的操作步驟如下1、以5 μ g/ml的抗原(CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白)包被96孔酶標板，100 μ 1/孔， 4°C過夜；2、洗滌后，加入實施例3制備的免疫納米磁顆粒樣品，100 μ 1/孔，37°C 1小時；設陰性對照孔；3、洗滌后，加入ALP(堿性磷酸酶)標記的羊抗鼠IgG抗體(美國ftOgteintech 公司),100 μ 1/ 孔，37 0C 20 分鐘；4、加入化學發(fā)光底物AMPPD(3-(2-螺旋金剛烷)_4_甲氧基_4_(3_磷氧酰)_苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷)100 μ 1，放置30分鐘，用0.2Μ NaOH終止反應后，閱讀各孔的Α470值。通過化學發(fā)光EIA檢測，CrylAb/CrylAc抗體蛋白包裹的納米磁顆粒其發(fā)光單位為67. 5kCOimts/y g磁顆粒；發(fā)光強度和CrylAb/CrylAc蛋白濃度相關(guān)性表明，隨著蛋白濃度的不斷增加，發(fā)光強度不斷下降，范圍在l-103ng/ml ；最大檢測到的蛋白濃度是IOOOng/ ml，最小檢測濃度是lng/ml，結(jié)果如圖7所示。由此可見，本發(fā)明所制備的用于檢測CrylAb/ CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒靈敏度較高，易于磁富集，操作簡單、重復性強，顯示了良好的應用前景。
權(quán)利要求
1.一種檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于，該免疫納米磁顆粒由抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體包被，磁顆粒大小150 200nm，具體通過如下步驟制備(1)將0.85 1. 5g無水!^eCl3和0. 6 1. 2g FeCl2 ·4Η20溶解于IOOml超純水中，加熱攪拌至完全溶解；(2)在溫度80-85°C時，加入15 20ml2 5M NaOH溶液于步驟(1)所得混合液中， 反應2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，得到水溶性羧基納米磁顆粒；(3)將所述的水溶性羧基納米磁顆粒在外加磁場作用下用無水乙醇洗滌3 5次，以超純水分散保存；(4)將鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體，通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)所述的水溶性羧基納米磁顆粒，得到檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于步驟O)中所述的PAA溶液是分子量為1800 2000的短鏈聚丙烯酸溶液；步驟(3)中所述的外加磁場為恒流電磁場，磁感應強度為30mT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于步驟(4)中所述的羧基-氨基化學偶聯(lián)法是采用碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺活化法偶聯(lián)抗體首先用30mM、pH = 5的2_(N_嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗所述的水溶性羧基納米磁顆粒，使所述的水溶性羧基納米磁顆粒分散于2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液中，終濃度為40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基納米磁顆粒的2_(N_嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亞胺、50mM N-羥基丁二酰亞胺溶液各 50 100 μ 1，室溫震蕩30 40min，在磁場作用下棄上清，用2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的納米磁顆粒；取1.09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體100 200 μ 1，加入所述的已活化的納米磁顆粒，室溫震蕩30 40min，磁性分離， 收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸緩沖液多次洗滌，得到所述的檢測CrylAb/CrylAc 殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于步驟(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體為鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體是將CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白與弗氏佐劑混合后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。
6.一種權(quán)利要求1所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒的制備方法，其特征在于，該方法包含如下步驟(1)將0.85 1. 5g無水!^eCl3和0. 6 1. 2g FeCl2 ·4Η20溶解于IOOml超純水中，加熱攪拌至完全溶解；(2)在溫度80-85°C時，加入15 20ml2 5M NaOH溶液于步驟(1)所得混合液中， 反應2 5min，加入15 20ml 0. 05 1. OM的PAA溶液，繼續(xù)加熱攪拌30min，得到水溶性羧基納米磁顆粒；(3)將所述的水溶性羧基納米磁顆粒在外加磁場作用下用無水乙醇洗滌3 5次，以超純水分散保存；(4)將所述的鼠抗CrylAb/CryIAc殺蟲蛋白抗體，通過羧基-氨基化學偶聯(lián)法偶聯(lián)所述的水溶性羧基納米磁顆粒，得到檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。
7.按權(quán)利要求5所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒的制備方法， 其特征還在于，所述步驟( 中的PAA溶液是分子量為1800 2000的短鏈聚丙烯酸溶液； 所述步驟(3)中的外加磁場為恒流電磁場，磁感應強度為30mT。
8.按權(quán)利要求6所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒的制備方法， 其特征還在于步驟(4)中所述的羧基-氨基化學偶聯(lián)法是采用碳化二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺活化法偶聯(lián)抗體首先用30mM、pH = 5的2-(N-嗎啉)_乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗所述的水溶性羧基納米磁顆粒，使所述的水溶性羧基納米磁顆粒分散于2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液中，終濃度為40 60mg/ml ；取所述的含水溶性羧基納米磁顆粒的 2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液100 μ 1，依次加入50mM碳化二亞胺、50mM N-羥基丁二酰亞胺溶液各50 100 μ 1，室溫震蕩30 40min，在磁場作用下棄上清，用2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸溶液清洗3次，得已活化的納米磁顆粒；取1.09mg/ml所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體100 200 μ 1，加入所述的已活化的納米磁顆粒，室溫震蕩30 40min，磁性分離，收集收集上清，用0. 02M、pH = 7. 4磷酸緩沖液多次洗滌，得到所述的檢測CrylAb/ CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于步驟(4)所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白抗體為鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，其特征在于所述的鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體是將CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白與弗氏佐劑混合后免疫小鼠，經(jīng)分離純化得到鼠抗CrylAb/CrylAc殺蟲蛋白多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒及其制備方法。本發(fā)明檢測Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白的免疫納米磁顆粒，由抗Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白多克隆抗體包被，磁顆粒大小150～200nm。該免疫納米磁顆粒是通過改進的化學沉淀法制備具有高度水溶性的羧基納米磁顆粒，再將抗Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白抗體通過化學偶聯(lián)法偶聯(lián)活化后的納米磁顆粒而得到。使用該免疫納米磁顆粒通過化學發(fā)光EIA法檢測Cry1Ab/Cry1Ac殺蟲蛋白樣品，靈敏度較高，最大檢測到的蛋白濃度是1000ng/ml，最小檢測濃度是1ng/ml；而且易于磁富集而排除雜質(zhì)分子干擾。
文檔編號G01N33/531GK102175876SQ20111003624
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者潘衛(wèi)東, 陳法軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學