專利名稱：：菌蚋熒光素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及熒光素酶。具體地，本發(fā)明涉及熒光素酶的蛋白質(zhì)和肽，其功能是催化依賴ATP的發(fā)光反應(yīng)，該反應(yīng)在波譜藍(lán)光部分內(nèi)產(chǎn)生最大強(qiáng)度的發(fā)光光譜，本發(fā)明還涉及使用這些熒光素酶的檢驗(yàn)。在進(jìn)一方面，本發(fā)明涉及自菌蚋(^rac/z"ocamj^)屬(雙翅目)的有機(jī)體分離的熒光素酶。
背景技術(shù)：
：使用報(bào)道基因分子或標(biāo)記來(lái)定性或定量地監(jiān)控分子行為是已經(jīng)確立的。它們見(jiàn)于如下用途的檢驗(yàn)中用于醫(yī)學(xué)診斷，用于檢測(cè)工業(yè)環(huán)境中的毒素和其它物質(zhì)，以及用于生物、生物醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中。這些檢驗(yàn)包括免疫檢驗(yàn)、核酸探針?lè)肿与s交檢驗(yàn)和其中通過(guò)在特定啟動(dòng)子控制下的表達(dá)而產(chǎn)生報(bào)道酶或其它肽的檢驗(yàn)。這些檢驗(yàn)系統(tǒng)中的報(bào)道分子或標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、酶和化學(xué)發(fā)光劑。使用化學(xué)發(fā)光來(lái)監(jiān)控或檢測(cè)所關(guān)注行為的檢驗(yàn)系統(tǒng)包括測(cè)量生物發(fā)光酶——熒光素酶的活性的檢驗(yàn)。發(fā)光系統(tǒng)是已知的，并分離自許多發(fā)光有機(jī)體，其包括細(xì)菌、原生動(dòng)物、腔腸動(dòng)物、軟體動(dòng)物、魚(yú)類、倍足綱節(jié)動(dòng)物、蠅、真菌、蠕蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物和甲蟲(chóng)，特別是戶少ra;^orz^屬叩頭蟲(chóng)和P/7oWw^、和丄"do/"屬的螢火蟲(chóng)。其它表現(xiàn)出生物發(fā)光的有機(jī)體列于WO/2000/024878和1999/049019。另外參見(jiàn)Viviani,V.R.，(2002)Cell.Mol.LifeSd.59:1833-1850，其列舉了生物發(fā)光的陸生節(jié)肢動(dòng)物和昆蟲(chóng)的性質(zhì)。在許多這些有機(jī)體中，酶催化單加氧作用，使用產(chǎn)生的自由能，將分子激發(fā)至高能態(tài)。當(dāng)激發(fā)分子自發(fā)地返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出可見(jiàn)光。這種發(fā)射的光稱為"生物發(fā)光"。其在下文中也簡(jiǎn)稱作"發(fā)光"。自最早的研究以來(lái)，甲蟲(chóng)熒光素酶(特別是來(lái)自常見(jiàn)的北美螢火蟲(chóng)物種尸/w"m^;^ra/")己經(jīng)成為理解生物發(fā)光的范例。熒光素酶的基礎(chǔ)知識(shí)和應(yīng)用通常是基于源自P/zo"m^;^ra/^的單一酶，其稱作"螢火蟲(chóng)熒光素酶"。但是，全球有大約1800種發(fā)光甲蟲(chóng)。因此，尸/w"m^;^rafe的熒光素酶是大量各種各樣的甲蟲(chóng)熒光素酶的一個(gè)例子。已知所有的甲蟲(chóng)熒光素酶均催化同一底物——多雜環(huán)有機(jī)酸(除非另外指出，其在下文中稱作"熒光素")的反應(yīng)，該底物轉(zhuǎn)化成高能分子。有可能在每種情況下催化的反應(yīng)必然伴隨同樣的機(jī)制。甲蟲(chóng)熒光素酶，包括所謂的螢火蟲(chóng)熒光素酶，均為形成腺苷酸的酶總科的成員。甲蟲(chóng)熒光素酶催化的多步反應(yīng)與其它形成腺苷酸的酶催化的反應(yīng)具有一些相似性，上述其它形成腺苷酸的酶是例如酰基-CoA連接酶、各種其它的CoA連接酶(例如4-香豆酸-CoA連接酶)和肽合成酶。反應(yīng)第一步是腺嘌呤單磷酸酯(腺苷?；?與D-熒光素的羧碳加成，形成熒光素化-AMP(luciferyl-AMP)。ATP是AMP的來(lái)源，其它反應(yīng)產(chǎn)物是焦磷酸酯。因此，該反應(yīng)"依賴ATP"或"ATP依賴性"。推測(cè)焦磷酸酯的水解用于驅(qū)動(dòng)反應(yīng)前進(jìn)。熒光素-AMP是乙酸和磷酸的混合酸酐。由于腺苷酰基團(tuán)是良好的離去基團(tuán)，其是相對(duì)反應(yīng)性的。在類似的酶中，第一步也是羧酸酯在底物分子上的腺苷?；?，無(wú)論其為乙酸酯、長(zhǎng)鏈脂肪酸、4-香豆酸酯、還是氨基酸。在使用CoA的酶的情況下，通常會(huì)有CoA巰基對(duì)腺苷酸化羧酸的親核進(jìn)攻，導(dǎo)致CoA與底物接合。在甲蟲(chóng)熒光素酶的情況下，會(huì)有羰基處分子氧的進(jìn)攻，產(chǎn)生高能二氧雜環(huán)丁烷中間體，其隨后衰變，釋放出通常在波譜綠-黃部分(550-570nm)內(nèi)的光子加二氧化碳。熒光素酶具有使其特別可用作生物傳感(使用報(bào)道系統(tǒng)揭示生物系統(tǒng)的性質(zhì))的報(bào)道分子的特征。生物傳感器(包括生物組分的傳感器)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常包括兩步過(guò)程通過(guò)生物組分的信號(hào)產(chǎn)生、和通過(guò)電組分的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大。信號(hào)產(chǎn)生通常通過(guò)結(jié)合或催化來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些生物化學(xué)現(xiàn)象轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，通常是基于電化學(xué)或熱量檢測(cè)方法，其受到生物化學(xué)反應(yīng)的自由能變化的限制。對(duì)于大多數(shù)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，這小于兩分子ATP水解的能量，或大約70kJ/摩爾。但是，熒光素酶引起的發(fā)光載有高得多的能量含量。螢火蟲(chóng)熒光素酶催化的反應(yīng)發(fā)出的光子(560nm)具有214Kj/愛(ài)因斯坦。螢火蟲(chóng)熒光素酶以很高的效率和出色的信噪特性將化學(xué)能轉(zhuǎn)化成光。每分子D-熒光素的量子效率為0.88(Seliger和McElroy1960;Seliger和W.D1960)。因此這種酶是極為有效的化學(xué)能轉(zhuǎn)導(dǎo)物。但是，已知的依賴ATP的熒光素酶，如甲蟲(chóng)熒光素酶，在相對(duì)較窄的發(fā)射光譜范圍內(nèi)發(fā)光。己知的甲蟲(chóng)熒光素酶中無(wú)一在小于或等于530士5nm的波長(zhǎng)下以最大發(fā)射強(qiáng)度發(fā)光(Viviani2002;Nakatsu等人2006)。事實(shí)上，對(duì)已知熒光素酶的結(jié)構(gòu)修飾使發(fā)射光譜能量降低(即，降至較大波長(zhǎng)處的最大發(fā)射強(qiáng)度)，但不增加發(fā)射光譜的能量(即，至較短波長(zhǎng)處)。目前認(rèn)為結(jié)構(gòu)修飾如何改變發(fā)射光譜的進(jìn)一步信息可以參見(jiàn)Nakatsu等人(2006)。熒光素酶已經(jīng)從各種來(lái)源中直接分離出，其cDNA己有報(bào)道。參見(jiàn)，例如deWet等人，Molec.Cell.Biol7，725-737(1987);Masuda等人，Gene77,265-270(1989);Nakatsu等人(2006);禾nWood等人，Science244,700-702(1989)。在已有編碼熒光素酶的cDNA的情況下，通過(guò)從已經(jīng)轉(zhuǎn)化成表達(dá)cDNA的培養(yǎng)物或類似物中的細(xì)菌(例如大腸桿菌(￡.co//))、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離來(lái)制備大量的熒光素酶對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)完全是很簡(jiǎn)單的?；蛘撸谶m當(dāng)啟動(dòng)子和其它表達(dá)控制信號(hào)的控制下，cDNA可以在這樣的細(xì)胞中用于提供熒光素酶(從而最終催化生物發(fā)光)作為信號(hào)，以指示啟動(dòng)子的活性。而啟動(dòng)子的活性可以反過(guò)來(lái)反映出尋求監(jiān)控的另一因素，例如誘導(dǎo)或抑制啟動(dòng)子活性的物質(zhì)的濃度。近來(lái)出現(xiàn)的各種從編碼蛋白的核酸制造該蛋白的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，也可以用于制造熒光素酶。通過(guò)將這種cDNA的表達(dá)和隨后產(chǎn)生酶與遺傳行為偶聯(lián)，很容易獲得編碼熒光素酶的cDNA，使得有可能在用于對(duì)與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的這種遺傳行為進(jìn)行信號(hào)傳達(dá)、監(jiān)控或測(cè)量的檢驗(yàn)中使用熒光素酶作為報(bào)道基因。例如，螢火蟲(chóng)熒光素酶己經(jīng)廣泛用于檢測(cè)真核生物和原核生物中的啟動(dòng)子活性。發(fā)光反應(yīng)所需的底物，包括熒光素或其它底物、氧和ATP是可獲取的，或很容易在活細(xì)胞內(nèi)獲得。多報(bào)道基因檢驗(yàn)常常使用多、雙(或雙重)報(bào)道基因來(lái)提高實(shí)驗(yàn)精確度。術(shù)語(yǔ)"雙報(bào)道基因"是指在單一系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)并測(cè)量?jī)煞N單獨(dú)的報(bào)道酶。術(shù)語(yǔ)"多報(bào)道基因"是指在單一系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)并測(cè)量?jī)煞N或更多種單獨(dú)的報(bào)道酶。當(dāng)一起使用時(shí)，兩種或更多種單獨(dú)的報(bào)道酶可以稱作"共報(bào)道基因"。目前得益于多報(bào)道基因檢測(cè)的例子包括在遺傳上操縱以同時(shí)表達(dá)兩種不同報(bào)道基因的單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞群(例如分散在培養(yǎng)物中的細(xì)胞、分離的組織或整個(gè)動(dòng)物)。更常見(jiàn)地，一個(gè)基因的活性報(bào)道特定實(shí)驗(yàn)條件的影響，而第二個(gè)報(bào)道基因的活性提供內(nèi)部對(duì)照，從而可以對(duì)全套的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行歸一化。實(shí)驗(yàn)報(bào)道基因的活性相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的活性的歸一化，使得諸如細(xì)胞生活力或轉(zhuǎn)染效率差異造成的實(shí)驗(yàn)可變性得以最小化?？勺冃缘钠渌鼇?lái)源，例如移液體積的差異、細(xì)胞溶解效率和檢驗(yàn)效率，可以有效地消除。因此，通過(guò)減少外部影響，雙報(bào)道基因檢驗(yàn)常常使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋更為可靠。可以得益于雙酶報(bào)道基因技術(shù)的無(wú)細(xì)胞重構(gòu)系統(tǒng)，是從編碼實(shí)驗(yàn)和對(duì)照?qǐng)?bào)道酶的獨(dú)立遺傳材料的同時(shí)翻譯或偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。免疫檢驗(yàn)可以類似地指定用于在單一樣品內(nèi)雙重報(bào)道實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值。目前，編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶(luc)、海腎(Wem7/")熒光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、卩-半乳糖苷酶(lacZ)、卩-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)和各種磷酸酶例如分泌的堿性磷酸酶(SEAP)和子宮運(yùn)鐵蛋白(Uf;酸性磷酸酶)的基因已經(jīng)被組合，并用作遺傳活性的共報(bào)道基因。以下參考文獻(xiàn)提供了用于遺傳活性雙報(bào)道目的的以組合形式使用的這些各種報(bào)道基因的代表性例子luc禾nGUS:Leckie,F.,等人，1994;luc和CAT,luc和lacZ:Jain,V.K.和Magrath,I.T.，1992;CAT和lacZ:Flanagan,W.M.,等人，1991。另外參見(jiàn)PromegaDual-LuciferaseTM報(bào)道基因檢驗(yàn)系統(tǒng)、Dual-GloTM熒光素酶檢驗(yàn)系統(tǒng)，描述于其技術(shù)手冊(cè)中InstructionsforuseofProductsE2920,E2940,andE2980,revised1/06，PartNumberTM058;禾卩Wood,K.V"(1998)777eC/zem^^ryo/說(shuō)o/訓(xùn)/wescewZiepo他r^4^，，PromegaNotes65,第14頁(yè)；以及PromegapGL3熒光素酶報(bào)道基因載體(獲自PromegaCorporation,Madison,Wis.);以及美國(guó)專利第5,744,320號(hào)和第5,670,356號(hào)。任何多報(bào)道基因檢驗(yàn)的性能受到構(gòu)成的酶化學(xué)的特性和相容性、以及分別的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)能力的限制。完全不同的酶要求或檢驗(yàn)條件可以指示共報(bào)道基因不能用于集成的單一檢驗(yàn)混合物或單管格式。理想地，多報(bào)道基因系統(tǒng)將會(huì)包括至少兩個(gè)具有相容要求的酶檢驗(yàn)，例如化學(xué)、溫度、處理要求、速度、敏感性、檢測(cè)儀器等。在滿足多報(bào)道基因系統(tǒng)理想要求的嘗試中，在生物發(fā)光報(bào)道基因系統(tǒng)中可以一起使用不同熒光素酶的克隆，特別是單一屬或種的熒光素酶。但是，區(qū)分混合物中每種熒光素酶的能力受到其發(fā)射光譜寬度的限制。使用兩種或更多種不同熒光素酶作為報(bào)道基因的系統(tǒng)需要熒光素酶的發(fā)光顏色有可測(cè)量的差異。發(fā)光顏色差異的一個(gè)例子發(fā)生在尸少ra;/2on^//ag/o//zf/z"/a附w—加勒比本地產(chǎn)的一種大的叩頭蟲(chóng)。參見(jiàn)，例如，公開(kāi)于2003年9月4日的美國(guó)專利申請(qǐng)第20030166905號(hào)。該甲蟲(chóng)具有兩套發(fā)光器官，一對(duì)在前胸的背側(cè)表面上，一個(gè)單獨(dú)的器官在腹部的腹側(cè)全裂口中。己經(jīng)從腹部器官中分離出四種不同的熒光素酶克隆，并命名為L(zhǎng)ucPplGR、LucPplYG、LucPplYE和LucPplOR。這些酶催化的熒光素-熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生綠色至橙色的光。這四種熒光素酶催化的熒光素酶-熒光素反應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)顯示出發(fā)射綠光(峰強(qiáng)度546納米)、黃綠光(峰強(qiáng)度560納米)、黃光(峰強(qiáng)度578納米)和橙光(峰強(qiáng)度593納米)的4個(gè)幾乎等距的重疊的峰。如本文所用，例如，峰強(qiáng)度546納米，是指熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光光譜的最大發(fā)射發(fā)生在546納米處或附近。該上下文的術(shù)語(yǔ)"附近"是指峰或最大強(qiáng)度發(fā)生處波長(zhǎng)(也稱為X-max)的波長(zhǎng)測(cè)量中的正常精度限制。正常精度限制為，例如，正負(fù)5納米(即±5nm)不幸的是，盡管這些熒光素酶發(fā)出的光的峰強(qiáng)度的波長(zhǎng)范圍超過(guò)大約50nm，即使在546nm和593nm處的峰之間也存在相當(dāng)大的光譜重疊。因此增加所采用的發(fā)光反應(yīng)之間峰強(qiáng)度波長(zhǎng)的差異是極為合意的，以在使用兩種或更多種熒光素酶的系統(tǒng)中得到更高的測(cè)量精度。具體地，催化產(chǎn)生的最大強(qiáng)度等于或小于大約530nm的發(fā)光反應(yīng)的新的熒光素酶是極為合意的。等于或小于大約530urn的峰強(qiáng)度在波譜的藍(lán)光部分內(nèi)。在滿足這一需求的一種嘗試中，已經(jīng)在具有螢火蟲(chóng)熒光素酶的雙報(bào)道基因系統(tǒng)中開(kāi)發(fā)出海腎(seapansy)Wew7/arew/onmi的發(fā)射藍(lán)光的發(fā)光系統(tǒng)。海腎(iem7/"m^w7^和密切相關(guān)的種)的發(fā)光在藍(lán)光光譜內(nèi)，這在一些應(yīng)用中提供了相對(duì)于黃綠發(fā)光的優(yōu)勢(shì)。海腎光反應(yīng)的化學(xué)與甲蟲(chóng)的不相關(guān)，反應(yīng)中間體通過(guò)不同于甲蟲(chóng)熒光素酶的途徑產(chǎn)生。具體地，海腎熒光素酶催化腔腸素(coelenterazine)到腔腸素酰胺(coelenteramide)的氧化，在480nm處發(fā)出藍(lán)光。可能涉及二氧雜環(huán)丁垸中間體，但不發(fā)生腺苷酰化。海腎熒光素酶在進(jìn)化上與甲蟲(chóng)熒光素酶或形成腺苷酸的酶不相關(guān)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5,292,658號(hào)和第5,418,155號(hào)。海腎熒光素酶的優(yōu)勢(shì)和局限海腎熒光素酶/腔腸素系統(tǒng)作為基因表達(dá)報(bào)道基因的主要優(yōu)勢(shì)在于，其使用不同于甲蟲(chóng)熒光素的底物在藍(lán)光光譜內(nèi)發(fā)光。因此，海腎熒光素酶可以與甲蟲(chóng)熒光素酶/熒光素一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利第5,744,320號(hào)。然而，在其它方面，海腎熒光素酶則劣于甲蟲(chóng)熒光素酶，因?yàn)榍荒c素底物表現(xiàn)出低水平的非酶促發(fā)光。該水平的自發(fā)光根據(jù)環(huán)境的疏水性變化，這兩個(gè)現(xiàn)象一起嚴(yán)重限制了檢驗(yàn)的絕對(duì)靈敏度。甲蟲(chóng)熒光素酶不會(huì)受困于這一缺陷，推測(cè)是因?yàn)榭裳趸牡孜?熒光素化-AMP)從不會(huì)發(fā)現(xiàn)游離在溶液中，而是如上文所述，隨著酶上發(fā)生的氧化而合成，同時(shí)被熒光素酶緊密結(jié)合，隨后非常短齡。海腎熒光素酶的其它缺點(diǎn)在于，其不能直接用于有關(guān)ATP定量的應(yīng)用，因?yàn)榉磻?yīng)不使用ATP。另外，海腎熒光素酶在活性或未淬滅的甲蟲(chóng)熒光素酶的存在下不能經(jīng)受連續(xù)雙標(biāo)記檢驗(yàn)。0/e/^/"/tom'是一種發(fā)現(xiàn)于北美的生物發(fā)光蠅(雙翅目)(Fulton,1941)。其通常的生物性質(zhì)與下一部分描述的菌蚋屬澳大拉西亞蠅非常相似。根據(jù)Viviani，Hasting等人(Viviani,Hastings等人2002)，發(fā)出入max-460nm的藍(lán)光，波長(zhǎng)比來(lái)自其它昆蟲(chóng)的光要短。有趣的是，發(fā)光不依賴于ATP，該特性區(qū)別于所有其它昆蟲(chóng)的發(fā)光，其由一些溫和的還原劑刺激。Viviani，Hastings等人已經(jīng)在生物化學(xué)上部分表征了0/e/z'a的熒光素酶(Viviani,Hastings等人.2002)。菌蚋遍及東澳大利亞在受保護(hù)的棲息地存在有發(fā)射藍(lán)光的螢火蟲(chóng)，這是澳大利亞土著數(shù)萬(wàn)年來(lái)已知的。密切相關(guān)的物種以壯觀的濃度出現(xiàn)在新西蘭。螢火蟲(chóng)使用其藍(lán)色發(fā)光引誘獵物進(jìn)入粘性網(wǎng)中，其是keroplatid蠅的幼蟲(chóng)。但是，最初的歐洲的描述將其誤認(rèn)為與歐洲的螢火蟲(chóng)雌大螢火蟲(chóng)a"m^^y"o"http://wca，鞘翅目，熒科昆蟲(chóng))相關(guān)的甲蟲(chóng)的幼蟲(chóng)。目前認(rèn)識(shí)的澳大拉西亞螢火蟲(chóng)(雙翅目菌蚊科(Ker叩latidae):菌蚋亞科(Arachnocampinae))的物種(Baker2004;Harrison1966;Pugsley1983)部分列于表1。組屬(亞屬)種(權(quán)威)菌蟲(chóng)內(nèi)(Cam/ara)〃'c/zaniyae(Harrison)菌蟲(chóng)內(nèi)(菌蟲(chóng)內(nèi))tosm"w'em7i(Ferguson)菌蚋(C簡(jiǎn)/ara)gzVrawewe肌,s(Baker)菌蟲(chóng)內(nèi)(Cm/ara)g7J53/w/o"(ie"w^(Baker)菌蟲(chóng)內(nèi)(C"m/ara)oAvayem^(Baker)菌蟲(chóng)內(nèi)(Gaw7/ara)ra//cws(Baker)菌蟲(chóng)內(nèi)(菌蟲(chóng)內(nèi))^fa/oera^(Baker)菌蟲(chóng)內(nèi)(Campara)/7ova(Harrison)菌蟲(chóng)內(nèi)(菌蟲(chóng)內(nèi))/ww力cw)！(Skuse)根據(jù)(Shimomura,Johnson等人，1966)，菌蚋發(fā)射光譜的最大值為487±5nm，這非常符合AWc/wr血"e呈現(xiàn)的校正發(fā)射光譜(Lee1976)。Viviani,Hastings等人(2002)提出Ay/ava的發(fā)射最大值為484nm。Lee(1976)也表明菌蚋熒光素酶的發(fā)光受ATP激發(fā)，并要求Mg++。短波長(zhǎng)的發(fā)射表明菌蚋熒光素酶底物不同于甲蟲(chóng)熒光素(Wood1983)，事實(shí)上，尚未證實(shí)甲蟲(chóng)D-熒光素刺激菌蚋熒光素酶(Lee1976;Wood1983;Viviani，Hastings等人，2002)。Wood(1983)表明，耗盡的菌蚋光器官的冷提取物的發(fā)光可以通過(guò)加入熱處理過(guò)的提取物而再生。Viviani,Hastings等人(Viviani,Hastings等人2002)能夠使用酸性乙酸乙酯提取一些菌蚋熒光素，并使用TLC進(jìn)行部分分離。關(guān)于天然菌蚋熒光素尚不能得到結(jié)構(gòu)信息。根據(jù)Viviani,Hastings等人(2002)，菌蚋熒光素酶的分子量通過(guò)凝膠過(guò)濾推測(cè)為36kDa，即大約是螢火蟲(chóng)熒光素酶分子量(其為62kDa)的一半(Conti，F(xiàn)ranks等人1996)。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明提供一種分離的肽，其包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的肽，其包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列的變體的氨基酸序列，其中該變體由以下核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的肽，其包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8禾卩SEQIDNO:10的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中該直向同源物由以下核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。再另一方面，本發(fā)明提供一種分離的肽，其包括的氨基酸序列包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的片段。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的肽，其具有的氨基酸序列與選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列共享至少70%、80%或90%的同一性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的肽的分子量大于36千道爾頓(kD)。這些肽可以稱為"本發(fā)明的肽"。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽的酶活性部分，其造成發(fā)光反應(yīng)的催化，該發(fā)光反應(yīng)的光譜在小于或等于530±5nm的波長(zhǎng)處表現(xiàn)最大發(fā)射。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)光反應(yīng)依賴于ATPo如本文所示，±5nm反映出這種波長(zhǎng)可以明確的典型精度。具體地，優(yōu)選實(shí)施方式發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于520±5nm、510士5nm、500±5nm或490±5nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。表現(xiàn)出這些熒光素酶活性的這些肽可以稱為本發(fā)明的"活性熒光素酶"或"表現(xiàn)熒光素酶活性的本發(fā)明的肽"、"功能性熒光素酶"或"GW熒光素酶"。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種表現(xiàn)熒光素酶活性的分離的肽，其中熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530±5nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。在一個(gè)實(shí)施方式中，肽包括與選自SEQIDN0:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的序列的氨基酸200-350的序列同一性為至少70%的連續(xù)氨基酸序列。在另一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種表現(xiàn)熒光素酶活性的分離的肽，其中熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜，并且其中分離的肽具有如下氨基酸序列，當(dāng)與尸/z^z'm^熒光素酶(例如SEQIDNO:4)比對(duì)時(shí)，與SEQIDNO:4的差異在于選自R218缺失、H245N、G315S、L342S和T343S的至少一處氨基酸序列變化。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，這樣的肽具有如下氨基酸序列，當(dāng)與SEQIDNO:4比對(duì)時(shí)，與SEQIDNO:4的差異在于選自A22Y、Y53A、L63T、E83D、F88Y、F89Y、P91I、A103C、Y109W、E113D、V訓(xùn)、G160P、S198T、H212Q，R218缺失、D224S、P225缺失、G228D、P233K、P242Q、F243Y、H245N、L253M、Y255R、F273Y、Y280F、S298K、L300E、E311R、G315S、P318T、L319V、G339F、L342S、T343S、D375H、K380A、E389F、T408S、W417Y、L418V、D427N、L441I、1442V、K443M、Y444V、K445D、Q448A、A452T、L458I、V485L、V486T、G490R、V506L、R513K、V516C、T527A、和從K549開(kāi)始且包括其至羧端的所有殘基缺失的至少一處氨基酸序列變化。本發(fā)明的肽包括基于SEQIDNO:4序列但包括一處或多處如上文列出或在表5中列出的氨基酸序列變化的肽，其在下文詳細(xì)說(shuō)明。在其它的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的表現(xiàn)熒光素酶活性的分離的肽具有的氨基酸序列與選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列共享至少70%的同一性。在具體的實(shí)施方式中，活性熒光素酶肽包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種活性熒光素酶肽，其包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列的變體的氨基酸序列，其中該變體由以下核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。另一方面，本發(fā)明提供一種活性熒光素酶肽，其包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8禾卩SEQIDNO:10的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中該直向同源物由以下核酸分子編碼，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。再另一方面，本發(fā)明提供一種活性熒光素酶肽，其包括的氨基酸序列包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的片段。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括活性熒光素酶肽，其具有的氨基酸序列與選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO;8和SEQIDNO:10的氨基酸序列共享至少70%、80%或90%的同一性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的表現(xiàn)熒光素酶活性的活性肽的分子量大于36千道爾頓。本發(fā)明的另一方面包括選擇性地結(jié)合本發(fā)明的肽的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這樣的抗體可以用于檢測(cè)選自如下的本發(fā)明的肽的存在(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；(b)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的變體的氨基酸序列，其中該變體由在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1所示的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交的核酸分子編碼；(c)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中該直向同源物由在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1所示的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交的核酸分子編碼；和(d)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的片段，其中該片段包括至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種分離的核酸分子，其包括的核苷酸序列編碼選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列。本發(fā)明同樣包括一種核苷酸序列，其編碼選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列的變體，其中該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。而且，本發(fā)明包括一種核苷酸序列，其編碼選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8禾HSEQIDNO:10的氨基酸序列的直向同源物，其中該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交。再進(jìn)一步，本發(fā)明包括一種核苷酸序列，其編碼選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列的至少IO個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，還包括該核苷酸序列的互補(bǔ)體的核苷酸序列。本發(fā)明包括的所述的核酸分子可以稱為"本發(fā)明的核酸分子"。本發(fā)明包括其為本發(fā)明的核酸分子的互補(bǔ)體的核苷酸序列。在其它各個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步包括在基因芯片、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、核酸載體或宿主細(xì)胞內(nèi)包括的本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明的方法包括檢測(cè)樣品中本發(fā)明的核酸分子的存在的方法。因此，在具體的實(shí)施方式中，該方法包括使樣品與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸與本發(fā)明的核酸分子在嚴(yán)格條件下雜交，以及檢測(cè)寡核苷酸是否與樣品中的核酸分子結(jié)合。本發(fā)明的其它方法包括，例如，監(jiān)控所關(guān)注基因或其一部分在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括(a)向宿主細(xì)胞內(nèi)引入載體構(gòu)建物，該載體構(gòu)建物包括本發(fā)明的核酸分子，并進(jìn)一步包括編碼目的核苷酸序列或產(chǎn)物的核酸分子；其中本發(fā)明的核酸分子和目的序列或產(chǎn)物共表達(dá)；和(b)檢測(cè)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)的存在，從而監(jiān)控目的序列或產(chǎn)物的表達(dá)。在本發(fā)明的具體方法中，本發(fā)明的核酸分子編碼表現(xiàn)熒光素酶活性的肽。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，檢測(cè)本發(fā)明的核酸分子表達(dá)的存在包括熒光素酶活性檢驗(yàn)。在特別優(yōu)選的方法中，熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530±5nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括與啟動(dòng)子操作(operative)連接的本發(fā)明的核苷酸序列。在具體的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子在選自植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞中有功能。在再一個(gè)實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包括編碼所關(guān)注的其它序列或產(chǎn)物的核苷酸序列。所關(guān)注的其它序列或產(chǎn)物可以是核酸、蛋白質(zhì)、活性熒光素酶或其酶活性部分。當(dāng)然，在其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何合適的細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法包括用目的核酸或其部分轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法，該方法包括(a)向宿主細(xì)胞中引入載體構(gòu)建物，該載體構(gòu)建物包括編碼表現(xiàn)熒光素酶活性的肽的本發(fā)明的核酸分子，其中表現(xiàn)熒光素酶活性的肽被表達(dá)；和(b)檢測(cè)熒光素酶活性，從而確認(rèn)宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括監(jiān)控宿主細(xì)胞中控制器元件(controllerelement)的活性的方法，該方法包括(a)向宿主細(xì)胞中引入載體構(gòu)建物，該載體構(gòu)建物包括本發(fā)明的核酸分子，其與控制器元件操作連接；和(b)檢測(cè)熒光素酶的存在，從而監(jiān)測(cè)控制器元件的活性。該實(shí)施方式中的控制器元件可以是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。本發(fā)明的核酸分子可以編碼表現(xiàn)熒光素酶活性的肽。在肽表現(xiàn)熒光素酶活性的這樣的實(shí)施方式中，檢測(cè)熒光素酶的存在可以是熒光素酶活性的檢驗(yàn)。本發(fā)明的其它方法包括將化合物鑒別為功能性熒光素酶的推定底物的方法，該方法包括(a)使本發(fā)明的核酸分子編碼的功能性熒光素酶在適合于功能性熒光素酶活性的條件下與至少一種候選化合物接觸；和(b)檢驗(yàn)熒光素酶活性，其中熒光素酶活性的檢測(cè)表明至少一種候選化合物是功能性熒光素酶的推定底物。通過(guò)本發(fā)明的方法的操作鑒別的新的化合物明顯包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的特別優(yōu)選的方法包括在等分試樣中測(cè)量至少兩種報(bào)道酶的活性的方法，該方法包括通過(guò)測(cè)量發(fā)光反應(yīng)被第一報(bào)道酶催化產(chǎn)生的光信號(hào)來(lái)檢驗(yàn)第一報(bào)道酶的活性，以及通過(guò)測(cè)量發(fā)光反應(yīng)被至少第二報(bào)道酶催化產(chǎn)生的光信號(hào)來(lái)檢驗(yàn)至少第二報(bào)道酶的活性。該方法包括那些檢驗(yàn)在相同等分樣品中進(jìn)行的方法。在這些實(shí)施方式中，檢驗(yàn)可以以任意順序、分組、或所要的時(shí)間順序或常規(guī)進(jìn)行。在具體的實(shí)施方式中，多種檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。在另外的具體實(shí)施方式中，至少一種檢驗(yàn)在至少第二檢驗(yàn)之前進(jìn)行，或者至少一種檢驗(yàn)在所有其它檢驗(yàn)之后進(jìn)行，或者檢驗(yàn)依次進(jìn)行。在具體的實(shí)施方式中，第一報(bào)道酶包括本發(fā)明的活性熒光素酶。當(dāng)然，在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，報(bào)道酶中的至少一種是表現(xiàn)熒光素酶活性的肽，其中熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530±5nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，至少兩種報(bào)道酶是依賴ATP的熒光素酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一報(bào)道酶是菌蚋熒光素酶，第二報(bào)道酶是不同的熒光素酶。"不同的熒光素酶"是指任何其它熒光素酶，無(wú)論依賴或不依賴ATP。特別優(yōu)選的不同的熒光素酶包括螢火蟲(chóng)、扣頭蟲(chóng)或鐵路蟲(chóng)(railroadworm)的熒光素酶。其它優(yōu)選的熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在大于530nrn的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明將是顯而易見(jiàn)的。但應(yīng)當(dāng)理解到，盡管本發(fā)明說(shuō)明了具體的實(shí)施方式，詳細(xì)說(shuō)明和具體實(shí)施例僅僅作為示例給出，因?yàn)楦鶕?jù)該具體說(shuō)明，各種本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。以下附圖形成本說(shuō)明書(shū)的一部分，其被包括以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)并結(jié)合本文給出的本發(fā)明的具體說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明。圖1A.」rac/2"oc"w;ar/c/wrafeae熒光素酶的共有核苷酸序列(SEQIDNO:1)。圖IB.^rac/z"oca附;an'c/zara^e熒光素酶的共有核苷酸序列(SEQIDNO:1)，續(xù)自圖1A。圖2A.^rac/zwcwn;^n'c/zarafeae熒光素酶的核酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。圖2B.^rac/mocam;an'c/zarafeae熒光素酶的核酸序列和X寸應(yīng)的氨基酸序列，續(xù)自圖2A。圖3.^rac/2"oca附/a〃'c/^rafeae熒光素酶的共有氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖4.本發(fā)明的熒光素酶的核酸序列(SEQIDNO:3)。圖5A.本發(fā)明的熒光素酶肽的核酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。圖5B.本發(fā)明的熒光素酶肽的核酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，續(xù)自圖5A。圖5C.本發(fā)明的熒光素酶肽的核酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，續(xù)自圖5B。圖6A.來(lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列與^rac/zwoc謹(jǐn)，n'c/20T(isae熒光素酶的比對(duì)。圖6B.來(lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列與Jrac/zwocampan'c/wrt/rae熒光素酶的比對(duì)，續(xù)自圖6A。圖6C.來(lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列與Jrac/wocampan'c/zarafeae熒光素酶的比對(duì)，續(xù)自圖6B。圖6D.來(lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列與j認(rèn)/w0c應(yīng)/7ar/c/zani総熒光素酶的比X寸，續(xù)自圖6C。圖6E.來(lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列與^rac/2"ocampan'c/zarafeae熒光素酶的比對(duì)，續(xù)自圖6D。圖7.菌蚋熒光素酶在酰基-CoA連接酶超家族的其它熒光素酶的分子種系學(xué)中的位置。圖8.本發(fā)明的肽從GWLuc糾的表達(dá)。條帶編號(hào)自左向右。第一個(gè)條帶顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)，以千道爾頓(kD)標(biāo)記。其它條帶顯示用pETDuet-l:FFLuc(條帶3-5)和pETDuet-l:GWLuc糾(條帶6-8)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。條帶4和7顯示在沒(méi)有IPTG的情況下孵育48小時(shí)的培養(yǎng)物樣品。條帶3和6顯示培養(yǎng)物的預(yù)感應(yīng)樣品。條帶5禾口8顯示在0.4mMIPTG的存在下孵育48小時(shí)并表達(dá)相關(guān)構(gòu)建物的培養(yǎng)物樣品。圖9.來(lái)自螢火蟲(chóng)尸/w"rn^的熒光素酶的天然氨基酸序列(FF熒光素酶；SEQIDNO:4)。圖10.編碼Ay/"v"熒光素酶的核酸序列(SEQIDNO:5)。圖11.Ay/"ra熒光素酶的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖12.編碼Agz)rmve^7e"^熒光素酶的核酸序列(SEQIDNO:7)。圖13.Ag/rrawee"e"^熒光素酶的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。圖14.編碼Atoswam'e"^y熒光素酶的核酸序列(SEQIDNO:9)。圖15.Atow^m'e"^熒光素酶的氨基酸序列(SEQIDNO:10)。圖16.生物發(fā)光被本發(fā)明的熒光素酶提高。圖17.生物發(fā)光通過(guò)增加本發(fā)明的熒光素酶的量而定量響應(yīng)。圖18.校正曲線。圖19.加熱變性消除生物發(fā)光活性。圖20.生物發(fā)光依賴于熒光素和ATP。圖21.生物發(fā)光活性特異于本發(fā)明的肽。圖22.本發(fā)明的肽不使用腔腸素(coelentarazine)作為底物。圖23.本發(fā)明的肽產(chǎn)生的最大生物發(fā)光發(fā)生在小于530±5nm波長(zhǎng)處。圖24.本發(fā)明的生物發(fā)光活性在酵母中的表達(dá)。圖25A.四種菌蚋熒光素酶肽的多序列比對(duì)。圖25B.圖25A的比對(duì)之續(xù)。具體實(shí)施方式以下的具體實(shí)施方式和實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明是作為范例提供，而不加以限制。除非有相反指示或另外指出，在這些說(shuō)明中以及本說(shuō)明書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"和"一種"是指一或更多個(gè)(種)。類似地，術(shù)語(yǔ)"或"是指"和/或"。"包括"是指包括但不限于，不論單詞"包括"后是何物。因此，使用術(shù)語(yǔ)"包括"表明列出的元素是需要的或強(qiáng)制的，但其它元素是任選的，可以存在或不存在。"由……組成"是指包括并限于，不論短語(yǔ)"由……組成"中是何物。因此，短語(yǔ)"由……組成"表明列出的元素是需要的或強(qiáng)制的，并且不可以存在其它的元素。"基本由……組成"是指包括該短語(yǔ)中列出的任何元素，并限于其它不干擾或有助于本公開(kāi)中所列元素的活性或作用的元素。因此，短語(yǔ)"基本由……組成"表明列出的元素是需要的或強(qiáng)制的，但其它元素是任選的，取決于其是否影響所列元素的活性或作用而可以存在或不存在。在提供數(shù)值范圍的情況下，應(yīng)當(dāng)理解成，每一個(gè)該范圍上限和下限之間的中間數(shù)值，除非上下文明顯另外指出，直至下限的十分之一單位，以及任何其它所述的或所述范圍內(nèi)的中間數(shù)值，均包括在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在較小范圍中，也包括在本發(fā)明之內(nèi)，進(jìn)行所述范圍中的任何具體排除限定。肽分子本發(fā)明提供編碼肽分子的核苷酸序列，該肽分子已經(jīng)被鑒別為蛋白質(zhì)的熒光素酶家族的成員。提供的肽序列，以及本文所述的明顯變體，特別是本文鑒別并使用本文提供的信息的同屬變體，將被稱為本發(fā)明的酶、酶肽、肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明一方面提供分離的肽和蛋白質(zhì)分子，其由圖2、3、5、11、13、15或SEQIDNO:2、6、8和10中公開(kāi)的酶肽的氨基酸序列組成或基本由上述序列組成或包括上述序列，或者由圖1、2、4、5、10、12、14或SEQIDNO:1、3、11、13和15所示的核酸分子編碼，以及這些的所有本領(lǐng)域制造和應(yīng)用的明顯變體。這些變體中的一些在下文中詳細(xì)描述。如本文所用，當(dāng)肽基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或不含化學(xué)前體或其它化合物時(shí)，稱肽是"分離"或"提純"的。本發(fā)明的肽可以提純至同質(zhì)或其它純度。提純的水平將基于既定的應(yīng)用。(分離的核酸分子的特征下文討論)。在一些應(yīng)用中，"基本不含細(xì)胞物質(zhì)"包括具有少于大約30%(干重)的其它蛋白質(zhì)(即污染蛋白質(zhì))、少于大約20%的其它蛋白質(zhì)、少于大約10%的其它蛋白質(zhì)、或少于大約5%的其它蛋白質(zhì)的肽的制劑。當(dāng)肽重組產(chǎn)生時(shí)，其也可以基本不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制劑體積的小于大約20%。文字"基本不含化學(xué)前體或其它化合物"包括肽的制劑，其中它從涉及其合成的化學(xué)前體或其它化合物中分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，文字"基本不含化學(xué)前體或其它化合物"包括具有少于大約30%(干重)的化學(xué)前體或其它化合物、少于大約20%的化學(xué)前體或其它化合物、少于大約10%的化學(xué)前體或其它化合物、或少于大約5%的化學(xué)前體或其它化合物的酶肽的制劑。分離的酶肽可以從天然表達(dá)其的細(xì)胞提純，從已經(jīng)改變成表達(dá)其(重組體)的細(xì)胞提純，或使用已知的蛋白質(zhì)合成法合成。例如，將編碼酶肽的核酸分子克隆到表達(dá)載體中，將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。然后可以通過(guò)合適的提純方案使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)提純技術(shù)從細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)。許多這些技術(shù)在下文中詳細(xì)說(shuō)明。一方面，本發(fā)明提供由所提供的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。當(dāng)氨基酸序列是蛋白質(zhì)的最終氨基酸序列時(shí)，蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成。在其它方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供基本由所提供的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)基本由氨基酸序列組成，是指這樣的氨基酸序列僅與幾個(gè)額外地氨基酸殘基存在，例如，在最終的蛋白質(zhì)中大約1至大約100個(gè)額外的殘基，通常為1至大約20個(gè)額外的殘基。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括所提供的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)包括氨基酸序列，是指氨基酸序列是最終蛋白質(zhì)氨基酸序列的至少一部分。在這種方式中，蛋白質(zhì)可以僅是肽，或者具有額外的氨基酸分子，例如與其天然聯(lián)合的氨基酸殘基(連續(xù)編碼的序列)，或異源氨基酸序列或肽序列。這樣的蛋白質(zhì)可以具有幾個(gè)額外的氨基酸殘基，或者可以包括數(shù)百個(gè)或更多的額外的氨基酸。下文提供了如何制造或分離各種類型的這些蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)要說(shuō)明。本發(fā)明的酶肽可以與異源序列連接，以形成嵌合或融合蛋白質(zhì)。這種嵌合和融合蛋白質(zhì)可以包括與異源蛋白質(zhì)操作連接的酶肽，該異源蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列與酶肽基本不同源。"操作連接"是指酶肽和異源蛋白質(zhì)的融合使得各自的操作性均不被破壞。異源蛋白質(zhì)可以融合到酶肽的N-端或C-端。在一些應(yīng)用中，融合蛋白不會(huì)影響酶肽本身的活性。例如，融合蛋白可以包括但不限于，酶促融合蛋白，例如(3-半乳糖苷酶融合、酵母雙雜化GAL融合、聚-His融合、MYC-標(biāo)記、HI-標(biāo)記和Ig融合。這些融合蛋白，特別是聚-His融合可以促進(jìn)重組酶肽的提純。在某些宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中，蛋白質(zhì)的表達(dá)或分泌可以通過(guò)使用異源信號(hào)序列得到提高。在一些應(yīng)用中，融合蛋白可以是蛋白質(zhì)互補(bǔ)檢驗(yàn)或PCA的組分，其中活性酶分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，每一個(gè)與相互作用子(interactor)結(jié)構(gòu)域融合或連接，其通過(guò)吸引與第三分子連接在一起，使得原始酶的活性得以恢復(fù)。例如，參見(jiàn)，美國(guó)專利第6,270,964號(hào)和第6,342,345號(hào)。嵌合或融合蛋白可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)將編碼不同蛋白質(zhì)序列的DNA片段在框內(nèi)連接在一起。在另一實(shí)施方式中，融合基因可以通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)，包括自動(dòng)DNA合成儀來(lái)合成。或者，PCR擴(kuò)增或基因片段的連接可以使用錨定引物進(jìn)行，該錨定引物產(chǎn)生出兩個(gè)相鄰基因片段之間的互補(bǔ)突出端，其隨后可以復(fù)性并再擴(kuò)增，以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,1998)。而且，許多表達(dá)載體是市售的，其已經(jīng)編碼融合部分(例如GST蛋白質(zhì))。編碼酶肽的核酸可以克隆到這樣的表達(dá)載體中，使得融合部分在框內(nèi)與酶肽連接，這是在不破壞各組分操作性的情況下制造融合蛋白的一種方式。如上文提及，本發(fā)明還提供并激活本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的明顯變體，例如肽的天然成熟形式、肽的等位或序列變體、肽的非天然重組衍生的變體、以及肽的直向同源物和種內(nèi)同源基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的可以自菌蚋屬(雙翅目)分離的本發(fā)明肽的直向同源物和類似物，是本發(fā)明的肽的優(yōu)選實(shí)施方式。這樣的變體可以很容易使用重組核酸技術(shù)和蛋白質(zhì)生物化學(xué)領(lǐng)域公知的技術(shù)產(chǎn)生。但應(yīng)當(dāng)理解，變體排除本發(fā)明之前公開(kāi)的任何完全氨基酸序列。使用分子技術(shù)和本文公開(kāi)的序列信息，可以很容易地鑒別或制造這樣的變體。而且，基于與本發(fā)明的酶肽的序列或結(jié)構(gòu)同源性，可以很容易地區(qū)分這樣的變體與其它的肽。存在的同一性程度將主要基于肽是功能變體還是非功能變體、種內(nèi)同源基因家族中存在的趨異量、以及直向同源物之間的進(jìn)化距離。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列的百分比同一性，鑒于最優(yōu)比較目的，將序列比對(duì)(例如，對(duì)于最優(yōu)比對(duì)，可以在第一和第二氨基酸或核苷酸序列的一個(gè)或二者中引入缺口，對(duì)于比較目的，可以忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將參比序列長(zhǎng)度的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或更多進(jìn)行比對(duì)，用于比較目的。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置處是同一的(如本文所用，氨基酸或核酸"同一性"等同于氨基酸或核酸"同源性")。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是序列共享的同一位置的數(shù)目的函數(shù)，并考慮到缺口的數(shù)目和每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，這需要引入以便用于兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)。變體與圖2、3或5或SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列的序列同一性優(yōu)選為至少60%，更優(yōu)選與圖2、3或5或SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列的序列同一性為至少70%、S0%、90%、95%、98%或99%?；蛘撸缟衔奶峒?，序列同一性可以針對(duì)肽的特定區(qū)域計(jì)算，例如熒光素結(jié)合袋(bindingpocket)。SEQIDNO:2中所列的菌蚋熒光素酶的氨基酸序列與甲蟲(chóng)熒光素酶的代表性成員尸/2o""^p,"fc的序列比較表明，熒光素結(jié)合袋區(qū)域(位于SEQIDNO:2的大約氨基酸201至350)的序列同一性為大約28%，而C-端區(qū)域(SEQIDNO:2的氨基酸351至530)的序列同一性為大約41%(表6)。N-端氨基酸1至100上的序列同一性為大約29%。因此，本發(fā)明的肽優(yōu)選包括與SEQIDNO:2的氨基酸201至350的序列同一性至少為50%的連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選與SEQIDNO:2的氨基酸201至350的序列同一性至少為60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的連續(xù)氨基酸序列?；蛘?，或額外地，本發(fā)明的肽優(yōu)選包括與SEQIDNO:2的氨基酸351至530的序列同一性至少為50%的連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選與SEQIDNO:2的氨基酸351至530的序列同一性至少為60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的連續(xù)氨基酸序列。本發(fā)明的肽還可以包括與SEQIDNO:2的氨基酸1至201的序列同一性至少為50%的連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選與SEQIDNO:2的氨基酸201至350的序列同一性至少為60%、70°/。、80%、90%、95%、98%或99%的連續(xù)氨基酸序列。對(duì)來(lái)自18種發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶氨基酸序列的比較確認(rèn)了完全保守的128個(gè)殘基。當(dāng)比較菌蚋物種的對(duì)應(yīng)殘基時(shí)，這些殘基中的55個(gè)是不同的(加3處缺失)。在」.n'c/7wA^中不同的55個(gè)殘基列于表5中。優(yōu)選的肽包括的氨基酸序列包括對(duì)應(yīng)于表5中所列的55個(gè)氨基酸殘基，即Y26、A54、T64、D84、Y89、Y卯、192、C104、WllO、D114、1140、P161、T197、Q211、S219、D221、K226、Q235、Y236、N238、M246、R248、Y266、F273、K291、E293、R304、S308、T311、V312、F332、S335、S336、H367、A372、F381、S400、Y409、V410、N419、1433、V434、M435、V436、D437、A440、T444、1450、L477、T478、R481、L497、K504、C507、A518。其它優(yōu)選的肽包括的氨基酸序列包括對(duì)應(yīng)于表5中所列的氨基酸序列，其位于熒光素結(jié)合袋中在大約氨基酸201至350處，即Q211、S219、D221、K226、Q235、Y236、N238、M246、R248、Y266、F273、K291、E293、R304、S308、T311、V312、F332、S335、S336。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分比同一性和相似性的確定可以使用數(shù)學(xué)算法進(jìn)行。(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.，ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W"ed.,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Part1，Griffin,A.M,，禾口Griffin,H.G，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987;禾口SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.禾卩Devereux，J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，多序列對(duì)比和種系樹(shù)使用PROTML或PROTPARS程序得到PROTML(Adachi，J.和Hasegawa,M.1996:MolphyVersion2.3.用于基于最大概率的分子種族發(fā)育學(xué)的程序。ComputerSciencemonographsNo.28.東京統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)學(xué)院的出版物)；和PROTPARS(Felsenstein,J.1989.PHYLIP-PhylogenyInferencePackage(Version3.2).Cladistics5:164-166)。成對(duì)比對(duì)和序列同一性和同源性的水平使用GCG軟件包中的BestFit程序確定。兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch的算法確定(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))，其已經(jīng)結(jié)合到GCG軟件包中的GAP程序中。該算法的采用使用Blossom62矩陣(matrix)或PAM250矩陣，缺口重量(gapweight)為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度重量(lengthweight)為1、2、3、4、5或6。兩個(gè)核苷酸序列之間的百分比同一性使用GAP程序確定(Devereux，J.,等人，NucleicAcidsRes.12(1):387(1984))，使用NSWgapdna.CMP矩陣，缺口重量為40、50、60、70或80，長(zhǎng)度重量為1、2、3、4、5或6。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作"査詢序列(querysequence)",以針對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，例如，以鑒別其它家族成員或相關(guān)序列。這種檢索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(version2.0)進(jìn)行(J.Mol.Biol.215:403-10(1990))。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，記分=100，字長(zhǎng)=12，以得到與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以使用XBLAST程序進(jìn)行，記分=50，字長(zhǎng)=3，以得到與本發(fā)明的蛋白質(zhì)同源的氨基酸序列。為了得到缺口比對(duì)用于比較目的，可以使用如Altschul等人所述的缺口BLAST(NucleicAcidsRes.25(17):3389曙3402(1997))。當(dāng)使用BLAST和缺口BLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。包括本發(fā)明的肽之一的、全長(zhǎng)預(yù)加工形式以及成熟加工形式的蛋白質(zhì)，可以容易地鑒別為與本發(fā)明的酶肽之一具有完全的序列同一性，而且被編碼本文提供的酶肽的核酸分子編碼。酶肽的等位變體可以容易地鑒別為與本文公開(kāi)的酶肽的至少一部分具有高度序列同一性的菌蚋熒光素酶肽。如本文所用，當(dāng)氨基酸序列的同源性通常為至少大約70-80%、80-90%、最有利地至少大約90-95%或更高時(shí)，兩種蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)的區(qū)域)具有高度的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明，顯著同源的氨基酸序列將被在下文更充分描述的嚴(yán)格條件下與編碼菌蚋熒光素酶肽的核酸分子雜交的核苷酸序列編碼。酶肽的直向同源物可以容易地鑒別為與酶肽的至少一部分具有一定程度的顯著序列同一性，并且由來(lái)自另一有機(jī)體的基因編碼。優(yōu)選的直向同源物從分類為菌蚋屬(雙翅目)的成員的有機(jī)體分離。這樣的直向同源物將由在下文更充分描述的、溫和至嚴(yán)格條件下與本文所公開(kāi)的新型核酸分子雜交的核苷酸序列編碼，其取決于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的兩種有機(jī)體的相關(guān)程度。本發(fā)明的酶肽的非天然變體可以容易地使用重組技術(shù)產(chǎn)生。這樣的變體包括但不限于，酶肽的氨基酸序列中的缺失、增加和置換。例如，一類置換是保守氨基酸置換。這種置換是將酶肽中的特定氨基酸用另一性質(zhì)類似的氨基酸置換。通常認(rèn)為是保守置換的是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間的互相代替；羥基殘基Ser和Thr的互換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gin之間的置換；堿性殘基Lys和Arg的交換；以及芳香性殘基Phe和Tyr的置換。關(guān)于可能表型沉默的氨基酸變化的指導(dǎo)可參見(jiàn)Bowie等人，Science247:1306-1310(1990)。相比較于功能性肽，例如SEQIDNO:2的肽，變體酶肽可以在所有功能上都不改變，或者可以由一種或多種活性中的改變的功能組成，或者甚至缺乏一種或多種活性中的功能，例如與底物結(jié)合的能力、或發(fā)射光譜的位移。功能變體可以僅含有保守變化或在非關(guān)鍵殘基或非關(guān)鍵區(qū)域中的變化。圖6、表3和5和其中的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以用于識(shí)別關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域/區(qū)域。功能變體還可以含有不導(dǎo)致功能變化或變化不顯著的類似氨基酸的置換。在一個(gè)實(shí)施方式中，變體具有熒光素酶活性，該熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。優(yōu)選地，變體具有至少25%的SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性，更優(yōu)選至少40%、50%、60%、70°/。、80%、90%或95°/。的SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，變體具有至少SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性，或者活性更大?；蛘?，氨基酸置換可以在一定程度上改變功能。這樣的變體通常在關(guān)鍵殘基或關(guān)鍵區(qū)域中含有一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸的置換、缺失、插入、倒置或平截。類似地，圖6、表3和5和其中的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以用于識(shí)別關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域/區(qū)域中的這樣的改變。功能改變的變體還可以含有不導(dǎo)致功能變化或變化不顯著的類似氨基酸的置換。功能所必要的氨基酸也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法識(shí)別，例如位點(diǎn)定向誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham等人，Science244:1081-1085(1989))。后一種方法在分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變。然后在檢驗(yàn)中對(duì)產(chǎn)生的突變體分子進(jìn)行生物活性測(cè)試，例如酶活性或發(fā)射光譜位移。結(jié)合配偶體/底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)也可以通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定，例如結(jié)晶、核磁共振或光親和力標(biāo)記(Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992);deVos等人，Science255:306-312(1992))。/V7加'm^熒光素酶的晶體結(jié)構(gòu)是已知的(Conti等人Structure4:287-298(1996))，當(dāng)進(jìn)行功能關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別時(shí)可以參考。參見(jiàn)，例如，Nakatsu等人(2006)。書(shū)寫肽或酶肽序列，氨基酸位置從編號(hào)為"1"的起始甲硫氨酸開(kāi)始到羧端氨基酸進(jìn)行編號(hào)。具體位置處的具體氨基酸用氨基酸的單字母名稱表示，例如M是MET或甲硫氨酸，然后是相關(guān)氨基酸的位置編號(hào)，例如Ml是起始甲硫氨酸。從上下文中明顯看出，在本發(fā)明的肽氨基酸序列與其它例如P/w""m熒光素酶的一些比較中，對(duì)比較進(jìn)行描述的順序表示了所參考的引用位置的相關(guān)氨基酸序列。因此，v4rac/7"oc<3m/aWc/wrafeae熒光素酶中與尸/2o"m^p_yrafc熒光素酶不同的殘基可以表示成，例如，A343I351,這表示菌蚋序列中343位置處的丙氨酸對(duì)應(yīng)于P中351位置處的異亮氨酸。類似地，DEL213-214R218表示，如果存在精氨酸，戶/7_yrafc的218位置處的精氨酸缺失落入菌蚋序列的殘基213和214之間。參見(jiàn)，例如，圖6A-6E提供的比對(duì)。氨基酸序列或肽中的位置上的置換，由氨基酸單字母名稱、然后是相關(guān)非置換序列或肽的位置編號(hào)、然后是取代氨基酸的一個(gè)或多個(gè)單字母名稱來(lái)表示。因此，例如，天然戶/2^/m^;^rafe熒光素酶342位置處的亮氨酸置換成絲氨酸表示成L342S。類似的名稱從上下文和此處提供的進(jìn)一步細(xì)節(jié)是很清楚的。例如，L342S的另外的名稱可以表示成L342》S。類似地，其它熒光素酶序列中的相同變化可以參考任何一個(gè)這樣的序列表示成"在與SEQIDNO:4的1^11342排比的位置處將Leu置換成Ser"。本發(fā)明在包括這些片段和由其組成的蛋白質(zhì)和肽之外，還進(jìn)一步提供肽的片段，特別是包括圖2、3、5和SEQIDNO:2中確定的殘基的片段。但本發(fā)明涉及的片段并不理解成要包括于本發(fā)明之前公開(kāi)的片段。包括分子N-端的本發(fā)明的肽片段可以通過(guò)編碼區(qū)內(nèi)的翻譯停止位點(diǎn)的基因工程產(chǎn)生。或者，用稱作蛋白酶的蛋白水解酶處理多肽可以產(chǎn)生多種N-端、C-端和中間片段。在某些實(shí)施方式中，肽可以通過(guò)已知方法合成。片段的例子可以包括長(zhǎng)度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、卯、95、100、200、300、400、500或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)殘基。這些片段可以根據(jù)已知的方法提純，例如沉淀(例如硫酸銨)、HPLC、離子交換色譜、親和力色譜(包括免疫親和力色譜)或各種范圍的分離(沉降、凝膠電泳、凝膠過(guò)濾)。這些片段可以基于保持一種或多種酶肽生物活性的能力選擇，或者可以選擇發(fā)揮功能的能力，例如與底物結(jié)合或充當(dāng)免疫原。特別重要的片段是生物活性片段，例如，長(zhǎng)度為大約IO個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。這樣的片段通常包括酶肽的結(jié)構(gòu)域或基序，例如，酶肽的活性位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域或酶促活性部分。而且，可能的片段包括但不限于，含有結(jié)構(gòu)域或基序的片段、可溶性肽片段和含有免疫原結(jié)構(gòu)的片段。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)可以很容易地通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且容易獲得的計(jì)算機(jī)程序識(shí)別(例如PROSITE分析)。在一個(gè)實(shí)施方式中，片段具有熒光素酶活性，該熒光素酶活性包括催化ATP依賴性的發(fā)光反應(yīng)，該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在小于或等于530nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。優(yōu)選地，片段具有至少25%的SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性，更優(yōu)選至少40%、50%、60%、70%、80%、卯％或95%的SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，片段具有至少SEQIDNO:2的熒光素酶的熒光素酶活性，或者活性更大。本發(fā)明的多肽可以含有通常稱作20個(gè)天然氨基酸的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸。而且，許多氨基酸，包括末端氨基酸，可以通過(guò)天然方法例如加工和其它翻譯后修飾，或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。酶肽中天然發(fā)生的常見(jiàn)修飾描述于基礎(chǔ)教科書(shū)、詳細(xì)專題文章和科研文獻(xiàn)，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。已知的修飾包括但不限于，乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、，羧化、糖基化、GPI錨的形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加，例如精氨?；捅樵诘鞍谆?。這些修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中得到詳細(xì)描述。例如，幾種特別常見(jiàn)的修飾一一糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧化、羥基化和ADP-核糖基化，描述于最基本的教科書(shū)中，例如Proteins—StructureandMolecularProperties,2ndEd"T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993)。這一主題有許多詳細(xì)的綜述，例如Wold,F.,PosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,Ed"AcademicPress,NewYork1-12(1983);Seifter等人(Meth.Enzymol.182:626-646(1990))和Rattan等人(Ann.N.YAcad.Sci.663:48-62(1992))。因此，本發(fā)明的酶肽還包括衍生物或類似物，其中置換的氨基酸殘基不是遺傳密碼編碼的殘基，其中包括取代基，其中成熟酶肽與其它化合物(例如增加酶肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇))融合，或者其中額外的氨基酸與成熟酶肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于提純成熟酶肽的序列或前蛋白(pro-protein)序列。蛋白質(zhì)/肽的應(yīng)用本發(fā)明的肽的潛在應(yīng)用主要基于蛋白質(zhì)的來(lái)源、以及蛋白質(zhì)的分類/作用。這些應(yīng)用可以很容易地使用本文提供的信息(其為本領(lǐng)域公知的)和常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包括可能在本發(fā)明之前公開(kāi)的變體和片段)可以用于涉及熒光素酶成員相關(guān)的酶的生物檢驗(yàn)。這些檢驗(yàn)通常涉及任何己知的酶功能或活性或熒光素酶性質(zhì)。本發(fā)明的肽、片段或熒光素酶也可以用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和適合于熒光素酶肽或片段的任何方法或組合物。示范性應(yīng)用的非窮舉列表包括美國(guó)專利第6,927,037;6,690,461;6,602,658;6，602，657;6,586,196;6,503,723;6,297,018;6,171,809;6,143,502;和6,068,979號(hào)中公開(kāi)的那些。而且，本發(fā)明的實(shí)施方式適合于例如在稱作生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)的技術(shù)中的興奮性配偶體(excitatorypartner)的應(yīng)用(參見(jiàn)，例如，WO/1999/066324)。.本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生抗體，或者引起其它免疫反應(yīng)；在設(shè)計(jì)成定量測(cè)定生物流體中的蛋白質(zhì)(或其結(jié)合配偶體或配體)的水平的檢驗(yàn)中用作試劑；以及用作其中相應(yīng)蛋白質(zhì)優(yōu)先表達(dá)的組織的標(biāo)記物。在蛋白結(jié)合或潛在地結(jié)合另一蛋白或配體(例如，在酶-效應(yīng)器蛋白相互作用或酶-配體相互作用中)時(shí)，蛋白質(zhì)可以用來(lái)鑒別結(jié)合配偶體/配體，以開(kāi)發(fā)鑒別結(jié)合相互作用抑制劑的系統(tǒng)。任何或全部的這些應(yīng)用能夠開(kāi)發(fā)成試劑級(jí)別或試劑盒形式，用于商品的商業(yè)化。用于進(jìn)行上述應(yīng)用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。公開(kāi)這些方法的參考文獻(xiàn)包括"MolecularCloning:ALaboratoryManual"，2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Sambrook，J.，E.RFritsch禾卩T.Maniatiseds.，1989，禾口"MethodsinEnzymology:GuidetoMolecularCloningTechniques",AcademicPress,Berger,S.L,禾口A.R.Kimmeleds.,1987。多肽可以用于鑒別以其天然狀態(tài)或改變的形式調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的酶活性的化合物。本發(fā)明的酶和適當(dāng)?shù)淖凅w和片段都可以用于高通量篩選，以檢驗(yàn)候選化合物與酶結(jié)合或參與發(fā)光反應(yīng)的能力。這些化合物可以針對(duì)功能酶進(jìn)一步篩選，以確定化合物對(duì)酶活性的影響。而且，這些化合物可以在動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中試驗(yàn)，以測(cè)定活性/效力?；衔镞€可以鑒別為將酶激活(激動(dòng)劑)或滅活(拮抗劑)至所需程度。而且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于篩選化合物刺激或抑制酶蛋白質(zhì)和通常與酶蛋白質(zhì)相互作用的分子(例如底物或酶蛋白質(zhì)通常相互作用的信號(hào)途徑的組分、或者發(fā)光反應(yīng)涉及的輔因子)之間的相互作用的能力。這些檢驗(yàn)通常包括以下步驟在使酶蛋白質(zhì)或片段與靶分子相互作用的條件下，將酶蛋白質(zhì)與候選化合物合并，以檢測(cè)蛋白質(zhì)和靶之間的復(fù)合物的形成，或檢測(cè)與酶蛋白質(zhì)和靶之間的相互作用的生物化學(xué)結(jié)果，例如熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)的單個(gè)反應(yīng)步驟。候選化合物包括，例如(1)有機(jī)和無(wú)機(jī)小分子(例如從合成組合庫(kù)或天然產(chǎn)物庫(kù)得到的分子)；(2)抗體(例如多克隆、單克隆、人源化、抗-特應(yīng)性、嵌合和單鏈抗體以及Fab、F(ab').sub.2、Fab表達(dá)庫(kù)片段、和抗體表位結(jié)合片段)；(3)磷酸肽(例如隨機(jī)和部分簡(jiǎn)并的定向磷酸肽庫(kù)的成員，參見(jiàn)，例如Songyang等人，Cell72:767-778(1993));和(4)肽，例如可溶性肽，包括Ig-尾的融合肽和隨機(jī)肽庫(kù)的成員(參見(jiàn)，例如，Lam等人，Nature354:82-84(1991);Houghten等人，Nature354:84-86(1991))和組合化學(xué)得到的由D-或L-構(gòu)型氨基酸組成的分子庫(kù)。一種候選化合物是本發(fā)明的變體肽，其與例如SEQIDNO:2的肽競(jìng)爭(zhēng)底物結(jié)合。其它候選化合物包括突變體酶或含有突變的適當(dāng)片段，其影響酶的功能并從而競(jìng)爭(zhēng)底物。因此，本發(fā)明包括競(jìng)爭(zhēng)底物的片段，例如以較高的親和力，或者結(jié)合底物但不釋放的片段。本發(fā)明進(jìn)一步包括識(shí)別調(diào)節(jié)(刺激或抑制)酶活性的化合物的其它終點(diǎn)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)通常包括表明酶活性的發(fā)光途徑中的活動(dòng)的檢驗(yàn)。酶介導(dǎo)的任何生物或生物化學(xué)功能都可以用作終點(diǎn)檢驗(yàn)。具體地，可以檢驗(yàn)表達(dá)酶的細(xì)胞或組織的生物功能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以在設(shè)計(jì)成發(fā)現(xiàn)與酶相互作用的化合物(例如結(jié)合配偶體、配體或底物)的方法中用于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢驗(yàn)。因此，在使化合物結(jié)合多肽或與多肽相互作用的條件下，將化合物暴露于酶多肽。也可以向混合物中加入可溶性酶多肽。如果試驗(yàn)化合物與可溶性酶多肽相互作用，其可以增加或降低形成的復(fù)合物的量或來(lái)自酶靶的活性。這種類型的檢驗(yàn)尤其可以用于尋求與酶的特定區(qū)域相互作用的化合物的情況。因此，與目標(biāo)酶區(qū)域競(jìng)爭(zhēng)的可溶性多肽設(shè)計(jì)成含有對(duì)應(yīng)于所關(guān)注區(qū)域的肽序列。為了進(jìn)行目的化合物或蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞篩選檢驗(yàn)，有時(shí)需要固定酶蛋白或片段或其目標(biāo)分子，以有助于將復(fù)合物從一種或兩種的未復(fù)合形式中分離。調(diào)節(jié)本發(fā)明的酶之一的試劑可以單獨(dú)使用或結(jié)合使用一種或多種上述檢驗(yàn)來(lái)識(shí)別。通常優(yōu)選地，首先使用細(xì)胞基或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，然后在可能想要的任何其它模型系統(tǒng)中證實(shí)活性。這些模型系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，可以很容易地在該上下文中使用。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)上述篩選檢驗(yàn)識(shí)別的新的試劑或底物。本發(fā)明的肽還提供用于診斷活性蛋白質(zhì)活性的標(biāo)靶，特別是其它熒光素酶已知的活性和條件。因此，可以從生物樣品中分離出肽，并檢驗(yàn)導(dǎo)致畸變肽的基因突變的存在。這包括氨基酸置換、缺失、插入、重排、(由于畸變拼接現(xiàn)象)和不適當(dāng)?shù)姆g后修飾。分析方法包括變更的電泳流動(dòng)性、變更的胰蛋白酶肽消化、細(xì)胞基或無(wú)細(xì)胞檢驗(yàn)中變更的酶活性、底物或抗體結(jié)合模式變更、變更的等電點(diǎn)、直接氨基酸測(cè)序、和任何其它己知的可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)突變的檢驗(yàn)技術(shù)。這樣的檢測(cè)可以以單檢測(cè)形式或多檢測(cè)形式提供，例如抗體芯片陣列。用于肽檢測(cè)的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光，其使用檢測(cè)試劑，例如抗體或蛋白質(zhì)結(jié)合試劑。多報(bào)道基因檢驗(yàn)本發(fā)明的肽特別適合于在多報(bào)道基因檢驗(yàn)中使用。常常使用多、雙(或雙重)報(bào)道基因來(lái)提高實(shí)驗(yàn)精確度。術(shù)語(yǔ)"多報(bào)道基因"是指在單一系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)并測(cè)量?jī)煞N或更多種單獨(dú)的報(bào)道酶。當(dāng)一起使用時(shí)，這些單獨(dú)的報(bào)道酶可以稱作"共報(bào)道基因"。在遺傳報(bào)道中，目前得益于雙報(bào)道基因檢測(cè)的例子包括在遺傳上操縱成同時(shí)表達(dá)兩種不同報(bào)道基因的單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞群體(例如分散在培養(yǎng)物中的細(xì)胞、分離的組織或整個(gè)動(dòng)物)。更常見(jiàn)地，一個(gè)基因的活性報(bào)道特定實(shí)驗(yàn)條件的影響，而第二報(bào)道基因的活性提供內(nèi)部對(duì)照，從而可以對(duì)全套的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行歸一化。實(shí)驗(yàn)報(bào)道基因的活性相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照的活性的歸一化，使得諸如細(xì)胞生活力或轉(zhuǎn)染效率的差異造成的實(shí)驗(yàn)可變性最小化。其它可變性來(lái)源，例如移液體積的差異、細(xì)胞溶解效率和檢驗(yàn)效率，可以有效地消除。因此，通過(guò)減少外部影響，雙報(bào)道基因檢驗(yàn)常常使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解釋更為可靠。目前得益于采用至少兩種報(bào)道基因(即雙報(bào)道基因檢驗(yàn))的例子包括在遺傳上操縱成同時(shí)表達(dá)兩種不同報(bào)道基因的單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞群體(例如分散在培養(yǎng)物中的細(xì)胞、分離的組織或整個(gè)動(dòng)物)。更常見(jiàn)地，一個(gè)基因的活性報(bào)道特定實(shí)驗(yàn)條件的影響，而第二報(bào)道基因的活性提供內(nèi)部對(duì)照，從而可以對(duì)全套的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行歸一化。可以得益于多報(bào)道基因技術(shù)的無(wú)細(xì)胞重構(gòu)系統(tǒng)，是編碼實(shí)驗(yàn)和對(duì)照?qǐng)?bào)道酶的獨(dú)立遺傳材料的同時(shí)翻譯、或偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。免疫檢驗(yàn)可以類似地設(shè)計(jì)用于在單一樣品內(nèi)多重報(bào)道實(shí)驗(yàn)值和對(duì)照值。參見(jiàn)，例如PromegaDual-LuciferaseTM報(bào)道基因檢測(cè)系統(tǒng)以及PromegapGL3熒光素酶報(bào)道基因載體(獲自PromegaCorporation,Madison，Wis.)以及美國(guó)專利第5,744,320號(hào)和第5,670,356號(hào)?？贵w本發(fā)明還提供選擇性地結(jié)合本發(fā)明的肽、包括這種肽的蛋白質(zhì)、以及其變體和片段中的一種的抗體。如本文所用，抗體選擇性地結(jié)合目標(biāo)肽是指，其結(jié)合目標(biāo)肽并且不會(huì)顯著結(jié)合不相關(guān)的蛋白質(zhì)。即使抗體也結(jié)合其它與目標(biāo)肽基本不同源的蛋白質(zhì)，也仍認(rèn)為該抗體選擇性地結(jié)合肽，只要這些蛋白質(zhì)與抗體的肽標(biāo)靶的片段或結(jié)構(gòu)域享有同源性。在該情況下，盡管有一定程度的交叉反應(yīng)性，也要理解成結(jié)合肽的抗體仍是選擇性的。許多產(chǎn)生或識(shí)別指定目標(biāo)肽的抗體的方法是已知的。Harlow,Antibodies,ColdSpringHarborPress,(1989)描述了若干這樣的方法。通常，為了產(chǎn)生抗體，將分離的肽用作免疫原，并給予哺乳動(dòng)物有機(jī)體，例如大鼠、家兔或小鼠。可以使用全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、抗原性肽片段或融合蛋白。特別重要的片段是涵蓋結(jié)構(gòu)域的片斷，例如本文識(shí)別的結(jié)構(gòu)域和序列同源性或家族間趨異的結(jié)構(gòu)域，例如可以使用蛋白質(zhì)比對(duì)方法很容易識(shí)別的片段，如表6所示。抗體可以從本文所述的肽的任何區(qū)域制備。但優(yōu)選的區(qū)域包括參與功能/活性或酶/結(jié)合配偶體相互作用的區(qū)域。圖6A-6E以及表3和5的信息、以及本文通過(guò)實(shí)施例給出的其它指導(dǎo)都可以用于識(shí)別特別重要的區(qū)域，可以使用各種序列比對(duì)來(lái)識(shí)別保守和單一的序列片段?？乖云瓮ǔ０ㄖ辽?個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。但抗原性片段可以包括至少IO、12、14、16或更多個(gè)氨基酸殘基。這些片段可以基于物理性質(zhì)選擇，例如片段對(duì)應(yīng)于位于蛋白質(zhì)表面的區(qū)域，例如親水區(qū)域，或者可以基于序列的唯一性選擇。本發(fā)明抗體的檢測(cè)可以通過(guò)將抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(例如物理連接)而促進(jìn)。可檢測(cè)物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾(luminol);生物發(fā)光材料的例子包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白；合適的輻射性材料的例子包括1251、1311、"S或311。抗體可以用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如親和力色譜或免疫沉淀，分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)之一?？贵w可以促進(jìn)天然蛋白質(zhì)從細(xì)胞中的提純，以及宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的提純。此外，這些抗體可以用于檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)之一在細(xì)胞或組織中的存在，以確認(rèn)蛋白質(zhì)在有機(jī)體中不同組織之間或在發(fā)育進(jìn)程上的正?；虍惓５谋磉_(dá)模式。而且，這些抗體可以用于在原位、體外或在細(xì)胞溶解產(chǎn)物或上清液中檢測(cè)蛋白質(zhì)，以評(píng)價(jià)表達(dá)的豐度和模式。全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的游離片段的抗體檢測(cè)可以用于識(shí)別代謝回轉(zhuǎn)?？贵w還可以用于抑制蛋白質(zhì)功能，例如，阻斷酶肽與結(jié)合配偶體(例如底物)的結(jié)合。這些用途還可以應(yīng)用于分析的情況，其中分析涉及抑制蛋白質(zhì)的功能?？贵w可以用于，例如，阻斷結(jié)合，從而調(diào)節(jié)(激動(dòng)或拮抗)肽的活性?？贵w可以針對(duì)含有功能所需位點(diǎn)的特定片段，或者針對(duì)與細(xì)胞或有機(jī)體有關(guān)的完整蛋白質(zhì)而制備。本發(fā)明還包括用于使用抗體檢測(cè)生物樣品中蛋白質(zhì)的存在的試劑盒。試劑盒可以包括抗體，例如標(biāo)記或可標(biāo)記的抗體，和用于檢測(cè)生物樣品中的蛋白質(zhì)的化合物或試劑；用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的量的裝置；用于將樣品中蛋白質(zhì)的量與標(biāo)準(zhǔn)比較的裝置；和使用說(shuō)明書(shū)。這種試劑盒可以提供成檢測(cè)單一蛋白質(zhì)或表位，或者可以設(shè)置成檢測(cè)眾多表位中的一種，例如在抗體檢測(cè)陣列中。用于核酸陣列的陣列在下文中詳細(xì)描述，已經(jīng)發(fā)展了用于抗體陣列的類似方法。核酸分子本發(fā)明提供圖1、2、4、5和SEQIDNO:1和3所示的分離的核酸分子以及其各種修飾或片段。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的酶肽或蛋白質(zhì)的分離的核酸分子(cDNA、轉(zhuǎn)錄體和基因組序列)。這些核酸分子可以由編碼本發(fā)明的酶肽之一的核苷酸序列、其等位變體、或其直向同源物或種內(nèi)同源基因組成，或基本由其組成或包括其。如本文所用，"分離的"核酸分子是與核酸天然來(lái)源中存在的其它核酸分離的核酸分子。優(yōu)選地，"分離的"核酸不含在有機(jī)體(核酸從中得到)的基因組DNA中天然位于核酸側(cè)翼的序列(即位于核酸5'和3'端的序列)。但是，可以有一些側(cè)翼核苷酸序列，例如，至多大約5千堿基對(duì)(KB)、4KB、3KB、2KB或1KB或更小，特別是連續(xù)肽編碼序列和基因組序列中在同一基因內(nèi)但被內(nèi)含子分隔的肽編碼序列。重要之處在于將核酸與遠(yuǎn)端不重要的側(cè)翼序列分離，使得其可以進(jìn)行本文所述的特定操作，例如重組表達(dá)、探針和引物的制備、以及其它特異于核苷酸序列的應(yīng)用。而且，"分離的"核酸分子，例如轉(zhuǎn)錄體或cDNA分子，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，可以基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化合物。但是，核酸分子可以與其它編碼或調(diào)節(jié)序列融合，仍視為是分離的。例如，載體中含有的重組DNA分子被認(rèn)為是分離的。分離的DNA分子的其它例子包括異源宿主細(xì)胞中保持的重組DNA分子或溶液中的(部分或基本上)提純的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明的分離的DNA分子的體外或體內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄體以及其新的片段。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子進(jìn)一步包括合成產(chǎn)生的這樣的分子。因此，本發(fā)明提供由本發(fā)明的核苷酸序列組成的核酸分子。核酸分子由核苷酸序列組成是指，核苷酸序列是核酸分子的完整核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供基本由本發(fā)明的核苷酸序列組成的核酸分子。核酸分子基本由核苷酸序列組成是指，這樣的核苷酸序列僅僅與很少的其它核酸殘基一起存在于最終的核酸分子中。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括本發(fā)明的核苷酸序列的核酸分子。核酸分子包括核苷酸序列是指，核苷酸序列是核酸分子的最終核苷酸序列的至少一部分。以這種方式，核酸分子可以僅僅是核苷酸序列，或具有額外的核酸殘基，例如與其天然結(jié)合的核酸殘基或異源核苷酸序列。這樣的核酸分子可以具有幾個(gè)額外的核苷酸，或者可以包括數(shù)百或更多個(gè)額外的核苷酸。以下給出了如何容易地制造或分離各種類型的這些核酸分子的簡(jiǎn)要描述。分離的核酸分子可以編碼成熟蛋白質(zhì)加額外的氨端或羧端氨基酸，或成熟肽內(nèi)部的氨基酸(例如當(dāng)成熟形式具有多于一個(gè)肽鏈時(shí))。這些序列可以在從前體到成熟形式的蛋白質(zhì)加工中發(fā)揮作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)運(yùn)輸，延長(zhǎng)或縮短蛋白質(zhì)半衰期或者促進(jìn)用于檢驗(yàn)或產(chǎn)生蛋白質(zhì)的操作，等等。通常在原位的情況下，額外的氨基酸可以通過(guò)細(xì)胞酶遠(yuǎn)離成熟蛋白質(zhì)而加工。如上文提及，分離的核酸分子包括但不限于，單獨(dú)的編碼酶肽的序列；編碼成熟肽的序列和額外的編碼序列，例如前導(dǎo)或分泌序列(例如前體-原(pre-pro)或前蛋白質(zhì)序列)；帶有或不帶有額外的編碼序列的編碼成熟肽的序列，加額外的非編碼序列，例如內(nèi)含子或非編碼5'和3'序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列，其在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(包括拼接和聚腺苷?；盘?hào))、核糖體結(jié)合和mRNA的穩(wěn)定中發(fā)揮作用。此外，核酸分子可以與編碼諸如有助于提純的肽的標(biāo)記序列融合。分離的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA，或者是DNA的形式，包括cDNA和基因組DNA，其通過(guò)克隆得到或通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)或通過(guò)其組合產(chǎn)生。核酸，特別是DNA，可以是雙鏈或單鏈的。單鏈核酸可以是編碼鏈(有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明的肽的片段的核酸分子，以及編碼上述的本發(fā)明的酶蛋白質(zhì)的明顯變體的核酸分子。這些核酸分子可以是天然的，例如等位變體(相同基因座)、種內(nèi)同源基因(不同基因座)和直向同源物(不同有機(jī)體)，或者可以通過(guò)重組DNA方法或通過(guò)化學(xué)合成構(gòu)建。這些非天然變體可以通過(guò)誘變技術(shù)產(chǎn)生，包括應(yīng)用于核酸分子、細(xì)胞或有機(jī)體的誘變技術(shù)。因此，如上文討論，變體可以含有核苷酸置換、缺失、倒置和插入。變化可以在編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)發(fā)生。變化可以產(chǎn)生保守和非保守的氨基酸置換。如本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)"編碼熒光素酶的核酸分子"是指己經(jīng)分離為不含全細(xì)胞核酸的核酸分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)"功能相當(dāng)密碼子"是指編碼相同氨基酸的密碼子，例如精氨酸或絲氨酸的6個(gè)密碼子(表2)，也指編碼生物相當(dāng)?shù)陌被岬拿艽a子，如下文中討論?？紤]到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，如果序列具有至少大約50%、通常至少大約60%、更通常大約70%、最通常大約80%、優(yōu)選至少大約90%、最優(yōu)選大約95%的與本發(fā)明的核苷酸序列相同的核苷酸，則認(rèn)為該序列與所描述的序列基本相同。序列與所描述的序列基本相同也可以從功能上定義成能夠在嚴(yán)格條件下與含有聚核苷酸的互補(bǔ)體的核酸片段雜交。術(shù)語(yǔ)密切相關(guān)的序列是指序列具有相當(dāng)大的序列相似性，或者序列編碼完成熒光素酶功能(即一種或多種導(dǎo)致發(fā)光的活性)或如本文所述引起類似抗原反應(yīng)的蛋白質(zhì)。本文使用術(shù)語(yǔ)密切相關(guān)的序列來(lái)命名與進(jìn)行比較的聚核苷酸或多肽相比相似度最小為50%的序列。本發(fā)明的DNA片段包括那些編碼生物功能相當(dāng)?shù)臒晒馑孛傅鞍踪|(zhì)和肽的DNA片段，如上文所述。這樣的序列可以是密碼子豐余性和氨基酸功能相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，這已知在核苷酸序列和由此編碼的蛋白質(zhì)中是天然發(fā)生的?；蛘?，功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)或肽可以經(jīng)由應(yīng)用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，其中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可以根據(jù)對(duì)交換的氨基酸的性質(zhì)的考慮而設(shè)計(jì)。變化可以通過(guò)應(yīng)用位點(diǎn)定向誘變技術(shù)設(shè)計(jì)，或者可以隨機(jī)引入并隨后篩選所需的功能，如下文所述。天然地，本發(fā)明還包括與編碼菌蚋熒光素酶的聚核苷酸序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的寡核苷酸。"互補(bǔ)"的核酸序列是能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則堿基配對(duì)的序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)序列"是指核苷酸序列通過(guò)上述的相同核苷酸比較可以評(píng)價(jià)為基本互補(bǔ)，或者定義成能夠與聚核苷酸的核酸片段在相對(duì)嚴(yán)格的條件下雜交，例如本文所述的那些?；蛘撸s交片段可以是較短的寡核苷酸。17個(gè)堿基長(zhǎng)的序列在復(fù)雜基因組中應(yīng)該僅出現(xiàn)一次，因此足以指定單一的目標(biāo)序列。盡管更短的寡聚體更容易制造并且更容易到達(dá)體內(nèi)，確定雜交的特異性還涉及許多其它因素。寡核苷酸與其互補(bǔ)靶的結(jié)合親和力和序列特異性均隨著長(zhǎng)度增加而增加。預(yù)計(jì)將使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個(gè)堿基對(duì)的示例性寡核苷酸，但預(yù)計(jì)也使用其它寡核苷酸。也預(yù)計(jì)編碼250、500、1000、1212、1500、2000、2500、3000或3500個(gè)堿基和更長(zhǎng)的較長(zhǎng)聚核苷酸。這些寡核苷酸或聚核苷酸通?？梢杂糜?，例如，在DNA印跡和蛋白質(zhì)印跡中用作探針，以及在擴(kuò)增反應(yīng)中用作引物，或者用于疫苗。表2氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸lieIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuUUAUUGCUAcueCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGecu谷氨酰胺GinQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU天然地，本發(fā)明還包括與本發(fā)明的核苷酸的序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的寡核苷酸。"互補(bǔ)"的核酸序列是能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則堿基配對(duì)的序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)序列"是指核苷酸序列通過(guò)上述的相同核苷酸比較可以評(píng)價(jià)為基本互補(bǔ)，或者定義成能夠與聚核苷酸的核酸片段在相對(duì)嚴(yán)格的條件下雜交，例如本文所述的那些。片段的長(zhǎng)度將決定于其既定用途。例如，片段可以編碼肽的帶有表位的區(qū)域，或者可以用作DNA探針和引物。這樣的片段可以使用已知的核苷酸序列分離，以合成寡核苷酸探針。然后標(biāo)記的探針可以用于篩選cDNA庫(kù)、基因組DNA庫(kù)或mRNA，以分離對(duì)應(yīng)于編碼區(qū)域的核酸。而且，引物可以用于PCR反應(yīng)，以克隆特定的基因區(qū)域。探針/引物通?；旧习ㄌ峒兊墓押塑账峄蚬押塑账釋?duì)。直向同源物、同系物和等位變體可以使用本領(lǐng)域公知的方法識(shí)別。如肽部分所述，這些變體包括編碼肽的核苷酸序列，該肽與圖表中所示的核苷酸序列或該序列的片斷的同源性通常為60-70%、70-80%、80-90%，更典型地為至少約90-95%。這些核酸分子可以很容易地識(shí)別為能夠在溫和至嚴(yán)格的條件下與圖表中所示的核苷酸序列或該序列的片段雜交。等位變體可以很容易地通過(guò)編碼基因的遺傳基因座確定。如本文所用，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，用于核酸雜交的"高嚴(yán)格性條件"、"中嚴(yán)格性條件"和"低嚴(yán)格性條件"在CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F(xiàn).M.等人,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons,(1998))中的第2.10.1-2.10.16頁(yè)和第6.3.1-6頁(yè)解釋。確定雜交嚴(yán)格性的確切條件不僅取決于離子強(qiáng)度(例如0.2XSSC、0.1XSSC)、溫度(例如室溫、42攝氏度、68攝氏度)和去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)或變性劑(例如SDS)的濃度，還取決于以下因素，例如核苷酸序列的長(zhǎng)度、堿基組成、雜交序列之間的錯(cuò)配百分比和其它非相同序列內(nèi)該序列亞型的出現(xiàn)頻率。因此，高、中或低嚴(yán)格性條件可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。通過(guò)將雜交條件從不發(fā)生雜交的嚴(yán)格性水平到首次觀察到雜交的水平而變化，可以確定使指定序列與樣品中最相似的序列雜交(例如，選擇性地)的條件。示范性條件描述于Krause，M.H.和S.A.Aaronson，MethodsinEnzymology，200:546-556(1991)。另外參見(jiàn)Ausubel等人，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons,(1998)，其描述了中或低嚴(yán)格性條件的洗滌條件的確定。洗滌步驟中條件通常設(shè)定成確定雜種互補(bǔ)性的最小水平。通常，以僅發(fā)生同源雜交的最低溫度開(kāi)始，每降低l攝氏度最終洗滌溫度(ssc濃度保持恒定)，使雜交序列當(dāng)中錯(cuò)配的最大程度增加1%。通常，SSC濃度加倍導(dǎo)致Tm增加大約17攝氏度。使用這些指導(dǎo)，用于高、中或低嚴(yán)格性的洗滌溫度可以依據(jù)所尋求的錯(cuò)配水平根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。例如，低嚴(yán)格性洗滌可以包括在室溫下在含有0.2XSSC/0.1%SDS的溶液中洗滌10分鐘；中嚴(yán)格性洗滌可以包括在42攝氏度下在含有0.2XSSC/0.1%SDS的預(yù)溫溶液(42攝氏度)中洗滌15分鐘；高嚴(yán)格性洗滌可以包括在68攝氏度下在含有0.1XSSC/0.1%SDS的預(yù)溫溶液(68攝氏度)中洗滌15分鐘。而且，洗滌可以重復(fù)進(jìn)行或順序進(jìn)行，以得到所需的結(jié)果，這是本領(lǐng)域已知的。通過(guò)在保持目標(biāo)核酸分子和所用引物或探針之間的同一性類似程度或類似性的同時(shí)，改變一個(gè)或多個(gè)參數(shù)(其例子是本領(lǐng)域已知的)，可以確定相當(dāng)?shù)臈l件。核酸分子的應(yīng)用本發(fā)明的核酸分子可以用于探針、引物、化學(xué)中間體，并用于生物檢驗(yàn)。核酸分子可以用作信使RNA、轉(zhuǎn)錄RNA或cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼所述肽的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，并分離對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生相同或相關(guān)肽的變體(等位基因、直向同源物等)的cDNA和基因組克隆。探針可以對(duì)應(yīng)于沿著所提供的核酸分子整個(gè)長(zhǎng)度的任意序列。但是，如所討論，片段應(yīng)理解成不包括本發(fā)明之前公開(kāi)的片段。核酸分子也可以用作PCR引物，以擴(kuò)增核酸分子的任何指定區(qū)域，并用于合成所需長(zhǎng)度和序列的反義分子。如上文提及，反義分子明顯包括通過(guò)RNA干擾有效地實(shí)現(xiàn)表達(dá)調(diào)節(jié)的RNA構(gòu)建物。核酸分子還可以用于構(gòu)建重組載體。這些載體包括表達(dá)肽序列的一部分或全部的表達(dá)載體。載體還包括插入載體，用于整合到另一核酸分子序列中，例如整合到細(xì)胞基因組中，以原位改變基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)。例如，內(nèi)源編碼序列可以經(jīng)由同源重組被含有一個(gè)或多個(gè)特異性引入的突變的編碼區(qū)的全部或部分取代。核酸分子還可以用于表達(dá)蛋白質(zhì)的抗原性部分。核酸分子還可以用作探針，用于通過(guò)原位雜交方法確定核酸分子的染色體位置。核酸分子還可以用于制造載體，該載體含有本發(fā)明的核酸分子的基因調(diào)節(jié)區(qū)域。核酸分子還可以用于設(shè)計(jì)核酶，該核酶對(duì)應(yīng)于由本文所述的核酸分子產(chǎn)生的mRNA的全部或部分。核酸分子還可以用于制造表達(dá)肽的部分或全部的載體。核酸分子還可以用于構(gòu)建表達(dá)核酸分子和肽的部分或全部的宿主細(xì)胞。核酸分子還可以用于構(gòu)建表達(dá)核酸分子和肽的全部或部分的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體。核酸分子還可以用作雜交探針，用于確定核酸表達(dá)的存在、水平、形式和分布。因此，探針可以用于檢測(cè)細(xì)胞、組織和有機(jī)體中特定核酸分子的存在或測(cè)定其水平。測(cè)定水平的核酸可以是DNA或RNA。因此，對(duì)應(yīng)于本文所述的肽的探針可以用于評(píng)價(jià)指定細(xì)胞、組織或有機(jī)體中的表達(dá)或基因拷貝數(shù)。用于檢測(cè)mRNA的體外技術(shù)包括RNA雜交和原位雜交。用于檢測(cè)DNA的體外技術(shù)包括DNA雜交和原位雜交。用于酶核酸表達(dá)的檢驗(yàn)可包括核酸水平(例如mRNA水平)的直接檢驗(yàn)，或者檢驗(yàn)發(fā)光反應(yīng)中涉及的附屬(collateral)化合物。而且，還可以檢驗(yàn)響應(yīng)于信號(hào)或環(huán)境試劑或條件被增量或減量調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。在該實(shí)施方式中，這些基因的調(diào)節(jié)區(qū)域可以與編碼本發(fā)明的一種或多種熒光素酶肽的報(bào)道基因可操作連接。因此，酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以在如下方法中識(shí)別，其中使細(xì)胞與候選化合物接觸，并測(cè)定發(fā)光水平(即強(qiáng)度或光譜)。將存在候選化合物的情況下的發(fā)光特征(光譜、強(qiáng)度分布、絕對(duì)強(qiáng)度等)與不存在候選化合物的情況下的發(fā)光特征進(jìn)行比較。然后基于這一比較，候選化合物可以識(shí)別成核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)物，并用于，例如，治療以畸變核酸表達(dá)為特征的疾病?；蛘?，酶核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以是使用本文所述的篩選檢驗(yàn)識(shí)別的小分子或藥物，只要藥物或小分子抑制表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞和組織中的酶核酸表達(dá)。核酸分子可以用作反義構(gòu)建物，以控制細(xì)胞、組織和有機(jī)體中酶的基因表達(dá)。DNA反義核酸分子設(shè)計(jì)成與有關(guān)轉(zhuǎn)錄的基因的區(qū)域互補(bǔ)，防止轉(zhuǎn)錄并因而防止酶蛋白的產(chǎn)生。反義RNA或DNA核酸分子將與mRNA雜交，從而阻斷mRNA翻譯到酶蛋白質(zhì)內(nèi)。進(jìn)行RNA干擾的技術(shù)和方法明顯包括在這些技術(shù)中。本發(fā)明還包括用于檢測(cè)酶核酸在生物樣品中的存在的試劑盒。例如，試劑盒可以包括試劑，例如標(biāo)記或可標(biāo)記的核酸，或能夠檢測(cè)生物樣品中的酶核酸的試劑；用于測(cè)定樣品中酶核酸的量的裝置；和用于將樣品中酶核酸的量與標(biāo)準(zhǔn)比較的裝置?；衔锘蛟噭┛梢园b在合適的容器中。試劑盒可以進(jìn)一步包括使用試劑盒檢測(cè)酶蛋白質(zhì)mRNA或DNA的說(shuō)明書(shū)。核酸陣列本發(fā)明進(jìn)一步提供核酸檢測(cè)試劑盒，例如基于所提供的序列信息的核酸分子的陣列或微陣列。如本文所用，"陣列"或"微陣列"是指在底物，例如紙、尼龍或其它類型的膜、濾器、芯片、載玻片、或任何其它合適的固體載體上合成的不同聚核苷酸或寡核苷酸的陣列。在一個(gè)實(shí)施方式中，微陣列根據(jù)如下文獻(xiàn)中所述的方法制備并使用美國(guó)專利第5,837,832號(hào)，WO/1995/011995、Lockhart,D.J.等人(1996;Nat.Biotech.14:1675-1680)、和Schena,M.等人(1996;Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614-10619)。在其它實(shí)施方式中，這樣的陣列通過(guò)美國(guó)專利第5,807,522號(hào)中所述的方法制造。微陣列或檢測(cè)試劑盒優(yōu)選由固定在固體載體上的大量唯一的、單鏈的核苷酸序列組成，上述核苷酸序列通常是合成的反義寡核苷酸或cDNA片段。寡核苷酸優(yōu)選長(zhǎng)度為大約6-60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度為15-30個(gè)核苷酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度為大約20-25個(gè)核苷酸。對(duì)于某些類型的微陣列或檢測(cè)試劑盒，可以優(yōu)選使用長(zhǎng)度僅7-20個(gè)核苷酸的寡核苷酸。含有覆蓋己知5'或3'序列的寡核苷酸、覆蓋全長(zhǎng)序列的連續(xù)寡核苷酸；或者選自沿著序列長(zhǎng)度的特定區(qū)域的唯一寡核苷酸。微陣列或檢測(cè)試劑盒中使用的聚核苷酸可以是特異于所關(guān)注基因或多個(gè)基因的寡核苷酸。在使用微陣列或檢測(cè)試劑盒的樣品分析的例子中，可以將來(lái)自生物樣品的RNA或DNA制成雜交探針。分離mRNA，產(chǎn)生cDNA并將其用作制造反義RNA(aRNA)的模板。將aRNA在熒光核苷酸的存在下進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記的探針與微陣列或檢測(cè)試劑盒一起孵育，使得探針序列與微陣列或檢測(cè)試劑盒的互補(bǔ)寡核苷酸雜交。孵育條件調(diào)節(jié)成雜化以精確的互補(bǔ)匹配或不同程度的較少互補(bǔ)性發(fā)生。除去非雜化的探針之后，使用掃描裝置測(cè)定熒光的水平和模式?？疾鞉呙璧膱D像，以確定微陣列或檢測(cè)試劑盒上每個(gè)寡核苷酸序列的互補(bǔ)性程度和相對(duì)豐度。生物樣品可以獲自任何所關(guān)注的合適來(lái)源。檢測(cè)系統(tǒng)可以用于同時(shí)測(cè)量所有不同序列的雜交的缺乏、存在和量。該數(shù)據(jù)可以用于對(duì)樣品、物種或環(huán)境樣品之間的序列、表達(dá)模式、突變、變體或多態(tài)性進(jìn)行大規(guī)模關(guān)聯(lián)性研究。本發(fā)明的測(cè)試樣品包括細(xì)胞、細(xì)胞的蛋白質(zhì)或膜提取物、甚至是粗的環(huán)境樣品。用于上述方法的測(cè)試樣品將基于檢驗(yàn)形式、檢測(cè)方法的性質(zhì)和用作樣品待檢驗(yàn)的組織、細(xì)胞或提取物而變化。制備核酸提取物或細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，可以很容易地使其適應(yīng)以得到與所用系統(tǒng)相容的樣品。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供含有進(jìn)行本發(fā)明的檢驗(yàn)必需的試劑的試劑盒。載體/宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供含有本文所述核酸分子的載體。術(shù)語(yǔ)"載體"是指可以轉(zhuǎn)運(yùn)核酸分子的載劑，優(yōu)選核酸分子。當(dāng)載體是核酸分子時(shí)，核酸分子與載體核酸共價(jià)連接。在本發(fā)明的這一方面，載體包括質(zhì)粒、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體、或人工人染色體，例如BAC、PAC、YAC或MAC。載體可以作為外部染色體元件保持在宿主細(xì)胞中，并在此復(fù)制并產(chǎn)生額外的核酸分子拷貝?；蛘撸d體可以整合到宿主細(xì)胞基因組中，當(dāng)宿主細(xì)胞復(fù)制時(shí)產(chǎn)生額外的核酸分子拷貝。本發(fā)明提供用于維持的載體(克隆載體)或用于表達(dá)核酸分子的載體(表達(dá)載體)。載體可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或兩者中(往復(fù)載體)發(fā)揮作用。表達(dá)載體含有與核酸分子在載體中可操作連接的順式作用調(diào)節(jié)區(qū)，使得宿主細(xì)胞中可以進(jìn)行核酸分子的轉(zhuǎn)錄。核酸分子可引入到宿主細(xì)胞中，單獨(dú)的核酸分子能夠影響轉(zhuǎn)錄。因此，第二核酸分子可以提供與順式調(diào)節(jié)控制區(qū)相互作用的反式作用因子，使核酸分子從載體轉(zhuǎn)錄?；蛘?，反式作用因子可以由宿主細(xì)胞提供。最后，反式作用因子可以由載體自身產(chǎn)生。但應(yīng)當(dāng)理解到，在一些實(shí)施方式中，核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯可以在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)生。本文所述的核酸分子可以可操作連接的調(diào)節(jié)序列包括用于指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些包括但不限于，來(lái)自細(xì)菌噬菌體X的左啟動(dòng)子、lac、TRP、和來(lái)自大腸桿菌的TAC啟動(dòng)子、來(lái)自SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、CMV即時(shí)早期(immediateearly)啟動(dòng)子、腺病毒早期和晚期啟動(dòng)子、和反轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)端重復(fù)單元。除啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的控制區(qū)之外，表達(dá)載體還可以包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，例如阻抑物結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子。例子包括SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期增強(qiáng)子、多瘤增強(qiáng)子、腺病毒增強(qiáng)子、和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR增強(qiáng)子。除含有轉(zhuǎn)錄起始和控制位點(diǎn)之外，表達(dá)載體還可以含有轉(zhuǎn)錄終止所需的序列以及轉(zhuǎn)錄區(qū)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其它用于表達(dá)的調(diào)節(jié)控制元件包括起始和終止密碼子以及聚核苷?；盘?hào)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道許多種可用于表達(dá)載體的調(diào)節(jié)序列。這些調(diào)節(jié)序歹!j描述于，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd.ed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"(1989)?？梢允褂枚喾N表達(dá)載體來(lái)表達(dá)核酸分子。這些載體包括染色體的、附加型和源自病毒的載體，例如來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒、來(lái)自細(xì)菌噬菌體、來(lái)自酵母附加體、來(lái)自酵母染色體元件(包括酵母人工染色體)、來(lái)自病毒(例如桿狀病毒、乳多空病毒例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、痘病毒、假狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)的載體。載體還可以來(lái)自這些來(lái)源的組合，例如來(lái)自質(zhì)粒和細(xì)菌噬菌體遺傳元件，例如黏端質(zhì)粒和噬菌粒。用于原核和真核宿主的合適的克隆和表達(dá)載體描述于Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd.ed.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"(1989)。調(diào)節(jié)序列可以在一種或多種宿主細(xì)胞中提供組成型表達(dá)(即組織特異性)，或者可以在一種或多種細(xì)胞類型中提供誘導(dǎo)型表達(dá)，例如，通過(guò)溫度、營(yíng)養(yǎng)添加劑、或外源因子(例如激素或其它配體)。許多種在原核和真核宿主中提供組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。核酸分子可以通過(guò)公知的方法學(xué)插入到載體核酸中。通常，通過(guò)用一種或多種限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA序列和表達(dá)載體進(jìn)行切割，然后將片段連接在一起，可以將最終被表達(dá)的DNA序列與表達(dá)載體連接。限制性內(nèi)切酶消化和連接的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。含有合適的核酸分子的載體可以使用公知技術(shù)引入到用于繁殖或表達(dá)的合適宿主細(xì)胞中。細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于，大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌。真核細(xì)胞包括但不限于，酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞例如果蠅、動(dòng)物細(xì)胞例如COS和CHO細(xì)胞、以及植物細(xì)胞。如本文所述，可以合意地將肽表達(dá)成融合蛋白。因此，本發(fā)明提供使肽產(chǎn)生的融合載體。融合載體可以增加重組蛋白的表達(dá)，增加重組蛋白的溶解性，并有助于蛋白質(zhì)的提純，例如發(fā)揮配體作用用于親和力提純。可以在融合部分的連接處引入蛋白水解切割位點(diǎn)，使得所需的肽最終可以從融合部分中分離出來(lái)。蛋白水解酶包括但不限于，Xa因子、凝血酶和腸酶(enteroenzyme)。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Smith等人，Gene67:31-40(1988))、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)禾BpRIT5(Pharmacia,Piscataway,N丄)，其分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A與目標(biāo)重組蛋白融合。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的例子包括pTrc(Amarm等人，Gene69:301-315(1988))和pETlld(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185:60-89(1990))。重組蛋白質(zhì)表達(dá)可以通過(guò)提供遺傳背景在宿主細(xì)菌中最大化，其中宿主細(xì)胞具有削弱的蛋白水解切割重組蛋白質(zhì)的能力。(Gottesman，S.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128)?；蛘?，目的核酸分子的序列可以改變成提供用于特定宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)的優(yōu)先密碼子(Wada等人，NucleicAcidsRes.20:2111-2118(1992))。核酸分子也可以由在酵母中操作的表達(dá)載體表達(dá)。用于在酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))中表達(dá)的載體的例子包括pYepSecl(Baldari,等人，EMBOJ.6:229-234(1987))、pMFa(Kujan等人，Cell30:933-943(1982))、pJRY88(Schultz等人，Gene54:113-123(1987))和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)。核酸分子也可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，例如，使用桿狀病毒表達(dá)載體?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人，Mol.CellBiol.3:2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow等人，Virology170:31-39(1989))。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述的核酸分子使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的例子包括pCDM8(Seed,B.Nature329:840(1987))禾卩pMT2PC(Kaufman等人,EMBOJ.6:187-195(1987))。本文所列的表達(dá)載體僅僅作為例子提供，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以得到的公知載體均可以用于表達(dá)核酸分子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，適合于本文所述的核酸分子的維持繁殖或表達(dá)的其它載體。這些載體可以參見(jiàn)，例如，Sambrook,J"Fritsh,E.R禾口Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd，ed.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989。本發(fā)明還包括如下載體，其中本文所述的核苷酸序列以倒置方向克隆到載體中，但與允許反義RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列可操作連接。因此，可以產(chǎn)生本文所述的核酸分子序列的全部或部分的反義轉(zhuǎn)錄體，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。這種反義RNA的表達(dá)相對(duì)于有義RNA的表達(dá)受控于上述的每種參數(shù)(調(diào)節(jié)序列、組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)、組織特異性表達(dá))。本發(fā)明還涉及含有本文所述的載體的重組宿主細(xì)胞。因此，宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、低級(jí)真核細(xì)胞例如酵母、其它真核細(xì)胞例如昆蟲(chóng)細(xì)胞、以及高級(jí)真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以包括但不限于，蠶幼蟲(chóng)、CHO細(xì)胞、大腸桿菌和酵母。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于獲得的技術(shù)，將本文所述的載體構(gòu)建物引入細(xì)胞，可以制備重組宿主細(xì)胞。這些包括但不限于，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、和其它技術(shù)，例如，參見(jiàn)，Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd，ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)0宿主細(xì)胞可以含有一種以上的載體。因此，不同的核苷酸序列可以引入到相同細(xì)胞的不同載體上。類似地，核酸分子可以單獨(dú)引入，或者與其它與該核酸分子無(wú)關(guān)的核酸分子(例如為表達(dá)載體提供反式作用因子的)一起引入。將一種以上的載體引入細(xì)胞時(shí)，載體可以獨(dú)立引入、共同引入或者連接到核酸分子載體上。在細(xì)菌噬菌體和病毒載體的情況下，這些可以通過(guò)感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)方法作為包裝或包封的病毒引入細(xì)胞。病毒載體可以是能夠復(fù)制或復(fù)制缺陷的。在病毒復(fù)制有缺陷的情況下，復(fù)制會(huì)在提供補(bǔ)充缺陷的功能的宿主細(xì)胞中發(fā)生。載體通常包括可選擇標(biāo)記，其能夠選擇含有重組載體構(gòu)建物的細(xì)胞亞群。標(biāo)記物可以包含在含有本文所述的核酸分子的相同載體中，或者可以在單獨(dú)的載體中。標(biāo)記物包括用于原核宿主細(xì)胞的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因，以及用于真核宿主細(xì)胞的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性。但是，任何為表型特征提供選擇性的標(biāo)記物都是有效的。盡管成熟蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其它細(xì)胞中在合適的調(diào)節(jié)序列的控制下產(chǎn)生，無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)也可以用于使用源自本文所述的DNA構(gòu)建物的RNA來(lái)產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)。在需要肽分泌的情況下，這用含有多跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如酶)是很難實(shí)現(xiàn)的，可以將合適的分泌信號(hào)結(jié)合到載體中。信號(hào)序列可以是肽內(nèi)源的，或者是與這些肽異源的。在肽不分泌到培養(yǎng)基中的情況下，蛋白質(zhì)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)破壞過(guò)程從宿主細(xì)胞中分離，例如冰凍融化、超聲處理、機(jī)械破壞、使用細(xì)胞溶解劑和類似物。然后可以將肽回收，并使用公知的提純技術(shù)提純，包括硫酸銨沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和力色譜、羥磷灰石色譜、凝集素色譜或高效液相色譜。應(yīng)當(dāng)理解到，依賴本文所述的肽的重組產(chǎn)生中的宿主細(xì)胞，肽可以取決于細(xì)胞而具有各種糖基化形式，或者當(dāng)在細(xì)菌中產(chǎn)生時(shí)是非糖基化的。此外，在一些情況下由于宿主介導(dǎo)的過(guò)程，肽可以包括初始的修飾甲硫氨酸。載體和宿主細(xì)胞的應(yīng)用本文所述的表達(dá)肽的重組宿主細(xì)胞具有多種用途。首先，細(xì)胞可以用于產(chǎn)生酶蛋白質(zhì)或肽，其可以進(jìn)一步提純，以產(chǎn)生所需量的酶蛋白質(zhì)或片段。因此，含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可以用于肽的產(chǎn)生。宿主細(xì)胞還可以用于進(jìn)行基于細(xì)胞的檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)涉及酶蛋白質(zhì)或酶蛋白質(zhì)片段，例如上文所述的以及本領(lǐng)域己知的其它形式。因此，表達(dá)天然酶蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞可以用于檢驗(yàn)刺激或抑制酶蛋白質(zhì)功能的化合物。宿主細(xì)胞還可以用于識(shí)別其中這些功能受影響的酶蛋白質(zhì)突變體。如果突變體天然存在并引起病理學(xué)，含有該突變的宿主細(xì)胞可以用于檢驗(yàn)對(duì)突變的酶蛋白質(zhì)具有所需作用(例如刺激或抑制功能)的化合物，其可能不通過(guò)其對(duì)天然酶蛋白質(zhì)的作用而指示。轉(zhuǎn)基因?qū)W菌蚋熒光素酶核酸可以用于在細(xì)胞系中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的、非人植物或動(dòng)物或位點(diǎn)特異性的細(xì)胞修飾。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括一種或多種根據(jù)本發(fā)明的核酸作為轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)化成包括轉(zhuǎn)基因的親本細(xì)胞及其子代也包括在該定義內(nèi)。在許多實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是指并不正常地包埋或含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的細(xì)胞。在這些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并不天然地含有本發(fā)明核酸，核酸在細(xì)胞中在其天然位置以外的位置存在，即在非天然位置處整合到細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過(guò)同源重組制造，其中改變內(nèi)源基因座?；蛘撸怂針?gòu)建物隨機(jī)整合到基因組中。用于穩(wěn)定整合的載體包括質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒或其它動(dòng)物病毒、YAC和類似物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體包括作為內(nèi)源基因敲除物的細(xì)胞和多細(xì)胞有機(jī)體，例如植物和動(dòng)物，其中內(nèi)源基因的表達(dá)即使沒(méi)有消除也至少被降低。目的轉(zhuǎn)基因有機(jī)體還包括細(xì)胞和多細(xì)胞有機(jī)體，例如植物和動(dòng)物，其中蛋白質(zhì)或其變體在細(xì)胞或組織中通常不表達(dá)的地方表達(dá)，或者以這些細(xì)胞或組織中通常不存在的水平表達(dá)。用于同源重組的DNA構(gòu)建物包括本發(fā)明的基因的至少一部分，其中該基因具有所需的遺傳修飾并包括與目標(biāo)基因座具有同源性的區(qū)域。用于隨機(jī)整合的DNA構(gòu)建物不需要包括與中間重組具有同源性的區(qū)域。方便地，可以包括用于正選擇和負(fù)選擇的標(biāo)記物。通過(guò)同源重組產(chǎn)生具有目標(biāo)基因修飾的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。對(duì)于各種轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)，參見(jiàn)Keown等人(1990),Meth.Enzymol.185:527-537。對(duì)于胚胎干(ES)細(xì)胞，可以使用ES細(xì)胞系，或者可以從宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠等)新鮮獲得胚胎細(xì)胞10。這些細(xì)胞在合適的成纖維細(xì)胞-飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)，或者在白血病抑制因子(LIF)的存在下生長(zhǎng)。當(dāng)ES或胚胎細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)化時(shí)，它們可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中平板接種在飼養(yǎng)層上。含有構(gòu)建物的細(xì)胞可以通過(guò)使用15種選擇性培養(yǎng)基檢測(cè)。充分長(zhǎng)時(shí)間使菌落生長(zhǎng)后，將其挑取，并分析同源重組的發(fā)生或構(gòu)建物的整合。然后可以將陽(yáng)性的克隆用于胚胎操作和胚泡注射。胚泡可以自4-6周齡的超排卵雌性獲得。將ES細(xì)胞胰蛋白酶化，然后將修飾過(guò)的細(xì)胞注射到20個(gè)胚泡的囊胚腔中。注射之后，將胚泡返回假孕雌性的每個(gè)子宮角。然后使雌性妊娠結(jié)束(gototerm)，產(chǎn)生的后代進(jìn)行構(gòu)建物篩選。通過(guò)提供不同顯型的胚泡和遺傳修飾細(xì)胞，可以很容易檢測(cè)出嵌合子代。對(duì)嵌合動(dòng)物在修飾基因存在的情況下進(jìn)行篩選，使具有修飾的雄性和雌性交配，產(chǎn)生純合子代。如果基因改變?cè)诎l(fā)育中在某一點(diǎn)導(dǎo)致致死性，可以將組織或器官維持成異源或異系同基因的移植物或移植體，或者保持在體外培養(yǎng)物中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是任何非人哺乳動(dòng)物，例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家畜等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于功能研究或調(diào)節(jié)物篩選，或本領(lǐng)域技術(shù)人員提供或已知的其它用途。轉(zhuǎn)基因植物可以以類似方式產(chǎn)生并使用。制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物的方法描述于美國(guó)專利第5,767,367;5，750，870;5，739，409;5,689,049;5,689,045;5,674,731;5,656,466;5，633，155;5,629,470;5,595,896;5,576,198;5,538,879;5,484,956號(hào)中。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法也綜述于PlantBiochemistryandMolecularBiology(eds.Lea&Leegood，JohnWiley&Sons)(1993)第275-295頁(yè)。簡(jiǎn)言之，根據(jù)植物物種的性質(zhì)，收獲合適的植物細(xì)胞或組織。因此，在某些實(shí)例中，分離原生質(zhì)體，其中這些原生質(zhì)體可以從許多種不同植物組織分離，例如葉、下胚軸(hypoctyl)、根等。對(duì)于原生質(zhì)體的分離，將收獲的細(xì)胞在纖維素酶的存在下孵育，以除去細(xì)胞壁，其中精確的孵育條件根據(jù)由其得到細(xì)胞的植物或組織的類型而變化。然后通過(guò)篩分和離心將產(chǎn)生的原生質(zhì)體與產(chǎn)生的細(xì)胞碎片分離。也可以使用包括體細(xì)胞的胚胎發(fā)生外植體來(lái)代替原生質(zhì)體的使用，以制備轉(zhuǎn)基因宿主。細(xì)胞或組織收獲之后，將關(guān)注的外源DNA引入植物細(xì)胞。多種不同的技術(shù)可用于這種引入。對(duì)于分離的原生質(zhì)體，引入機(jī)會(huì)通過(guò)DNA-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方案升高，該方案包括將原生質(zhì)體與包括目的外源編碼序列的裸DNA(例如質(zhì)粒)一起在多價(jià)陽(yáng)離子(例如PEG或PLO)的存在下一起孵育；和將原生質(zhì)體在包括目的外源序列的裸DNA的存在下進(jìn)行電穿孔。然后選擇己經(jīng)成功吸收外源DNA的原生質(zhì)體，通過(guò)與合適量和比例的刺激因子(例如生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素)接觸，將其生長(zhǎng)成胼胝體，并最終生長(zhǎng)成轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)于胚胎發(fā)生外植體，在目標(biāo)體細(xì)胞中引入外源DNA的方便的方法是通過(guò)使用粒子加速或"基因槍"方案。然后使產(chǎn)生的外植體生長(zhǎng)成嵌合植物，得到交叉配種的轉(zhuǎn)基因子代。代替上述裸DNA方法的另一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方便方法是土壤桿菌Ugrak^fe^m)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。對(duì)于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，制備包括外源DNA的共整合的或二元的載體，然后將其引入合適的土壤桿菌菌株，例如Af謹(jǐn)咖c/em。然后將生成的細(xì)菌與制備的原生質(zhì)體或組織外植體(例如葉盤(leafdisk))—起孵育，產(chǎn)生胼胝體。然后將胼胝體在選擇性條件下生長(zhǎng)，選擇，并經(jīng)受生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以誘導(dǎo)根和芽的生長(zhǎng)，最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?？捎糜诒磉_(dá)載體的任何調(diào)節(jié)或其它序列可以形成轉(zhuǎn)基因序列的一部分。這包括內(nèi)含序列和如果己包括的聚腺苷?；盘?hào)。組織特異性調(diào)節(jié)序列可以與轉(zhuǎn)基因可操作連接，以引導(dǎo)酶蛋白表達(dá)至特定細(xì)胞。實(shí)施例包括以下實(shí)施例，以說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以下的實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實(shí)施中發(fā)揮良好作用的技術(shù)，因此可以視為是構(gòu)成實(shí)施其的優(yōu)選方式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)公開(kāi)的具體實(shí)施方式進(jìn)行許多種變化，仍能在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下得到類似或相似的結(jié)果。實(shí)施例中使用的各種材料和方法學(xué)昆蟲(chóng)在NSWNationalParks和WildlifeService的知會(huì)同意下從野外收集v4rac/zwocampaWc/zardae的個(gè)體。從NewnesRailwayTunnel,mapno.8931,gridreferenceE414N187，NewSouthWales,Australia收集100只幼蟲(chóng)An'c/zaW^e。將幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下從胴體剩余部分解剖光器官。菌蚋物種可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)。參見(jiàn)Takaie,H.(1989)Breedinganddisplayoftheglow-worms,^rac/z"oc函/aspp.Insectarium,vol.26July:214-219;Takaie,H.(1997)Tenyearsoftheglow-worm(y4rac/2/wc"/wpa〃'c/zanisae)rearingatTamaZoo-Fascinationofalivingmilkyway.Insectarium,vol34November:336-342.Sakumi,Y.，R.Komatani,K.Tabata禾口H.TakaieOntheglow-wormbreedingatTama化\^分葸使用RNAqueousTM-Micro試劑盒(Ambion)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(除了組織在30(^1溶解溶液中磨碎)，從一個(gè)胴體或大約IO個(gè)光器官分離全RNA。cD7Vj,:代表胴體和光器官的cDNA庫(kù)使用具有改良的CreatorSMARTcDNA庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Clontech)構(gòu)建。第一條cDNA通過(guò)所述的長(zhǎng)程(LD)PCR方法合成，使用1微克使用20周期擴(kuò)增的全RNA禾BcDNA。如制造商所述，將2克擴(kuò)增的dscDNA進(jìn)行蛋白酶K和S刀/消化，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將其在cDNA尺寸分離柱(Invitrogen)上分開(kāi)。將單獨(dú)的部分(至多100ngdscDNA)與100ng》I-消化的pDNR-LIB連接，隨后電穿孔到ElectroMAXTMDH10|3TMTlPhage抗性大腸桿菌(Invitrogen)中。通過(guò)將未擴(kuò)增的庫(kù)用50%(v/v)甘油-LB以l:2稀釋，制備每個(gè)cDNA庫(kù)的甘油儲(chǔ)液(stock)。此外，通過(guò)將100pl10%(v/v)甘油-LB用單克隆接種并在37。C下孵育過(guò)夜，在具有低蒸發(fā)蓋的96孔聚苯乙烯平底板(BectonDickinson)中制備來(lái)自每個(gè)光器官cDNA庫(kù)的1056個(gè)單獨(dú)挑取的克隆的甘油儲(chǔ)液。將這些在-8(TC下冷凍保存。^^^分/^:對(duì)于兩個(gè)光器官cDNA庫(kù)(部分10庫(kù)和部分9庫(kù))的每一個(gè)，質(zhì)粒DNA從96個(gè)隨機(jī)挑取的克隆制備。96-^^^JDA^虔y備:質(zhì)粒DNA根據(jù)自MilliporeCorporation提供的信息(BeckmanCoulter-Biomek2000Workstation-MilliporeProtocols,August2002)改良的方法制備。單個(gè)菌落接種于在無(wú)菌96深孔板中的含有30pg/mL氯霉素的1.1ml2xLuriaBroth中。將板覆以AemSealTM(ExcelScientific,WrightswoodCA)，在設(shè)定在320rpm的軌道式振蕩器中在37"C下孵育24小時(shí)。將板在室溫下以1500g離心5分鐘，傾倒出上清液，通過(guò)將板在棉紙上穩(wěn)固地輕拍從粒狀沉淀上除去過(guò)量流體。使用BioMek2000TM自動(dòng)工作站(BeckmanCoulter)，將150|il溶液1(30mM葡萄糖，15mMTris-HCl(pH8.0)，30mMNa2EDTA，60pg/mlRNaseA)加入到每孔中并混合。將板手動(dòng)渦旋3分鐘。加入溶液2(0.2NNaOH，1%(w/v)SDS)，然后加入150^1溶液3(3.6M鉀；6M乙酸鹽)。將孔的內(nèi)容物徹底混合。將300^1粗的溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至MultiscreenTM澄清板(Millipore)，將其置于真空歧管上的PlasmidTM板(Millipore)之上。將溶解產(chǎn)物在真空下過(guò)濾(7分鐘，203mmHg)。棄去澄清板，將溶解產(chǎn)物在質(zhì)粒板上真空過(guò)濾(8分鐘；508mmHg)。將質(zhì)粒板在相同真空下用每孔200pl水洗滌6分鐘。釋放真空，向質(zhì)粒板的每孔中加入35^110mMTris(pH8.0)，該板在600rpm下震搖15分鐘。將含有質(zhì)粒DNA的孔內(nèi)容物用多道移液器收集。使用CEQ2000DyeTerminatorCycleS叫uencingTM用QuickStartKit(BeckmanCoulter)和100fmol質(zhì)粒DNA對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序。來(lái)^An'c/^血ae^器,cZW」,游克潑游,透游A欲逆使用96-孔復(fù)制因子(V&PScientific,Inc.)將來(lái)自螢火蟲(chóng)光器官cDNA庫(kù)(部分9)甘油儲(chǔ)液的克隆點(diǎn)在Hybond-XIJM膜(Amersham)上。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將膜變性、中和并固定。將點(diǎn)印跡用使用以下引物制備的7%bp的a"P-dATP-標(biāo)記PCR探針進(jìn)行探測(cè)正向引物GWLucScreenU5'-GATGATAATGCACCAGAAAAG-3'導(dǎo)向克隆1E1的核苷酸142-162(SEQIDNO:11)反向引物GWLucScreenL5'-TTATAATATCCAGCATCACCA-3'導(dǎo)向克隆1E1的核苷酸938-918(SEQIDNO:12)。使用cDNA克隆1E1作為模版，遵照Millican和Bird的方法(Millican和Bird1997)產(chǎn)生具有TaqDNA聚合酶(Invitrogen)的PCR探針。印跡根據(jù)膜制造商的說(shuō)明書(shū)雜交并洗滌，然后暴露于X-射線膜。從與1E1雜交的克隆中提純質(zhì)粒DNA，對(duì)插入物進(jìn)行測(cè)序。/夕達(dá)編礙An'c/z"rafeae^"i^1^"/^^^cDA^:制備Jrac/7"0campaWc/"A^ae熒光素酶cDNA的兩個(gè)模型。GWLuc#l(序列4)含有共有區(qū)編碼序列，而GWLiu^2含有單一、沉默的自1308位的共有區(qū)的偏離。GWLuc糾和GWLuc#2在3'UTR中的單一堿基處也不同。GWLuc別使用克隆8F5的5'區(qū)和克隆4F12的3'區(qū)構(gòu)建。克隆8F5是自部分9螢火蟲(chóng)光器官cDNA庫(kù)(8號(hào)板；F5位)分離的全長(zhǎng)cDNA。它與唯一的BamHI位點(diǎn)(1030)的3'區(qū)中的共有區(qū)含有3處不同?？寺?F12是部分cDNA，長(zhǎng)度為1.5kb，3'為相同的BamHl位點(diǎn)，嚴(yán)格符合共有區(qū)編碼序列。因此，在pDNR-LIB的MCS中在BamHI位點(diǎn)與Xhol位點(diǎn)之間的克隆8F5的3'端被移除，來(lái)自克隆4F12的相應(yīng)片段拼接至克隆8F5。GWLuc#2使用上述相同的8F5克隆構(gòu)建，在該情況下，唯一的BamHI位點(diǎn)的3，區(qū)被相應(yīng)的來(lái)自克隆1B6插入的片段代替(將T用C代替)。將構(gòu)建物通過(guò)PCR使用PlatinumPfxTMDNA聚合酶(Invitrogen)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。資^,連欲激游劍吝根據(jù)Viviani(Viviani，Hastings等人2002)從菌蚋的光器官制備含有部分(fraction)的菌蚋熒光素(下文稱為"GW熒光素")。將來(lái)自A〃'c/wW^e的90個(gè)光器官在熱的0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH5中均化。將懸液在95。C下孵育5分鐘，用0.1MHC1酸化至pH2.5-3.0。將提取物用等體積乙酸乙酯萃取，在氮?dú)庀赂稍铩堄辔锶芙庠谒?。?身"對(duì)多序列比對(duì)和種系樹(shù)使用如下程序產(chǎn)生PROTML或PROTPARS程序PROTML(Adachi，J.和Hasegawa，M.1996:MolphyVersion2.3.ProgramsformolecularPhylogeneticsbasedonmaximumlikelihod.ComputerSciencemonographsNo.28.東京統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)學(xué)院的出版物))；PROTPARS(Felsenstein,J.1989.PHYLIP響PhylogenyInferencePackage(Version3.2)Cladistics5:164-166)。成對(duì)比對(duì)和序列同一性和同源性水平使用BestFit(GCG)確定。序列比對(duì)程序通過(guò)AustralianNationalGenomicInformationService提供的BioManager界面使用(http:〃www.angis.org.au)。實(shí)施例l:分庸編碼慮財(cái)資,素艨游凝麼分別地，胴體cDNA庫(kù)自分成部分的胴體dscDNA的部分8-10構(gòu)建，光器官cDNA庫(kù)自分成部分的dscDNA的部分9和10構(gòu)建。在自每個(gè)光器官cDNA庫(kù)分離的96個(gè)克隆中，分別有92和95個(gè)克隆成功進(jìn)行了測(cè)序。使用tBLASTx程序?qū)γ總€(gè)序列針對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行詢問(wèn)。來(lái)自部分lO光器官cDNA庫(kù)的克隆沒(méi)有鑒別出與任何熒光素酶具有同源性，但來(lái)自部分9光器官cDNA庫(kù)的5個(gè)克隆與發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶具有同源性?？寺EI(1275bp);1B6(1163bp);1F7(948bp);1G12(768bp);和1C5(494bp)進(jìn)行完全測(cè)序，而且均顯示出代表相同開(kāi)放閱讀框的獨(dú)立得到的5'-截?cái)嗟牟糠諧DNA，在tBLASTx搜索中，所有5個(gè)克隆均顯示與來(lái)自尸/^;xoAn:xWv&m'/和尸/2n'X0A/2/r加的熒光素酶具有同源性。這些甲蟲(chóng)物種(鞘翅目光熒科)具有發(fā)光幼蟲(chóng)，稱作"鐵路蟲(chóng)"。所有5個(gè)cDNA序列都在5，端被截?cái)嘀敛煌潭取?個(gè)克隆的序列分析識(shí)別出3'端的11個(gè)堿基置換，其中3個(gè)是沉默的。盡管cDNA擴(kuò)增使用了校正DNA聚合酶(Advantage2PolymeraseMix,Ckmtech)，在每一個(gè)擴(kuò)增步驟后得到高水平的推定的序列變異。這就有必要對(duì)多個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序，以確定可靠的序列，并分離具有該序列的擴(kuò)增子。當(dāng)用另一種校正DNA聚合酶(Pfx,Invitrogen)擴(kuò)增P/^r"&熒光素酶時(shí)觀察到類似現(xiàn)象。螢火蟲(chóng)和菌蚋的熒光素酶共享的特殊特征在于，存在高比例的核苷酸二分體，這可能可以解釋以這些序列作為目標(biāo)進(jìn)行PCR的相對(duì)較差的保真性。使用96-孔復(fù)制因子(V&PScientific,Inc.)將來(lái)自螢火蟲(chóng)發(fā)光器官cDNA庫(kù)(部分9)甘油儲(chǔ)液的克隆點(diǎn)在Hybond-XL膜(Amersham)上。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將膜變性、中和并固定。用源自1E1的探針對(duì)960個(gè)含有光器官cDNA的菌落進(jìn)行篩選，其中29個(gè)(大約3%)給出陽(yáng)性信號(hào)。由于膜與復(fù)制因子接觸的效率并不完全，這可能對(duì)陽(yáng)性的總數(shù)有所低估。在用1E1探針篩選的大約1000個(gè)來(lái)自部分9胴體cDNA庫(kù)的菌落中，無(wú)一發(fā)現(xiàn)呈陽(yáng)性。通過(guò)PCR對(duì)21個(gè)給出的雜交信號(hào)最強(qiáng)的克隆進(jìn)行篩選，使用導(dǎo)向5'載體序列的pDONRLIBM13F作為正向引物，使用導(dǎo)向1E1核苷酸804-788的GWLuc484作為反向引物。從10個(gè)目標(biāo)克隆中獲得擴(kuò)增子，證實(shí)其與lEl的5'端重疊。4個(gè)擴(kuò)增子顯示出比1E1要長(zhǎng)。其中之一獲自克隆4F12，長(zhǎng)度為l.l千堿基對(duì)，表明全克隆長(zhǎng)度為1.5千堿基對(duì)。獲自克隆11B11、8F5和6B6的三個(gè)其它擴(kuò)增子的長(zhǎng)度均為1.3千堿基對(duì)，表明每個(gè)克隆的長(zhǎng)度為1.7千堿基對(duì)。An'c油ae熒光素酶的完全開(kāi)放閱讀框的序列通過(guò)對(duì)克隆1E1、1B6、1F7、1C5、1G12和11B11、8F5禾卩6B6的測(cè)序而推導(dǎo)。來(lái)自至少3個(gè)獨(dú)立克隆的序列在全部核苷酸位置上進(jìn)行比較。共有區(qū)核苷酸序列顯示于圖1A至圖IB或SEQIDNO:1。在少數(shù)情況中，三個(gè)或更多個(gè)測(cè)序的克隆中單獨(dú)的一個(gè)具有不同于共有區(qū)的序列。這些變異列于表3中。表3.測(cè)序的Jrac/wocwwpan'c/za^ae部分或全長(zhǎng)克隆中的唯一的核苷酸變異<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>進(jìn)行PCR篩選，以鑒別與克隆llBll、8F5和6B6相同的5，端上游任何額外的未翻譯的序列。使用菌蚋光器官cDNA作為模板，通過(guò)半錨PCR得到代表熒光素酶基因5'端的cDNA克隆。在菌蚋光器官cDNA的構(gòu)建中(CreatorSMARTcDNA庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Clontech)，LD-PCR合成)，已經(jīng)將SMARTIVOligo引物添加到所有擴(kuò)增的cDNA上。因此使用SMARTIVOligo引物的一部分錨定PCR反應(yīng)的5'端5'-CAACGCAGAGTGGCCATTA-3'(SEQIDNO:13)。使用導(dǎo)向熒光素酶cDNA的核苷酸514-494的熒光素酶基因特異性引物作為反向引物5'-TGGCTTTTCTGGTGCATTATC-3'(SEQIDNO:14)。使用如之前所述制備但在消化和尺寸分級(jí)(fractionation)之前的菌蚋光器官cDNA庫(kù)的等分試樣作為模板。將DNA用HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen)進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增子(大約500bp)克隆到pGEMTeasy(Promega)中。對(duì)識(shí)別為加工熒光素酶cDNA的13個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。其中，8個(gè)具有與推定的全長(zhǎng)熒光素酶cDNA克隆llBll、8F5和6B6完全相同的5'UTR序列。cDNA在一個(gè)翻譯框內(nèi)顯示出單個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框。該序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的序列。ORF在用于核糖體啟動(dòng)的校正AXXAUGG菌肉(context)中以AUG開(kāi)始(Kozak1986;Kozak1987)，并在核苷酸1621位以UAA終止密碼子終止。蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為530個(gè)氨基酸，該長(zhǎng)度與其它昆蟲(chóng)熒光素酶和類熒光素酶(luciferase-like)蛋白質(zhì)類似。熒光素酶計(jì)算的分子量為58,955，計(jì)算的等電點(diǎn)為7.36。因此，其或多或少小于尸/70^my/^ra/^熒光素酶(deWet等人1987)和若干其它螢火蟲(chóng)熒光素酶。計(jì)算的菌蚋熒光素酶的分子量與通過(guò)凝膠過(guò)濾測(cè)定的值大為不同。Viviani，Hastings等人(2002)教導(dǎo)分子量為36kDa。實(shí)施例2:慮財(cái)黃_^素艨,身與其&虔^資艨游#身游^夢(mèng)用回收的菌蚋熒光素酶序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行tBLASTX搜索，發(fā)現(xiàn)來(lái)自D.we/a"ogaWer禾卩^wop/ze/^sga附6z'ae的類熒光素酶蛋白質(zhì)以及來(lái)自尸/W;co^^w'W"m'、螢火蟲(chóng)和其它發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶。菌蚋熒光素酶與甲蟲(chóng)之間的氨基酸同源性在菌蚋序列的Asn9處開(kāi)始，其對(duì)應(yīng)于發(fā)現(xiàn)于甲蟲(chóng)熒光素酶中5位和9位之間的保守天冬酰胺(圖6)。在核苷酸水平上，與i3WW""/熒光素酶的同一性水平最高(58.1%)，但與尸/zo"mw;^rato的同一性水平幾乎一樣高(57.1%)。表4.An'c/zw^ae熒光素酶、兩種代表性發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶和兩種非發(fā)光蠅的類熒光素酶蛋白質(zhì)之間的成對(duì)序列比較的小結(jié)。P/zn'xo/2n'jcWWam'是使用AWc/zarafsae查詢?cè)贜CBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)的tBLASTx搜索中產(chǎn)生的得分最高的熒光素酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>Z>aso/7/2//a和」w^/7e/^的類熒光素酶蛋白質(zhì)多少具有水平較低的核苷酸同一性。在氨基酸水平上，與D.me/G"og"W^的類熒光素酶蛋白質(zhì)的同一性(38.8%)和同源性(51.2%)水平最高。與功能性熒光素酶的同一性(34.9%)和同源性(48.3%)水平最高的是來(lái)自尸/^xo^/jcv^'aw/的酶(表4)。很明顯，菌蚋物種的熒光素酶與螢火蟲(chóng)和其它甲蟲(chóng)的熒光素酶屬于同一基因超家族。另外顯然菌蚋熒光素酶是該家族的新的成員，僅與甲蟲(chóng)熒光素酶具有很遠(yuǎn)的關(guān)系。這通過(guò)以下觀察結(jié)果得到強(qiáng)調(diào)在氨基酸水平上，與體內(nèi)或體外都沒(méi)有發(fā)光活性的類熒光素酶蛋白質(zhì)的序列相似度更大?；趤?lái)自18個(gè)物種的發(fā)光甲蟲(chóng)的熒光素酶序列的比對(duì)，這18個(gè)物種代表來(lái)自叩甲科的一個(gè)屬、來(lái)自光熒科的一個(gè)屬和來(lái)自熒科的8個(gè)屬，甲蟲(chóng)熒光素酶共享128個(gè)完全保守的氨基酸殘基(圖6)。螢火蟲(chóng)熒光素酶的長(zhǎng)度一貫為大約550個(gè)氨基酸殘基。因此，迄今測(cè)序的所有甲蟲(chóng)熒光素酶成員之間大約23%的殘基是完全保守的。相反，熒光素酶一?；?CoA連接酶和肽合成酶超家族的所有成員之間僅有7個(gè)殘基是完全保守的(Conti等人1996)。An'c^^A^熒光素酶的序列在128個(gè)當(dāng)中的58個(gè)位置處與甲蟲(chóng)熒光素酶共有區(qū)的序列不同(表3)。因此，An'c/wrd^e熒光素酶序列代表著螢火蟲(chóng)所表現(xiàn)發(fā)光的問(wèn)題的完全不同的解決方案。表5.所有甲蟲(chóng)熒光素酶之間完全保守但AWdz^fe"e序列偏離的58個(gè)殘基的列表。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>尸p戸///中的殘基編號(hào)63所有甲蟲(chóng)熒光素酶中的共有殘基L中的殘基T的殘基編號(hào)64相對(duì)于兩種雙翅目類熒光素酶蛋白質(zhì)#的分類83ED8488FY89389FY90491PI924103AC1043109YW110113ED114139VI1403160GP1614198ST197212HQ2112218R缺失213-2144224DS2194225P缺失219-2204228GD221233PK2264242PQ235243FY236245HN2383253LM246255YR2484273FY2663280YF273298SK291300E2934311ER3044315GS308318PT311319LV312339GF3323342S3354尸；^rafcA中的殘基編號(hào)343所有甲蟲(chóng)熒光素酶中的共有殘基T中的殘基s的殘基編號(hào)336相對(duì)于兩種雙翅目類熒光素酶蛋白質(zhì)#的分類2375DH3673380KA3724389EF3813408TS4001417WY4093418V4103427DN4193441I4333442IV4343443KM4353444YV4363445KD4373448QA4403452AT4443458I4503485V4773486VT4783490GR4814506VL4974513RK5044516VC5073527TA5185549K缺失530及以下3表5的注解A:(M15055)熒光素酶，長(zhǎng)度550個(gè)氮基酸。B:A.richardsae熒光素酶，長(zhǎng)度530個(gè)氨基酸。#57個(gè)變化中，我們得到按蚊類熒光素酶基因的序列1.An'c/zaW^e殘基與兩個(gè)雙翅目類熒光素酶序列之一相同，但彼此不同。2.An.c/za油ae、Z).艦/a"ogay/er禾口Aga附Z7/ae歹戔基相同，但其不同于甲蟲(chóng)共有區(qū)。3.爿.n'c/7arafe0e歹戔基與甲蟲(chóng)共有區(qū)不同，但Z).we/a"ogoster禾口Agam&M類熒光素酶蛋白質(zhì)均具有與甲蟲(chóng)共有區(qū)相同的殘基。4.所有三個(gè)雙翅目基因在該位置處具有不同的殘基。5.A.richardsae歹戔基與甲蟲(chóng)共有區(qū)不同，D.me/a"oga^er禾口爿.ga附Z/ae類熒光素酶蛋白質(zhì)二者具有相同的不是甲蟲(chóng)共有區(qū)的殘基。實(shí)施例3:關(guān)經(jīng)賨基麼,泣f游識(shí)，所有迄今測(cè)試的甲蟲(chóng)熒光素酶都使用相同的D-熒光素。誘變研究已經(jīng)揭示了數(shù)個(gè)殘基在甲蟲(chóng)熒光素酶的底物結(jié)合或催化機(jī)制中的重要性。/1n'c/zwd^e的熒光素酶在這些關(guān)鍵殘基的亞型處序列不同。已經(jīng)顯示螢火蟲(chóng)熒光素酶的精氨酸218是必要的熒光素結(jié)合位點(diǎn)殘基(Branchini，Magyar等人2001)。R218用谷氨酰胺、賴氨酸或丙氨酸取代，導(dǎo)致熒光素的KM值增加15-20倍。閃光高度(強(qiáng)度)分別降低至野生型的值的33%、5%和3.6%，并且keat數(shù)值降低。所有三個(gè)突變體中的發(fā)射最大值波長(zhǎng)也均有降低。R218代表了上述在所有考察的18種甲蟲(chóng)熒光素酶中完全保守的殘基中的一個(gè)。但是，在菌蚋熒光素酶的對(duì)應(yīng)區(qū)域中，缺失了4個(gè)氨基殘基。An'c/wr^sae的N213禾nL214之間的缺失(表3)包括預(yù)計(jì)出現(xiàn)精氨酸的位置，相當(dāng)于i3p,afc的R218(圖6)?？缭饺笔У腁n'c/za^sae殘基K205、G206、V207和H216在菌蚋和所有18種甲蟲(chóng)熒光素酶之間是完全保守的(圖6)。直接相鄰于缺失的殘基N213、L214和1215分別與10、2和2個(gè)其它甲蟲(chóng)熒光素酶相同。因此，菌蚋熒光素酶的底物結(jié)合特性在這一區(qū)域中大大偏離于甲蟲(chóng)熒光素酶的性質(zhì)。在更廣泛的研究中(Branchini，Southworth等人2003)，據(jù)信位于i3熒光素酶活性位點(diǎn)5A內(nèi)的15個(gè)殘基(R218、H245、G246、F247、F250、T251、G315、G316、G341、L342、T343、S347、A348、1351、K529)進(jìn)行了突變。黑體的11個(gè)殘基顯示出4倍或更大的D-熒光素KM的變化。AWc^^^"e熒光素酶中相應(yīng)位置處的殘基在由Branchini鑒別的15種情況中的lO個(gè)中不同(op.cit;DEL213-214R218、N238H245、A239G246、T243F250、A244T251、S308G315、S335L342、S336T343、L339S347、A343I351;也參見(jiàn)圖6)。菌蚋中在這10個(gè)位置各處的氨基酸置換或缺失的性質(zhì)不同于Branchini等人測(cè)試的實(shí)驗(yàn)操作，其僅限于如下R218->K、Q、A(Branchini,Magyar等人2001;Branchini,Southworth等人2003);H245->F、D、A(Branchini,Magyar等人1998;Branchini,Magyar等人2001;Branchini,Southworth等人2003);G246-〉A(chǔ);F247-〉Y、L、A;F250-〉S、G;T251-〉A(chǔ);G315-〉A(chǔ);G316->A;G341->A;L342->A;T343-〉A(chǔ);S347>A;A348->V;1351-〉A(chǔ);K529->A(Branchini,Southworth等人2003)。因此沒(méi)有這些殘基的菌蚋形式的先例，即使是單獨(dú)的置換。而且，Branchini等人測(cè)試的8個(gè)結(jié)合位點(diǎn)殘基(R218、H245、F247、G315、G341、L342、T343和K529)在所有18個(gè)用于比對(duì)的甲蟲(chóng)熒光素酶之間是完全保守的。在An'c/zwd^e中的相應(yīng)位置處(圖6)，這些殘基中的5個(gè)是排列甲蟲(chóng)熒光素酶中底物結(jié)合袋的不變殘基的亞型，相應(yīng)的菌蚋殘基在60%以上的情況下是不同的，這由菌蚋(Jrac/wocaw/"s，)熒光素酶特定片段和尸/z加'mw序列之間的百分比相似性/同一性反映多肽片段(殘基編號(hào))1-200201-350351-530(末端)43.4/28.638.0/27.352.8/41.144.1/30.838.0/28.754.4/41.1結(jié)果使用GAP(GCG/ANGIS)得到。注意BESTFIT得到的結(jié)果基本相同。實(shí)施例4:菌蚋熒光素酶與其它雙翅目的類熒光素酶蛋白質(zhì)的相似性及進(jìn)化起源本發(fā)明的熒光素酶與甲蟲(chóng)熒光素酶共有序列不同的58個(gè)氨基酸殘基中的57個(gè)落入序列可用于D.me/a"ogos/er和AgamWae的"類熒光素酶"蛋白質(zhì)的區(qū)域。在這57個(gè)殘基的33個(gè)上，類熒光素酶蛋白質(zhì)符合甲蟲(chóng)熒光素酶的序列(表5)，即使這些有機(jī)體并不發(fā)光?；谶@些共有殘基，似乎An'c/^^^e的熒光素酶己經(jīng)經(jīng)歷從祖先的科分歧出的進(jìn)化壓力?；谖覀兊男蛄袛?shù)據(jù)，不能推論發(fā)光甲蟲(chóng)和蠅的熒光素酶是否是從共同的發(fā)光祖先進(jìn)化而來(lái)，或者鞘翅目和雙翅目中的發(fā)光是否是從酰基-CoA連接酶家族的類熒光素酶蛋白質(zhì)獨(dú)立進(jìn)化的。實(shí)施例5:^^^^^^^1^^^^^0^ig";^^^^^^y^真&^^為素艨游分f神系學(xué)^游泣f使用來(lái)自發(fā)光鞘翅目昆蟲(chóng)的18種唯一熒光素酶序列、Z).me/awgos^和Agaw&ae的類熒光素酶蛋白質(zhì)、來(lái)自小鼠的?；?CoA連接酶和來(lái)自An'c/z^^ae的新的熒光素酶的PROTML程序(圖7)的未錨定種系分析將螢火蟲(chóng)(熒科例如//oton'a、戶/zo""w、丄am;jT&、Z"c油禾Q戶戶coefe)與鐵道蟲(chóng)(光熒科:即尸/zn'xoAn';c物種)禾口叩頭蟲(chóng)(叩甲科即尸j;rap/2on^物種)分開(kāi)。An'c/w^fc"e的熒光素酶明顯與所有三個(gè)發(fā)光甲蟲(chóng)科分開(kāi)，盡管與甲蟲(chóng)熒光素酶的關(guān)系比與雙翅目類熒光素酶蛋白質(zhì)的關(guān)系密切。但是，在相同序列的分子種系學(xué)中，使用PROTPARS程序用小鼠酰基-Co連接酶錨定(未顯示)，菌蚋熒光素酶的位置是作為雙翅昆蟲(chóng)類熒光素酶蛋白質(zhì)的外組(outgroup)。所有其它熒光素酶之間的關(guān)系不變。實(shí)施例6:^^^^,z素^"游^^這/鍵j^7Zto-/,G亂wc射使用PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)，遵照制造商的推薦，使用每反應(yīng)10pmol的pETGWLucF禾卩pETGWLucRPCR引物對(duì)GWLuc#1的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增pETGWLucF:GACACACCATGGCTTGTACTTCAGT(SEQIDNO:15)pETGWLucR:GACGACCCTAGGTTACAATGTTCCTCTTAAA(SEQIDNO:16)這些引物引入全長(zhǎng)菌蚋熒光素酶cDNA的M:o/和」vr//限制酶切位點(diǎn)5'和3'。提純的PCR產(chǎn)物是A尾的(A-tailed)，如pGEMT-easy載體系統(tǒng)I手冊(cè)(Promega)中所述，將其與pGEMT-easy連接。將構(gòu)建物電穿孔到大腸桿菌DH5a菌株中，使用CEQ2000DyeTerminatorCycleSequencing用QuickStart試齊U盒(BeckmanCoulter)禾口50fmol質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將含有無(wú)錯(cuò)菌蚋熒光素酶cDNA序列的構(gòu)建物用Wco/和^w7/切除，并使用MCS1的iVco/位點(diǎn)和MCS2的力wi7位點(diǎn)插入至UNovagenpET-Duetl載體(EMD/MerckBiosciences,SanDiego/Darmstadt)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pETDuet-l:GWLuc糾。將質(zhì)粒電穿孔到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并再次進(jìn)行測(cè)序。伊^^,朦r尸/w"麗,a/W妖銜將戶/7少rato/wc基因的全長(zhǎng)構(gòu)建物(1653核苷酸)插入到pETDuet-l載體中，得到pETDuet-l:FFLuc，隨后將其電穿孔到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，如對(duì)于pETDuet-l:GWLucM所描述。觀教載沐通過(guò)切除MCS15'的7Vco/位點(diǎn)至MCS2的^vW/位點(diǎn)，其分別從MCS1和MCS2上除去His和S標(biāo)記，由pETDuet-l制備對(duì)照表達(dá)載體pETDuet-l:對(duì)照。產(chǎn)生的5'突出端使用DNA聚合酶I(Klenow，NEB)用25mM每種dNTP進(jìn)行端填充(end-filled)。反應(yīng)在25"C下孵育15分鐘，并通過(guò)加入10mMEDTA和在75t:下孵育20分鐘終止。提純載體，并根據(jù)Fermentas對(duì)于鈍尾連接(bluntendedligation)的推薦，使用T4DNA連接酶(Fermentas)在5%(w/v)PEG8000的存在下進(jìn)行自連接。隨后將對(duì)照載體電穿孔到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，如對(duì)于pETDuet-l:GWLuc糾所描述。充谫誘導(dǎo)將2毫升(mL)空對(duì)照載體pETDuet-l:對(duì)照載體(在BL21(DE3)中)；pETDuet-l:FFLuc(螢火蟲(chóng)(firefly)熒光素酶)構(gòu)建物(在BL21(DE3)中)；pETDuet-hGWLuc(螢火蟲(chóng)(glow-worm)熒光素酶)#1構(gòu)建物(在BU1(DE3)中)和未轉(zhuǎn)化的BLa(DE3)細(xì)胞的培養(yǎng)物，在含有1M葡萄糖的LB培養(yǎng)基中在37t:、200rpm下孵育過(guò)夜。次日，將培養(yǎng)物在室溫下以1，500rpm離心3次，粒狀沉淀重懸浮在2mLLB中。將50mLLB用每個(gè)培養(yǎng)物的1:50稀釋液接種，然后加入501000x氨芐青霉素。誘導(dǎo)開(kāi)始之前將這些接種的溶液在37"C下孵育1小時(shí)。在600nm下測(cè)量培養(yǎng)物的吸收(Abs600nm)，當(dāng)達(dá)到Abs600nm20.6時(shí)，取出4個(gè)lmL的等分試樣，在室溫下以10,000g離心5分鐘，細(xì)胞粒在-8(TC下存儲(chǔ)。誘導(dǎo)從剩余的培養(yǎng)物體積中，將2個(gè)9mL等分試樣轉(zhuǎn)移至50mL錐形離心管中。一個(gè)等分試樣通過(guò)加入IPTG(0.4mM最終濃度)誘導(dǎo)，第二個(gè)不進(jìn)行誘導(dǎo)(取而代之加入等量的水)。未轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)培養(yǎng)物不進(jìn)行誘導(dǎo)，將20mL轉(zhuǎn)移至250mL錐形燒瓶中。隨后，所有培養(yǎng)物在20。C、150rpm下孵育48小時(shí)，這時(shí)測(cè)量Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出3個(gè)250)LiL的等分試樣，在室溫下以10,000g離心5分鐘，粒狀沉淀在-8(TC下存貯用于蛋白質(zhì)分析。將5mLpETDuet-l:對(duì)照載體；pETDuet-1:FFLuc和pETDuet-1:GWLuc#l和15mLBL21(DE3)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至潔凈的離心管中，在4。C下以3,000rpm離心IO分鐘。傾倒出上清液，各丸粒重新懸浮在各個(gè)起始體積的冰冷磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)(137mMNaCl，2.7mMKCl，4.3mMNa2HP04)中，在4°C下以3,000rpm再離心10分鐘。傾倒出PBS，將丸粒重新懸浮在冰冷PBS中，調(diào)節(jié)成與最濃的樣品給出相同的Abs600nm。歪A資分析蛋白質(zhì)分析使用Invitrogen的NuPAGENovexBis-Tris凝膠系統(tǒng)，使用制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將冷凍的細(xì)菌丸粒通過(guò)加入含有50mMDTT的1xNUPAGETM月桂基十二烷基硫酸酯(LDS)樣品緩沖液并在7(TC下加熱IO分鐘而溶解。通過(guò)使細(xì)菌溶解產(chǎn)物穿過(guò)30G針若干次，對(duì)染色體DNA進(jìn)行剪切。將蛋白質(zhì)濃度大致相等的細(xì)菌樣品(通過(guò)測(cè)量細(xì)菌密度(Abs600X稀釋因子)而推測(cè))和SeeBlueTM預(yù)染色標(biāo)準(zhǔn)物(Invitrogen)裝到NUPAGE12%Bis-Tris凝膠上，并在恒定的200V下使用NUPAGEMOPSSDS流動(dòng)緩沖液(pH7.7,50mMMOPS,50mMTris，0.1%(w/v)SDS,1mMEDTA)電泳大約50分鐘，在僅具有XCellSureLockTMMini-cell(Invitrogen)的上室中加入1xNUPAGE抗氧化劑。將凝膠從盒子中取出，在室溫下在45%(v/v)甲醇-10%(v/v)乙酸中輕輕攪動(dòng)10分鐘洗滌3次。最終洗滌之后，將凝膠浸沒(méi)在Faststain(16%(v/v)FastStain儲(chǔ)液(FisherBiotec)、9%(v/v)甲醇、2%(v/v)乙酸)中，在室溫下輕輕攪動(dòng)染色過(guò)夜。傾倒出染色溶液，將凝膠最初于室溫下在10%(V/V)乙酸中漂洗10分鐘，然后保存在10%(V/V)乙酸中。使用視頻圖像捕獲系統(tǒng)以透見(jiàn)熒光照明對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。圖8顯示了用pETDuetl:FFLuc(第5道)或pETDuetl:GWLuc別(第8道)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)丸粒的LDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，表現(xiàn)出類似的蛋白質(zhì)表達(dá)模式。用IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細(xì)菌(用pETDuetl:FFLuc載體)表現(xiàn)出新的特征是螢火蟲(chóng)熒光素酶的51和64kDa之間的譜帶(第5道)。類似地IPTG誘導(dǎo)的用pETDuetl:GWLuc糾載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌表現(xiàn)出新的譜帶(第8道)，表明了菌蚋熒光素酶的成功表達(dá)?？v游產(chǎn)激將40fiLBL21(DE3)未轉(zhuǎn)化細(xì)胞與50pETDuet-1:對(duì)照、pETDuet-l:FFLuc或pETDuet-l:GELuc#l培養(yǎng)物混合，加入10pL1MH2HP04(pH7.8)和20mMEDTA。將細(xì)胞混合物的等分試樣在干冰上快速冷凍，并保存在-80。C下。冷凍細(xì)胞通過(guò)置于室溫水浴中的試管中而解凍。將細(xì)胞等分試樣與300^L現(xiàn)制的溶解混合物(1X熒光素酶細(xì)胞培養(yǎng)物溶解試劑(CCLR,Promega)、1.25mg/mL溶菌酶(Sigma)、2.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)(Sigma))混合。在室溫下孵育10分鐘后，將溶解產(chǎn)物等分，在-8(TC下保存或立即使用。資遊澄驗(yàn)該熒光素檢驗(yàn)使用含有源自菌蚋的熒光素酶("螢火蟲(chóng)熒光素酶"或"GW熒光素酶")的細(xì)胞溶解產(chǎn)物(如上)。將10pL的細(xì)胞溶解產(chǎn)物等分試樣(除非另外指出)加入到OptiPlateTM-96板的孔中。將90(或使最終體積為100pL的合適體積)含有Tris-乙酸鹽緩沖液(pH7.75)、ATP、乙酸鎂和D-熒光素(Sigma)的緩沖混合物加入到溶解產(chǎn)物中，使最終濃度分別為25mM、2mM、4mM和0.4mM?；蛘?，將100pL通過(guò)將10mL熒光素酶檢驗(yàn)緩沖液混合到含有凍干的熒光素酶檢驗(yàn)底物的小瓶中而制備的市售熒光素酶檢驗(yàn)試劑(Promega)，加入到20指定的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中。使用Wallacl420Victor2光度計(jì)(Perkin-Elmer)快速動(dòng)力學(xué)模式測(cè)量總的光輸出。積分時(shí)間設(shè)為0.5秒，重復(fù)次數(shù)設(shè)為100。實(shí)i辨7,曹瀲^iL素朦活絲.與對(duì)照細(xì)胞溶解產(chǎn)物相比，向10pL源自菌蚋的熒光素酶("螢火蟲(chóng)熒光素酶"或"GW熒光素酶")的細(xì)胞溶解產(chǎn)物加入D-熒光素導(dǎo)致生物發(fā)光活性提高(圖16)。已經(jīng)有報(bào)道，甲蟲(chóng)生物發(fā)光系統(tǒng)和菌蚋生物發(fā)光系統(tǒng)之間完全沒(méi)有交叉反應(yīng)性。不同和增加量的GW熒光素酶加入到D-熒光素中，表明該反應(yīng)是定量的(圖17)。在所有情況下，通過(guò)使所用的孔間隔開(kāi)，小心地保證孔之間沒(méi)有交談(cross-talk)。溶解產(chǎn)物混合物中存在的GW熒光素酶可以使用甲蟲(chóng)D-熒光素進(jìn)行定量(靈敏度為18.52CPS4iL加入的GW熒光素酶溶解產(chǎn)物)(圖18)。檢驗(yàn)靈敏度足以對(duì)以上述方式制備的螢火蟲(chóng)熒光素酶進(jìn)行定量。抓銜為了保證觀察到的生物發(fā)光增強(qiáng)是因?yàn)镚W熒光素酶與D-熒光素的相互作用，進(jìn)行了數(shù)項(xiàng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。第一項(xiàng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單地涉及在與D-熒光素混合之前將GW熒光素酶細(xì)胞溶解產(chǎn)物在95"C下加熱5分鐘。在加入D-熒光素之前加熱含有細(xì)胞溶解產(chǎn)物的GW熒光素酶完全消除了生物發(fā)光的增強(qiáng)(圖19)。第二項(xiàng)對(duì)照是看GW熒光素酶對(duì)ATP/Mg(濃度分別為2mM和4mM)的響應(yīng)。圖20顯示了在同時(shí)加入或不加入D-熒光素的情況下，50fiLGW熒光素酶溶解產(chǎn)物對(duì)加入ATP/Mg的響應(yīng)。ATP或Mg不會(huì)導(dǎo)致生物發(fā)光增強(qiáng)，但存在D-熒光素則會(huì)導(dǎo)致。進(jìn)一步對(duì)照使用不同熒光素酶與D-熒光素以及不同底物與GW熒光素酶進(jìn)行。與非誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物相比，將GW熒光素酶用IPTG誘導(dǎo)的類果蠅(drosophilia-like)熒光素酶替代不會(huì)導(dǎo)致在加入D-熒光素時(shí)生物發(fā)光的任何提高(圖21)。與對(duì)照細(xì)胞溶解產(chǎn)物相比，將D-熒光素用生物發(fā)光最有效的腔腸素(codentarazine)底物(CLZN-hcp(lp/lOOiil))代替不會(huì)導(dǎo)致在加入GW熒光素酶時(shí)生物發(fā)光的任何提高(圖22)。將GW熒光素酶和D-熒光素混合時(shí)觀察到生物發(fā)光提高的反應(yīng)是由于在ATP的存在下涉及這兩種組分的特定相互作用。實(shí)l辦S.'^rac/wocam/aWc/zarciyae生物發(fā)光系統(tǒng)粗提取物的制備該方法自Viviani等人(2002)所述的方法改造。通過(guò)將5個(gè)發(fā)光器官在0.5mL冷提取緩沖液(27mMTricine、7mMMgS04、0.2mMEDTA、10%甘油和1%TritonX-100，pH7,4)中均化，制備菌蚋的粗提取物。均化之后將提取物在4"C下以15,000g離心15分鐘。通過(guò)在98。C下將上清液加熱5分鐘，并加入1mMATP(最終濃度)，制備熱的提取物。通過(guò)將10pL熱的提取物與90pL含有0.84mLTris-HCl緩沖液(pH8)的反應(yīng)緩沖溶液、O.llmL螢火蟲(chóng)(glow-worm或firefly)熒光素酶和0.05mLATP/Mg(40/80mM)混合，測(cè)定熒光素酶活性。粗提取物的制備方法2在第二種方法中，通過(guò)在艾本德(eppendorf)管中向5個(gè)冷凍的光器官中加入100jiL乙酸乙酯，然后在均化后將提取物在15,000g下離心5分鐘，制備粗提取物。將含有光器官的艾本德保持在干冰上，同時(shí)進(jìn)行均化處理。通過(guò)將20pL粗提取物與含有tris-乙酸鹽緩沖液(25mM)、乙酸鎂(4mM)和ATP(2mM)(均為最終濃度)的反應(yīng)緩沖溶液混合，得到100pL的最終體積，進(jìn)行體外生物發(fā)光檢驗(yàn)。G『資遊艨檢驗(yàn)將含有tris-乙酸鹽緩沖液(25mM)、乙酸鎂(4mM)和ATP(2mM)(均為最終濃度)、和GW熒光素酶細(xì)胞溶解產(chǎn)物的反應(yīng)緩沖溶液給出的最終體積為100iaL，將其加入到20粗提取物中。銜凝欲激活絲最初試圖用GW熒光素酶重復(fù)Viviani等人(2002)所述的熱-冷提取物實(shí)驗(yàn)的考察是不成功的。向上述制備的粗提取物樣品中加入GW熒光素酶，不同時(shí)加入ATP，導(dǎo)致生物發(fā)光活性閃光。該作用在進(jìn)一步加入GW熒光素酶以及同時(shí)加入ATP時(shí)是可重復(fù)的。這種類型的閃光是向D-熒光素中加入過(guò)量熒光素酶和ATP時(shí)通常觀察到的閃光類型的特征。發(fā)H譜在D-熒光素的存在下GW熒光素酶活性的陽(yáng)性證明之后，記錄加入D-熒光素時(shí)GW和FF熒光素酶的熒光和生物發(fā)光光譜。溶液的制備。通過(guò)將450pL檢測(cè)緩沖溶液或商業(yè)檢測(cè)試劑(Promega)與50pL所說(shuō)明的相應(yīng)熒光素酶混合，制備0.5mL溶液?；旌显?mL的熒光計(jì)池中進(jìn)行，通過(guò)CaryEclipse熒光熒光計(jì)使用波長(zhǎng)掃描模式記錄光譜。生物發(fā)光光譜在溶液混合之后立即記錄，熒光光譜在加入所示的各個(gè)熒光素酶之前和之后記錄。生物發(fā)光光譜加入D-熒光素時(shí)GW(菌蚋)和FF(螢火蟲(chóng)，尸/zW/m^)熒光素酶的歸一化生物發(fā)光光譜顯示在圖23中。加入GW熒光素酶誘導(dǎo)的最大生物發(fā)光在440和480nm之間。使用GW熒光素酶代替FF熒光素酶導(dǎo)致發(fā)射光譜從555nm藍(lán)移至低于530nm。報(bào)道的FF熒光素酶的最大值在pH7.6下為562nm。光譜的最大強(qiáng)度變化很大，F(xiàn)F和GW熒光素酶分別為90.98任意單位(a.u.)和3.12a,u.。實(shí)施例9:^^&,瀲激#中分/^￥1素艨如Baker(2004)中所綜述，數(shù)年來(lái)，認(rèn)識(shí)了發(fā)光菌蚋的4個(gè)澳大拉西亞物種。這些物種是新西蘭特有的Jrac/wocamp"y/ava、/w抓'"osa。第一對(duì)物種識(shí)別為Campara亞屬，后一對(duì)識(shí)別為菌蚋亞屬。Baker(前面引用的)在她的博士研究中取得了澳大拉西亞發(fā)光雙翅目由至少9個(gè)生物物種代表的有力證據(jù)。除已經(jīng)提到的4個(gè)物種之外，Baker(前面引用的)還描述了5個(gè)新的澳大利亞物種，即^rac^"ocampov4rac/zwoc蘭pag7)/w/awcfe腦j禾口^rac/zwocampaofvra;^肌's。除Arachnocampaspp.禾口北美(9r/e//a/w/to"/(Fulton，1941;Viviani，2002)之外，還有其它雙翅目發(fā)光物種的零星報(bào)道，通常是Keroplatusspp.(例如Sivinski,1998;Baker,2004中所總結(jié))。這些報(bào)道通常證據(jù)不足，并涉及通常不發(fā)現(xiàn)于當(dāng)?shù)刎S產(chǎn)的群聚中(以澳大拉西亞動(dòng)物群為特征)。我們開(kāi)始論證使用AnWzar&"e的序列從其它生物發(fā)光雙翅目和一些容易得到的例如菌蚋的澳大利亞物種分離編碼熒光素酶的序列的可行性，以設(shè)計(jì)PCR引物。方法和結(jié)果對(duì)來(lái)自三種其它的菌蚋物種的An'c/z"n&"e熒光素酶基因的同源物進(jìn)行分離、克隆和測(cè)序。這三個(gè)物種為Campara亞屬的Jrac/wwcflmpa/7ava禾口Jrac/w70ca附;ag/7ra衡e"e"5^，以及Arachnocampa亞屬的v4rac/2woc"mpatosmam'em^。對(duì)于這些物種的每一個(gè)，從其自然棲息地收集2至5個(gè)幼蟲(chóng)樣品，將其在24小時(shí)內(nèi)活著轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。將每個(gè)物種的樣品在磷酸鹽-或tris-緩沖的鹽水下解剖。將切下的連有一些周圍組織的光器官集中并在-8(TC下快速冷凍。A.RNA提取對(duì)于三種樣品的每一個(gè)，使用RNAqueous-Micro試劑盒(Ambion,cat.no.1931)遵照制造商的說(shuō)明書(shū)提取兩種或三種光器官的全RNA。B.cDNA合成1.第一條cDNA的合成使用來(lái)自CreatorSMARTcDNA庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Clontech/BDBiosciences,cat.no.K1053-l)的引物合成單鏈cDNA。反應(yīng)遵照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該試劑盒中提供的逆轉(zhuǎn)錄酶直接用新鮮的PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶(BDBiosciences,cat.no.639500)替換。2.第二條cDNA的合成雙鏈(ds)cDNA通過(guò)長(zhǎng)程PCR使用CreatorSMARTcDNA庫(kù)構(gòu)建試劑盒中提供的引物進(jìn)行。使用2如之前小節(jié)中所述合成的第一條cDNA,遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行25個(gè)擴(kuò)增熱周期。將試劑盒中的DNA聚合酶直接用新鮮的AdvantagecDNA聚合酶混合物(BDBiosciences,cat.no.50595)替換。C.通過(guò)PCR克隆熒光素酶cDNA1.J.y/ava禾口Ag7ra潔ewe服's將A_/7av和Ag/mwee"e"^熒光素酶cDNA的部分從其各自的dscDNA庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)使用HotStarTaqDNA聚合酶(Qiagen，cat.no.203203)進(jìn)行，PCR引物設(shè)計(jì)成與AWc/w^&ae熒光素酶基因互補(bǔ)(表6)。表6:正文和表7中提到的A.richardsae熒光素酶cDNA引物的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>對(duì)于A.flava，測(cè)試了30種引物對(duì)的組合(表7)，遵照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增熱周期。30種引物對(duì)組合中的29個(gè)擴(kuò)增了預(yù)計(jì)大小的唯一產(chǎn)物。將兩種PCR產(chǎn)物(表7)用microCLEANDNACleanup試劑(Astral,cat.no.2MCL-5)提純，并用特異于AWc/z^^ae熒光素酶cDNA序列的引物進(jìn)行測(cè)序。BESTFIT比較顯示，Ay/m^核苷酸序列與之前測(cè)定的An'c/^Wrae熒光素酶的cDNA序列的同一性為96%。這證實(shí)了Ay/ava序列作為An'c/w^s"e熒光素酶同源物的身份。對(duì)于A.girraweenensis，僅僅測(cè)試了4種J.r/c/zara&ae熒光素酶基因特異性引物的組合(表7)，使用與上述小節(jié)相同的PCR條件。所有4種引物對(duì)的組合均擴(kuò)增了預(yù)計(jì)大小的唯一產(chǎn)物。將兩種PCR產(chǎn)物(表7)提純，并用An'c/wra^e熒光素酶cDNA序列特異性引物進(jìn)行測(cè)序。BESTFIT比較顯示，Ag/mwee"e"^核苷酸序列與之前測(cè)定的An'c/zan/^e熒光素酶的cDNA序列的同一性為96.5%。這證實(shí)了Ag^rawee"e"^:s序歹!j作為AWc/z"ra^ae熒光素酶同源物的身份。將A/Java和Ag^rawee"e"^熒光素酶cDNA的5'和3'端單獨(dú)地通過(guò)半錨定PCR擴(kuò)增每個(gè)引物對(duì)包括An'c/za^sae熒光素酶cDNA序列特異性引物，以及與A/av"和AdscDNA的cDNA合成中使用的SMART引物部分互補(bǔ)的第二引物(表8)。使用雙鏈cDNA作為模版，遵照制造商的指示，以Pfx50DNA聚合酶和40個(gè)擴(kuò)增熱周期進(jìn)行遞降(touchdown)PCR反應(yīng)。對(duì)于5'端擴(kuò)增，對(duì)兩種物種測(cè)試了2種引物對(duì)的組合(表9)。對(duì)于Ayava和Agz>rawee"e"^，兩個(gè)引物對(duì)均擴(kuò)增了預(yù)計(jì)大小的唯一產(chǎn)物(表9)。對(duì)于3'端擴(kuò)增，對(duì)兩種物種測(cè)試了2種引物對(duì)的組合(表IO)。對(duì)于A/7av"和Agz>rawee"e"^，兩個(gè)引物對(duì)均擴(kuò)增了預(yù)計(jì)大小的唯一產(chǎn)物(表IO)。對(duì)于兩個(gè)物種，對(duì)來(lái)自每個(gè)3'和5'端擴(kuò)增的一種產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，揭示了熒光素酶cDNA的5'端和3'端的序列。對(duì)于A/7"v"和Ag/mwee"e"^的熒光素酶基因，ORF的前40個(gè)核苷酸和后40個(gè)核苷酸與An'c/w^^e熒光素酶cDNAORF是相同的。A/feva和Ag/mwee"m^熒光素酶基因的完整ORF用Virginia的表達(dá)小節(jié)中所述的兩個(gè)引物pETGWLucF和pETGWLucR通過(guò)遞降PCR而擴(kuò)增。反應(yīng)用單鏈cDNA作為模版和Pfic50DNA聚合酶(Invitrogen，cat.no.12355-012)進(jìn)行，遵照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)1.6kb的擴(kuò)增子在其整個(gè)長(zhǎng)度上測(cè)序。發(fā)現(xiàn)A/7av"和Ag^rawee"e"s^熒光素酶肽序列與來(lái)自An'c/^W^e的熒光素酶基因的同一性分別是99.6%和99.8%。2.Ato扁am'ms/sAtosma"/e"^熒光素酶cDNA的5'和3'端均通過(guò)半錨定PCR直接擴(kuò)增。對(duì)于每一端測(cè)試了數(shù)種引物對(duì)(表11;表12)。使用雙鏈cDNA作為模版，遵照制造商的說(shuō)明書(shū)以P&50DNA聚合酶和40個(gè)擴(kuò)增熱周期進(jìn)行遞降PCR反應(yīng)。對(duì)于5'端的擴(kuò)增，測(cè)試了6個(gè)引物對(duì)的組合。這些擴(kuò)增的唯一產(chǎn)物中的兩個(gè)具有預(yù)計(jì)的大小。將一種產(chǎn)物(表11)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)直接克隆到pJETl/blunt克隆載體(Fermentas,cat.no.K1221)中。為了擴(kuò)增3'端，測(cè)試了2個(gè)引物對(duì)組合。一對(duì)(表12)擴(kuò)增了預(yù)計(jì)大小的單一產(chǎn)物，將其直接克隆到pJETl/bkmt克隆載體中。將來(lái)自兩種克隆產(chǎn)物中的每一種的4個(gè)克隆用pJETl測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。與A.richardsae熒光素酶cDNA的BESTFITDNA序列比較顯示，5'端處的同一性為83%，3，端處的同一性為88%。與A.richardsae熒光素酶基因的BESTFIT肽序列比較顯示，5'端的同一性和3'端的同一性分別為89%和93%。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了兩種PCR擴(kuò)增子都源自An'c/^r^"e熒光素酶cDNA的相似同源物。ORF的開(kāi)始和末端都已經(jīng)得到鑒別。設(shè)計(jì)與Atosm"m'era^熒光素酶ORF的開(kāi)始和末端互補(bǔ)的引物，以擴(kuò)增完整的ORF:A.tasLucORF陽(yáng)F:5'-ATGACTTCTACATCTGTGGA-3';(SEQIDNO:31)A.tasLucORF-R:5-TTACAATGTTGATCTTAAAATAC-3';(SEQIDNO:32)表7:以A^"vadscDNA測(cè)試的An'c/wrafeaecDNA引物的組合<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>N:沒(méi)有預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的產(chǎn)物-:引物組合未測(cè)試*g:引物組合另外用Ag/玎"wee"e/w/"則試，預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的唯一產(chǎn)物#*f,g:測(cè)序的A_/7ava和Ag^rawee"em^產(chǎn)物表8:用于擴(kuò)增熒光素酶cDNA的5'和3'端的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>序列引物的5'端熒光素酶擴(kuò)增測(cè)試的引物組合SMART畫(huà)nFlSMART-nF2GWLucRS1120Y,0.5kb*f，gGWLucRSlOOOY-Y:預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的唯一產(chǎn)物-:引物組合未測(cè)試*f，g:對(duì)于v4.y/m^和ylg^raweewera^，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序表10:Ayav"和Ag/mwee"ms"的3'端熒光素酶擴(kuò)增測(cè)試的引物組CDSIII-RGWL091C5F84Y，0.5kb*f,gGWL091G12F236YY:預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的唯一產(chǎn)物*f,g:對(duì)于Ay/"v"禾卩Ag7'廠ra，e"ms^，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序表11:Ato麵m'e腦^熒光素酶的5'端擴(kuò)增測(cè)試的引物組合SMART-nFlSMART-nF2GWLucRS1120-NGWLucRS濯ONGWLuclEl謹(jǐn)Y，0.4kb*YGWLucRS757NNY:預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的唯一產(chǎn)物N:沒(méi)有預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的產(chǎn)物-:引物組合未測(cè)試*:單一產(chǎn)物克隆并測(cè)序表12:A熒光素酶的3'端擴(kuò)增測(cè)試的引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>Y:預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的單一產(chǎn)物N:沒(méi)有預(yù)計(jì)大小擴(kuò)增的產(chǎn)物*:單一產(chǎn)物克隆并測(cè)序表13:四個(gè)菌蚋物種的氨基酸同一性/相似性的成對(duì)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>使用在先小節(jié)所述的PCR方法，不僅從A^ara和Ag,mwee"冊(cè)&，而且從J.to腸m'冊(cè)j^直接地分離熒光素酶cDNA。由于我們?cè)贑ampara亞屬的物種之間觀察到的高水平序列同源性，使用本文所述的技術(shù)也會(huì)直接地從菌蚋(Campara)gippslandensis、菌蚋(Campara)otwayensis、菌蚋(Campara)tropicus禾卩事實(shí)上任何將來(lái)可能描述的菌蚋屬Campara亞屬的其它物種來(lái)分離熒光素酶。而且我們己經(jīng)論證，使用特異于AWc/2"Wrae的PCR引物，可以無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)而從Atawww'em"分離熒光素酶。因此，我們推論將會(huì)直接地從歸類為菌蚋亞屬的其它物種中發(fā)現(xiàn)同源熒光素酶，這些物種包括菌蚋luminosa和菌蚋buffaloensis以及事實(shí)上任何將來(lái)可能描述的菌蚋屬的其它物種。當(dāng)然，將會(huì)更直接地使用特異于Atosm"m'em/s熒光素酶序列的引物，使用前述的策略和方法從菌蚋亞屬的其它物種中發(fā)現(xiàn)同源熒光素酶。沒(méi)有必要為了分離Aflava、A.girraweenenis或Atasmaniensis的熒光素酶而訴諸于篩選cDNA庫(kù)。但是，前述的文庫(kù)篩選方法將是不僅從菌蚋屬其它成員而且從其它關(guān)系更遠(yuǎn)的發(fā)藍(lán)光的雙翅目(例如Orfeliafultoni或Keroplatusspp.)中發(fā)現(xiàn)同源熒光素酶的可行方式。由于我們能夠容易地從少到兩個(gè)Arachnocampaspp.的光器官中分離編碼同源熒光素酶的序列，我們也確信可以使用所公開(kāi)的方法，從發(fā)藍(lán)光的雙翅目的甚至單一樣品中擴(kuò)增并分離同源熒光素酶，例如從Sivinski(1998)所提到的那些物種中，其中僅僅遇到單個(gè)樣品。實(shí)施例10:貴乂座資i素艨游潘蘑表這..表這載沐、翁主潘應(yīng)、誘導(dǎo)方式繊會(huì)絲用于GWLuc糾的細(xì)菌表達(dá)的交替誘導(dǎo)方式和表達(dá)構(gòu)建物在對(duì)細(xì)菌表達(dá)的GWLuc糾的表達(dá)和亞細(xì)胞分配進(jìn)行優(yōu)化的嘗試中，如以下小節(jié)所述對(duì)誘導(dǎo)方式的如下變量進(jìn)行操縱(i)誘導(dǎo)時(shí)間，(ii)誘導(dǎo)溫度，(iii)IPTG濃度和(iv)大腸桿菌菌株(Derewenda,2004的綜述)。使用的第二個(gè)策略是在GWLuc糾與標(biāo)記，硫氧還原蛋白(Trx;例如pET48b(+)表達(dá)載體)禾BNusA(例如pET50b(+)表達(dá)載體)之間產(chǎn)生N-端融合。已經(jīng)證明這些標(biāo)記對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)和溶解性都具有正面影卩向(Hammarstr6m,Hellgren，vandenBerg,Berglund禾口H3rd，2002的綜述)。另外產(chǎn)生具有GWLuc糾的N-端6His融合構(gòu)建物，以進(jìn)一步論證產(chǎn)生GWLuc#l融合蛋白的能力。選擇His標(biāo)記是因?yàn)樗梢孕薷某墒褂媒饘匐x子螯合色譜進(jìn)行提純。細(xì)菌表達(dá)的GWLuc糾和FFLuc的分配的分析將冷凍的細(xì)菌丸粒用100pl現(xiàn)制的溶解混合物(lx熒光素酶細(xì)胞培養(yǎng)物溶解試劑(CCLR)、1.25mgml-l溶菌酶)溶解。在室溫下孵育IO分鐘后，將溶解產(chǎn)物在室溫下以16，000g離心20分鐘。取出上清液，向其中加入含有50mMDTT的1XNuPAGE⑧月桂基十二烷基硫酸酯樣品緩沖液。丸粒通過(guò)加入含有50mMDTT的1XNuPAGE⑧月桂基十二烷基硫酸酯樣品緩沖液溶解，通過(guò)使細(xì)菌溶解產(chǎn)物穿過(guò)30G針若干次，對(duì)染色體DNA進(jìn)行剪切。上清液和丸粒樣品使用Irwitrogen的NuPAGENovexBis-Tris凝膠系統(tǒng)如上所述進(jìn)行分析。用于天然GWLuc糾的細(xì)菌表達(dá)的交替誘導(dǎo)方式對(duì)在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)的天然P.pymlis和A.richardsae熒光素酶的pETDuet-l構(gòu)建物進(jìn)行交替誘導(dǎo)方式。從如上所述制備的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)物中，將每個(gè)5ml的等分試樣轉(zhuǎn)移至50ml錐形離心管。等分試樣或者不進(jìn)行誘導(dǎo)(添水至0.4mMIPTG的相同體積)，或者通過(guò)加入IPTG至最終濃度為0.1mM、0.2mM或0.4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。將這些培養(yǎng)物在10。C或20。C、150rpm下孵育24、48小時(shí)(10°C和20。C)或120小時(shí)(僅10。C)，其間測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出3或4個(gè)0.25-0.5ml整分試樣，在室溫下以10,000g離心5分鐘。丸粒在-8(TC下存儲(chǔ)用于蛋白質(zhì)分析。如之前對(duì)于DH5a和BL21(DE3)大腸桿菌菌株所述，將天然P.pyralis和A.richardsae的熒光素酶的pETDuet-1構(gòu)建物電穿孔到大腸桿菌的Rosetta-gamiB(DE3)(Novagen)菌株中。如上文對(duì)于BL21(DE3)中的pETDuet-l:GWLuc糾所述，將培養(yǎng)物預(yù)誘導(dǎo)。達(dá)到0.6-1.0的Abs600nm時(shí)，將5ml的各等分試樣轉(zhuǎn)移至50ml的錐形離心管。等分試樣或者不進(jìn)行誘導(dǎo)(添水至0.4mMIPTG的相同體積)，或者通過(guò)加入IPTG至最終濃度為0.2mM或0.4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。將這些培養(yǎng)物在1(TC或20。C、150rpm下孵育4小時(shí)(僅20。C)、24、48小時(shí)(l(TC和20°C)或120小時(shí)(僅1(TC)，其間測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出3或4個(gè)0.25-0.5ml整分試樣，在室溫下以10,000g離心5分鐘。丸粒在8(TC下存儲(chǔ)用于蛋白質(zhì)分析。pETDuet-l中N-端6HisGWLuc#1融合蛋白的構(gòu)建使用PlatinumPfxDNA聚合酶，遵照制造商的推薦使用2ng模板和lOpmol的引物NHis-GWLuc糾(5'-GAgaattcGATTGAGGGACGCATGGCTTGTACTTCAGT陽(yáng)3';SEQIDNO:42)禾卩pETGWLucR(5'-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3';SEQIDNO:16)，對(duì)GWLuc糾的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增20個(gè)周期。這些弓|物在全長(zhǎng)A.richardsae熒光素酶cDNA的5'和3'引入EcoRI和AvrII限制性內(nèi)切位點(diǎn)(小寫字母)。提純的產(chǎn)物如上所述是A尾的，連接到pGEMT-easy中。將構(gòu)建物電穿孔到大腸桿菌DH5a菌株中，并使用CEQ2000DyeTerminatorCycleSequencing用QuickStart試劑盒和50fmol質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將全長(zhǎng)無(wú)錯(cuò)構(gòu)建物用EcoRI(Fermentas)和AvrII切除，并插入到EcoRI/Avrll線性化的pETDuet-1中，產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pETDuet:NHis-GWLuc#l。將這些質(zhì)粒如上所述電穿孔到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中并進(jìn)行測(cè)序。#l和pET-50b(+)AmpR:GWLuc#l.通過(guò)將來(lái)自pTAL-Luc的氨芐青霉素抗性基因插入到每個(gè)載體中存在的Sphl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，使表達(dá)載體pET-48b(+)(TrxN-端標(biāo)記)禾QpET-50b(+)(NusAN-端標(biāo)記)(Novagen,EMDBioscience)具有氨芐青霉素抗性。使用PlatinumPfxDNA聚合酶遵照制造商的推薦，使用2ng模版和lOpmol引物AmpRCasSphIF(5'-TAGCGAAgcatgcGGTCTGACAGTTACCAA-3';SEQIDNO:43)禾卩AmpRCasSphIR(5'-CGTAAGCgcatgcTCTAAATACATTCAAATATG-3';SEQIDNO:44)，將來(lái)自pTAL-Luc的氨芐青霉素抗性基因(負(fù)鏈上bp4148-3218+緊隨基因5'和3'的10bp)擴(kuò)增20個(gè)周期。各個(gè)引物在氨芐青霉素抗性基因的5'和3'端引入Sphl限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(小寫字母)。PCR產(chǎn)物使用microCLEAN提純，用Sphl(NewEnglandBiolabs)消化，并再次使用microCLEAN提純。將Sphl消化的氨芐青霉素抗性基因PCR產(chǎn)物連接到去磷酸化、Sphl線性化的pET-48b(+)或pET-50b(+)中，電穿孔到大腸桿菌DH5a菌株中，并使用CEQ2000DyeTerminatorCycleSequencing用QuickStart試劑盒和25fmol質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。產(chǎn)生的質(zhì)粒分別稱為pET-48b(+)AmpR和pET-50b(+)AmpR。使用PlatinumPfxDNA聚合酶遵照制造商的推薦，使用2ng模版和lOpmol引物GWLuclFHRV3C(5'-gggacccATGGCTTGTACTTCAG-3';SEQIDNO:45)和pETGWLucR(5'-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3';SEQIDNO:16)，將GWLuc#l的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增20個(gè)周期。這些引物在全長(zhǎng)A.richardsae熒光素酶cDNA的5'和3'引入SanDI和AvrII限制性內(nèi)切位點(diǎn)(小寫字母)。提純的產(chǎn)物如上所述是A尾的，連接到pGEMT-easy中。將構(gòu)建物電穿孔到大腸桿菌DH5a菌株中，并使用CEQ2000DyeTerminatorCycleSequencing用QuickStart試劑盒和50fmol質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將全長(zhǎng)無(wú)錯(cuò)構(gòu)建物用SanDI(Stratagene,LaJollaCA)和AvrII切除，并插入到SanDI/Avrll線性化的pET-48b(+)AmpR或pET-50b(+)AmpR中，產(chǎn)生的質(zhì)粒分別稱為pET-48b(+)AmpR:GWLuc#l和pET-50b(+)AmpR:GWLuc#l。將這些質(zhì)粒如上所述電穿孔到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中并進(jìn)行測(cè)序。將每個(gè)表達(dá)載體的無(wú)錯(cuò)構(gòu)建物pET-48b(+)AmpR、pET48b(+)AmpR:GWLuc#l、pET-50b(+)AmpR禾PpET-50b(+)AmpR:GWLuc#l電穿孔到大腸桿菌Rosetta-gamiTMB(DE3)菌株中。pETDuet:NHis-GWLuc#l、pET-48b(+)AmpR:GWLuc#l和pET-50b(+)AmpR:GWLuc#l的誘導(dǎo)方式BL21(DE3)中的pETDuet-l:NHis-GWLuc#l的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)物如上文對(duì)于BL21(DE3)中的pETDuet-l:GWLuc鍆所述。等分試樣(10ml)或者不進(jìn)行誘導(dǎo)(添水至0.4mMIPTG的相同體積)，或者通過(guò)加入IPTG至最終濃度為0.4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。將這些培養(yǎng)物在20。C或37°C、150rpm下孵育，在37X:下孵育1、2、3、5和24小時(shí)，或者在20。C下孵育2、5、24、30和48小時(shí)，其間測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出5個(gè)0.5ml和3個(gè)1.5ml的整分試樣，在室溫下以lO，OOOg離心5分鐘。丸粒在8(TC下存儲(chǔ)用于蛋白質(zhì)分析。Rosetta-gamiB(DE3)中的pET-48b(+)AmpR、pET-48b(+)AmpR:GWLuc#l、pET-50b(+)AmpR和pET-50b(+)AmpR:GWLuc#l的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)物如上文對(duì)于BL21(DE3)中的pETDuet-l:GWLuc弁l所述。達(dá)到0.6-1.0的Abs600nm時(shí)，將來(lái)自每個(gè)預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)物的5ml等分試樣轉(zhuǎn)移至50ml的錐形離心管中。等分試樣或者不進(jìn)行誘導(dǎo)(添水至0.4mMIPTG的相同體積)，或者通過(guò)加入IPTG至最終濃度為0.1mM、0.2mM或0.4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。將這些培養(yǎng)物在l(TC或20°C、150rpm下孵育24或48小時(shí)，其間測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出4或5個(gè)0.20-1.0ml的整分試樣，在室溫下以lO,OOOg離心5分鐘。丸粒在8(TC下存儲(chǔ)用于蛋白質(zhì)分析。以交替誘導(dǎo)方式和表達(dá)構(gòu)建物細(xì)菌表達(dá)的GWLuc#l的生物發(fā)光檢驗(yàn)通過(guò)向20細(xì)胞溶解產(chǎn)物中加入100Promega試劑緩沖液或者向細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣品中加入自制的緩沖液，如上所述進(jìn)行生物發(fā)光檢驗(yàn)。生物發(fā)光用使用快速動(dòng)力學(xué)模式(積分時(shí)間=0.5秒，重復(fù)次數(shù)=100)的Wallacl420Victor2光度計(jì)(Perkin-Elmer)記錄，或者用以生物發(fā)光模式(間隔時(shí)間=0.2秒，PMT增益4095，間隔次數(shù)=200，歸一化時(shí)間=0.5秒)工作的POLARstarOPTIMA(BMG)記錄。結(jié)果兩種天然熒光素酶在一系列誘導(dǎo)方式下進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。早在37°C下的1小時(shí)和20。C下的2小時(shí)，Trx和NusAN-端GWLuc#l融合構(gòu)建物在Rosetta-gamiB(DE3)大腸桿菌菌株中成功表達(dá)，6HisN-端GWLuc#l融合構(gòu)建物在BL21(DE3)中成功表達(dá)。Rosetta-gamiB(DE3)大腸桿菌菌株中的表達(dá)的An'c/arafeae熒光素酶與在交替方式下誘導(dǎo)的pETDuet-l構(gòu)建物進(jìn)行檢驗(yàn)，以測(cè)定加入自制緩沖液時(shí)的生物發(fā)光活性。當(dāng)與從在l(TC或2(TC下孵育24小時(shí)的培養(yǎng)物制備的樣品比較時(shí)，通過(guò)將培養(yǎng)物在2(TC下孵育48小時(shí)產(chǎn)生活性最高的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。如果將在Rosetta-gamiTMB(DE3)大腸桿菌菌株中表達(dá)的AWc/7flr^ae熒光素酶的生物發(fā)光活性與在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)的相比，存在大約2個(gè)因子的增強(qiáng)。必須注意的是，An'c/w^sae熒光素酶在大腸桿菌BL21(DE3)中以比在Rosetta-gamiTMB中高得多的水平表達(dá)，這說(shuō)明表達(dá)的熒光素酶蛋白的特異活性比在Rosetta-gamiTMB系統(tǒng)中高得多。與在本文所述的任何誘導(dǎo)方式下的對(duì)照載體樣品相比較，Rosetta-gamiTMB(DE3)大腸桿菌菌株中表達(dá)的硫氧還原蛋白和NusA.標(biāo)記的A.richardsae熒光素酶沒(méi)有產(chǎn)生任何明顯的生物發(fā)光活性(P=0.05)。對(duì)細(xì)菌表達(dá)的天然P.pyralis(FFLuc)和A.richardsae(GWLuc糾)熒光素酶的亞細(xì)胞分配進(jìn)行測(cè)定?；谀z的蛋白質(zhì)染色，F(xiàn)FLuc主要分配在上清液中，僅有少量保持在粒狀沉淀部分。GWLuc#l的分配大為不同，主要部分分配至粒狀沉淀?；谀z的蛋白質(zhì)染色，沒(méi)有在上清液中觀察到其存在。在無(wú)誘導(dǎo)的方式下，基于蛋白質(zhì)染色，觀察到天然A.richardsae熒光素酶的分配從粒狀沉淀遷移至上清液部分。這一觀察結(jié)果將會(huì)解釋為何在加入D-熒光素時(shí)FFLuc('螢火蟲(chóng)熒光素酶，)的生物發(fā)光測(cè)量靈敏度要遠(yuǎn)大于GWLuc糾。實(shí)施例11:A.richardsae熒光素酶在真核酉良酒酵母(Sacc/zaramycesc"ev/w'ae)中的表達(dá)構(gòu)建用于釀酒酵母中誘導(dǎo)型表達(dá)的pYES2:GWLuc#l將來(lái)自"pET-48b(+)AmpR:GWLuc#l和pET-50b(+)AmpR:GWLuc#l的構(gòu)建"小節(jié)中使用并描述的含有全長(zhǎng)、無(wú)錯(cuò)GWLuc#l的cDNA構(gòu)建物的pGEMT-easy克隆的EcoRI片段切除，并插入到去磷酸化、EcoRI線性化的pYES2(Invitrogen)中。該質(zhì)粒稱為pYES2:GWLuc糾，將其電穿孔到大腸桿菌DH5a菌株中。使用引物T7(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')和pETGWLucR進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR篩選，從而鑒別出方向正確的含有GWLuc射的轉(zhuǎn)化體。使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen)從pYES2和pYES2:GWLuc糾分離質(zhì)粒DNA，使用l昭質(zhì)粒使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Sigma)來(lái)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株S288C(Invitrogen)。通過(guò)在30°C下在補(bǔ)充有2%(w/v)葡萄糖(Sigma)的無(wú)尿嘧啶的酵母合成漏失(Drop-Out)培養(yǎng)基補(bǔ)充物(SCCM-U)(Sigma)上選擇48小時(shí)，選擇用于尿嘧啶原養(yǎng)(prototrophy)的酵母轉(zhuǎn)化體。通過(guò)使用Y-DERTM提取試劑盒(Pierce,RockfordIL)提取質(zhì)粒DNA并使用T7和pETGWLucR重復(fù)上述PCR篩選，再次證實(shí)pYES2:GWLuc糾的存在。pYES2:GWLuc別的誘導(dǎo)將15mlS288C中的pYES2和S288C中的pYES2:GWLuc射的培養(yǎng)物在含有2%(w/v)葡萄糖的SCCM-U中在28"C下以恒定攪動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)夜。測(cè)定每個(gè)過(guò)夜培養(yǎng)物的Abs600nm，以計(jì)算得到5ml中0.5的Abs,nm所需的培養(yǎng)物體積。取出所需體積的每種培養(yǎng)物，在1500g下離心5分鐘，以使細(xì)胞成粒。將成粒的酵母細(xì)胞再次懸浮在5ml非誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有2%(w/v)棉子糖(Sigma)的SCCM-U)或誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有2%(w/v)半乳糖(Sigma)和2%(w/v)棉子糖的SCCM-U)中。將培養(yǎng)物在28。C下以恒定攪動(dòng)孵育24、48和72小時(shí)，孵育結(jié)束時(shí)測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的Abs600nm。從每個(gè)培養(yǎng)物中取出等分試樣(0.1-0.5ml)，在室溫下以10，000g離心5分鐘。粒狀沉淀在8(TC下保存用于蛋白質(zhì)分析。釀酒酵母表達(dá)的GWLuc糾的蛋白質(zhì)分析如所述進(jìn)行，并具有以下修改。由于酵母細(xì)胞壁的存在，將溶解的樣品在10(TC下加熱5分鐘。制備用于熒光素酶檢驗(yàn)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物向細(xì)胞丸粒中加入1X被動(dòng)溶解緩沖液(Promega)，以產(chǎn)生1.446X107的酵母細(xì)胞數(shù)，計(jì)算基于Abs6。。nm1=3X1(^細(xì)胞/ml。在檢驗(yàn)之前即刻加入被動(dòng)溶解緩沖液，混合時(shí)間為大約15-20秒。釀酒酵母中的An'c/^r^"e熒光素酶的生物發(fā)光檢驗(yàn)加入溶解緩沖液之后，將25細(xì)胞溶解產(chǎn)物混合物與75自制的檢驗(yàn)緩沖液混合，如上所述用Wallad420Victor2光度計(jì)(Perkin-Elmer)監(jiān)控光輸出隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果凝膠的蛋白質(zhì)染色顯示載有和不載有GWLuc糾構(gòu)建物的酵母菌株之間沒(méi)有任何差異。但是，pYES2表達(dá)系統(tǒng)不同于pET-大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它不是過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以鑒別An'c/za^fcae熒光素酶蛋白質(zhì)。相反，進(jìn)行熒光素酶檢驗(yàn)，以比較載有GWLuc糾的菌株和不載有的對(duì)照菌株。這是比SDS-PAGE和蛋白質(zhì)染色靈敏得多得篩選活性熒光素酶的存在的方法。生物發(fā)光似乎是短脈沖的活性，如同如果以遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量的D-熒光素/ATP檢驗(yàn)低濃度的任何熒光素酶預(yù)計(jì)的那樣。圖24顯示了在幵始記錄后1.12秒測(cè)量的從在28。C下孵育24、48或72小時(shí)的培養(yǎng)物制備的GWLuc#l或?qū)φ蛰d體的生物發(fā)光強(qiáng)度(CPS0.5s)。從孵育72小時(shí)的培養(yǎng)物制備的細(xì)胞溶解產(chǎn)物達(dá)到的生物發(fā)光活性最大，并且GWLuc糾的活性顯著高于對(duì)照樣品(P=0.05)。這表明GWLuc糾在釀酒酵母中成功表達(dá)，并且也顯示出相當(dāng)大的活性。盡管An'c/z^^ae熒光素酶在大腸桿菌菌株BL21(DE3)或釀酒酵母中表達(dá)時(shí)生物發(fā)光強(qiáng)度(CPS)為類似的量級(jí)(圖24)，在前者中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于后者，表明表達(dá)的熒光素酶的特異活性在釀酒酵母中遠(yuǎn)大于在BL21(DE3)細(xì)菌菌株中。上述說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利均在此并入作為參考。在不偏離本發(fā)明范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。盡管本發(fā)明通過(guò)具體的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，但應(yīng)當(dāng)理解到，所要求保護(hù)的本發(fā)明并不應(yīng)該局限于這些具體實(shí)施方式。事實(shí)上，分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)地對(duì)實(shí)施本發(fā)明的上述方式的各種修改均在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。參考文獻(xiàn)將以下參考文獻(xiàn)，以為本文所述內(nèi)容提供示范性方法或其它細(xì)節(jié)補(bǔ)充的程度，具體結(jié)合到本文中作為參考。美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾l美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾l美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾'美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾美國(guó)專禾l5,484,9565,538,8795,576,1985,595,8965,629,4705,633,1555,656,4665,670,3565,670,3565,674,7315,689,0455,689,0495,739,4095,744,3205,744,3205,750,8705,767,3675,807,5225,837,8326,068,9796,143,5026,171,8096，270，％46,297,0186,342,3456,503,7236,586,1966,602,657美國(guó)專利6,602,658美國(guó)專利6,690,461美國(guó)專利6,927,037美國(guó)專利申請(qǐng)20030166905(2003)Adachi，J.Hasegawa,MMOLPHY:programsformolecularphylogenetics,ver2.3.InstituteofStatisticalMathematics,Tokyo(1996).Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-10(1990)Amann等人，Gene69:301-315(1988)Angers,S.,A.Salahpour等人ProcNatlAcadSciUSA97(7):3684-9(2000).Ausubel等人，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&Sons,(1998).Baker,C.(2004).Australianglow-worms(Diptera:Keroplatidae:Arachnocampaspp.):distribution,diversity,identityandmanagement.Ph.D.Thesis,DepartmentofZoologyandEntomology,UniversityofQueensland,Brisbane:186pp.Baldari等人，EMBOJ.6:229-234(1987).Berger,S.L.禾卩A.R.Kimmeleds.,1987"MethodsinEnzymology:GuidetoMolecularCloningTechniques",AcademicPress.Bowie等人，Science247:1306-1310(1990).Branchini,B.R.，R.A.Magyar等人Biochemistry37(44):15311-9(1998).Branchini,B.R.,R.A.Magyar等人Biochemistry40(8):2410-8(2001).Branchini,B.R.,T.L.Southworth等人Biochemistry42(35):10429-36(2003).Conti等人ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.1996Jull;52(Pt4):876-8.Conti，E.,N.P.Franks等人Structure4(3):287-298(1996).Creighton，T.E.，Proteins—StructureandMolecularProperties,2ndEd.，W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993).Cunningham等人，Science244:1081-1085(1989)Day,J.C,L,C.Tisi等人，Luminescence19(1):8-20(2004).deVos等人Science255:306-312(1992).deWet,J.R.，K.V.Wood等人MolecularandCellularBiology7(2):725-37(1987).Derewenda,Z.S.(2004)Methods34:354-363.Devereux，J.等人，NucleicAcidsRes.12(1):387(1984)ElionE.A.(2003)Unit3.17-ConstructingrecombinantDNAmoleculesbythepolymerasechainreaction.InAusubelF.M.，BrentR.，KingstonR.E.,MooreD.D.,SeidmanJ.G"SmithJ.A.andStmhlK.(Eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons,Inc.,USA.Felsenstein，J.Cladistics5:164-166，1989Flanagan,W.M.等人(1991)J.Virology:65，769-786Fulton,B.B.AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica34:289-302(1941).Gottesman,S.，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128).Gribskov,M.禾卩Devereux,J.,eds.,SequenceAnalysisPrimer,MStocktonPress,NewYork,1991Griffin,A.M.禾QGriffm，H.G.,eds.，ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,HumanaPress,NewJersey,1994Hammarstr6mM.等人.(2002)ProteinScience11:313-321.Harlow,Antibodies,ColdSpringHarborPress,(1989)Harrison,R.A.PacificInsects8(4):877-833(1966).Houghten等人，Nature354:84-86(1991)Jain，V.K.禾口Magrath,I.T.，BioTechniques:12，681-683(1992)Kaufman等人，EMBOJ.6:187-195(1987)Keown等人(1990)，Meth.Enzymol.185:527-537.Kozak,M.,Cell44(2):283-92(1986).Kozak,M.,NucleicAcidsRes15(20):8125-48(1987).Krause,M.H.和S.A.Aaronson,MethodsinEnzymology,200:546-556(1991)Kujan等人，Cell30:933-943(1982)Lam等人，Nature354:82-84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14所述的方法，其中所述第二報(bào)道酶催化發(fā)光反應(yīng)，所述發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生最大發(fā)射強(qiáng)度在大于530nm的波長(zhǎng)處的發(fā)射光譜。19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述測(cè)定在同一樣品等分試樣上進(jìn)行。20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中多項(xiàng)測(cè)定同時(shí)進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了菌蚋(Arachnocampa)(雙翅目)基因組內(nèi)的基因編碼的熒光素酶肽的核苷酸和氨基酸序列。具體地，本發(fā)明提供了催化發(fā)射光譜在波譜藍(lán)光部分內(nèi)的發(fā)光反應(yīng)的功能性、依賴ATP的熒光素酶。本發(fā)明具體地提供分離的肽和核酸分子，鑒別酶肽的直向同源物和活性子序列的方法，以及鑒別熒光素酶肽的調(diào)節(jié)物和底物的方法。本發(fā)明提供了多種檢驗(yàn)方法，其包括使用至少兩種依賴ATP的熒光素酶的多報(bào)道基因檢驗(yàn)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101283090SQ200680037415公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年8月18日優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日發(fā)明者H·戴克斯,M·M·杜曼西克,S·C·特洛維爾,V·利奇申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織