一種檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及糖化血紅蛋白檢測技術領域，尤其涉及一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一組病因和發(fā)病機制尚未完全明了的內分泌代謝疾病，目前發(fā)病率僅次 于心血管疾病和腫瘤。目前，糖尿病的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，是嚴重威脅人類健康的世界 性公共衛(wèi)生問題。傳統的糖尿病診斷和治療監(jiān)測采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐 量試驗等，但是血糖參數僅代表抽血時的瞬間血糖水平，而糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin, GHb)作為反映長期血糖水平的金標準，也是監(jiān)測糖尿病治療的重要指標 GHb是指結合了任何形式碳水化合物的血紅蛋白（hemoglobin，Hb)。人類Hb主要是HbA (95%~97%)、!《^2(〈3%)、肋？(〈1%)。!《^中未結合糖的為肋40(90%)、結合糖的為肋八1 (5%~7%)即GHb。其中HbAl包括結合果糖-1，6_二磷酸葡萄糖的HbAlal、結合葡萄糖-6-磷 酸的HbAla2、結合未知碳水化合物的HbAlb和結合葡萄糖的HbAlc，HbAlc占 GHb的70%~ 90%。池六1(：在組織中由葡萄糖的游離醛基與HbA的β鏈N末端纈氨酸的氨基進行不可逆的非 酶促的反應，此過程稱為糖基化，GHb的形成主要取決于血糖濃度及血糖與Hb的接觸時間。 GHb可以反映最近2~3個月的平均血糖水平。2002年美國糖尿病協會已明確規(guī)定應定期檢 測HbAlc，并將其作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標準。
[0003] GHb的測定方法有幾十種之多，目前常用的基本上可分為兩大類:一類是基于GHb 和Hb的電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于Hb上糖化基團的結構特點，如 親和層析法、免疫法和酶法等。多個研究表明不同的原理測定的結果存在差別，而糖尿病患 者治療目標要求測定值不受測定方法的影響，因此在實驗室里應用不同GHb測定方法所產 生的結果可比性非常重要。
[0004] 離子交換層析法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血紅蛋白β鏈N末端繳氨酸糖化后所 帶電荷不同而建立。但由于此方法所使用的儀器昂貴，難以在比較基層的醫(yī)院和實驗室普 及;微柱法手工操作步驟繁瑣，層析時間和微柱的質量不易控制，易產生操作技術誤差，重 復性欠佳；而且干擾因素很多，尤其對pH值和溫度的變化敏感，HbF及變異血紅蛋白（ HbS、HbC、HbE等）對結果干擾，干擾程度根據柱的分離能力而定，所以一定要仔細觀察圖 譜。
[0005] 電泳法（以瓊脂凝膠電泳為例)Hb于酸性緩沖液條件下（pH6. 0)在瓊脂糖凝膠 上的電泳迀移取決于Hb在凝膠上的吸附情況及其所帶的電荷。該方法標本用量少，分辨率 高，重復性好，有研究發(fā)現血糖值與HbAlc值有顯著相關性，且結果不受溫度及胎兒血紅蛋 白的影響。另外，因為它可測定的Hb線性范圍較寬（13.0-39.0g/L)，可發(fā)現異常Hb。該方法 的缺點是每次測定均需成批進行樣本分析，速度比較慢，無法進行實時個體檢測，自動化程 度較差，所測結果與技術人員掃描和對電泳的波峰判斷有關，受主觀因素影響，并且費用昂 貴，因此并不適合臨床實驗室常規(guī)使用。
[0006] 親和層析法硼酸具有與整合在Hb分子上葡萄糖的順位二醇基作可逆結合反應的 性質。通常使用的是間-氨基苯硼酸瓊脂糖，將血樣本加到層析柱后，所有的GHb與硼酸結合 留在柱中，非GHb直接流出層析柱;再加入高濃度也包含順位二醇基的多羥基復合物(如山 梨醇），GHb與硼酸的結合被替換而被洗脫下來，分別測量兩組分，并計算比值。親和層析法 對變異血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對其他方法不敏感，但測定的是HbAi即6池總量。 另外，金標法和硼酸親和層析法密切相關，操作均簡便易行、快速準確、試劑穩(wěn)定。據報道， 該法不受除HbS和HbC之外的任何血紅蛋白變異體和降解產物的干擾，結果可靠，比較適用 于臨床隨時檢測。
[0007] 免疫比濁法利用抗原、抗體反應的原理進行測定。GHb的β鏈N末端提供了一個容 易被抗體識別的抗原表位，可以用單克隆抗體或多克隆抗體，特異識別GHb的β鏈Ν末端最后 4~6個氨基酸組成的抗原表位，結合比色或比濁法，以GHb為標準，測定HbAlc的含量，再 測定Hb的含量，最后計算出HbAlc占總Hb的百分含量。此類方法只能作為判斷糖尿病血 糖水平的指標，不可用于變異血紅蛋白的研究。與其相比，免疫比濁法檢測的方法更為簡 單，不需要額外添加儀器，為臨床提供了一種快速、準確、可靠、簡便的常規(guī)方法，在臨床應 用中有著更為廣闊的前景。
[0008] 酶法全血經溶血處理后，用特異蛋白內切酶將Hb酶解消化成果糖氨基酸，再經果 糖氨基酸氧化酶作用下產生過氧化氫(hydrogen peroxide，H2〇2)，H2〇2的濃度與血液中GHb 的含量成正比，H2〇2在過氧化物酶的作用下與相應的色原耦聯，從而根據顏色變化程度可得 H2〇2濃度，進而得知樣本中GHb的含量；同時測定同一管消化液的總Hb濃度，計算GHb和Hb的 濃度比值，即為GHb結果。此法提供了一個像臨床生化反應一樣快速均一的反應系統（如葡 萄糖、谷氨酸氨基轉移酶），有很好的精密度，可同時檢測GHb和Hb，且與常規(guī)HPLC法和免疫 測定法有很好的相關性。
[0009] 離子捕獲法應用抗原抗體反應原理，并聯以熒光標志物，通過連接帶負電的多陰 離子復合物，吸附到帶正電的的纖維表面，經過一系列徹底清洗等步驟后，測定熒光強度變 化率，計算GHb濃度。其檢測系統易于規(guī)范和重復，可減少操作技術誤差，檢測的敏感度和 特異度高，批內、批間變異系數小。有文獻報道此法影響因素少，準確度高，回收率達98. 85%，交叉污染率<0.01%。該方法是近幾年發(fā)展起來的新方法，采用自動分析儀，適用于批量 標本的檢測。
[0010] 對基層醫(yī)療單位而言，上述幾種方法，要么試劑、儀器成本高，要么操作復雜、要么 準確度低，穩(wěn)定性差，且均不適合社區(qū)及基層醫(yī)院。因此，需要對現有的測定糖化血紅蛋白 比例的方法進行改進，提出一種新方法來解決這些問題。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于，克服現有技術的不足，提供了一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒，只需要微量的全血樣本，即可在3~5分鐘內實現定量檢測糖化血紅蛋白的含量， 且結構簡單，適合大規(guī)模生產。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用上述試劑盒檢測糖化血紅蛋白的檢測方法， 只需要微量的全血樣本，即可在3~5分鐘內實現定量檢測糖化血紅蛋白的含量，特異性好， 靈敏度高。
[0013]為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案為:提供一種檢測糖化血紅蛋白的一體 化試劑盒，包括:反應分析墊、位于所述反應分析墊右側的裝有親和反應液的親和反應液微 孔、位于所述親和反應液微孔右側的裝有清洗液的清洗液微孔和位于所述清洗液微孔右側 的條碼區(qū)。
[0014]優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述親和反應液微孔的孔徑 為5mm~6mm，高度8mm~10mm，內裝有250yL親和反應液。
[0015] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述親和反應液包括如下濃 度的組分： 甘氛酸 20~150mmol/L， 氯化鋅 2~50mmol/L， 氯化鎂 5~50mmol/L， 氯化鉀 50~500mmol/L， 疊氮化鈉 0.1~1.5g/L， 藍色苯硼酸染料 0.05~0.50 mmol/L， 甲醇 體積濃度為1.5~5.0%， 乙基苯基聚乙二醇質量體積濃度為0.05~0.1%。優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一 體化試劑盒中，所述親和反應液的PH值為8.5~10.5。
[0016] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述清洗液微孔的孔徑為5mm ~6mm，高度為8mm~10mm，內裝有60~80yL的清洗液。
[0017] 優(yōu)選的，上述檢測糖化血紅蛋白的一體化試劑盒中，所述清洗液包括如下濃度的 組分： 三羥甲基氨基甲烷 20~200mmol/L， 疊氮化鈉 0.1~1.5g/L， 聚乙二醇辛基苯基醚體積濃度為0.05~0.5%。
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