大麗輪枝菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶靶基因片段及其干擾載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大麗輪枝菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靴基因片段^及該靴基因 片段所轉(zhuǎn)錄的RNA，還涉及含有所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靴基因片段的干擾載 體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述大麗輪枝菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靴基因片段或干擾 載體在提高植物對(duì)大麗輪枝菌抗病性中的應(yīng)用，屬于大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因的克隆及應(yīng) 用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae)，是一種上傳性病原真菌，可1^危害多種 經(jīng)濟(jì)作物、果樹(shù)和觀賞花弁，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（化adinEF，ThommaBP.Physiology andmolecularaspectsofVerticilliumwiltdiseasescausedbyV.dahliaeand V.albo-atrum.Molecularplantpathology2006,7:71-86.PangJ,ZhuY,LiQ,et al.DevelopmentofAgrobacterium-mediatedvirus-inducedgenesilencingand performanceevaluationoffourmarkergenesinGossypiumbarbadense.PLoSOne 2013, 8:e73211.)。病原菌由植物根部的傷口侵入，并在維管束系統(tǒng)內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致植 物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，葉片枯萎甚至死亡（TsrorLLevinAG.VegetativecompatiLbility andpathogenicityofVerticilliumdahliaeKleb.isolatesfromOliveinIsrael. JournalofPh^opathology2003,151:451-455·)。由于病原菌在上壤內(nèi)存活能力很強(qiáng)， 周期非常長(zhǎng)，并且主要存在于寄主的維管束系統(tǒng)內(nèi)，因此針對(duì)此現(xiàn)狀，采取^預(yù)防為主，綜 合治理的方式。植株一旦發(fā)病，目前在大田中還沒(méi)有非常有效的防治措施和藥劑。
[0003] 眾所周知，如果沒(méi)有生物體內(nèi)復(fù)雜的蛋白修飾及加工系統(tǒng)，蛋白不會(huì)發(fā)揮應(yīng) 有的生物學(xué)功能。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上進(jìn)行的糖蛋白的組裝過(guò)程中，寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催 化核屯、的寡糖基因連接到新合成的多版上。此外，對(duì)于真核生物體來(lái)說(shuō)，蛋白完全丟 失N端的糖基化修飾那是非常致命的（HeleniusA，AebiM.Intracellularfunctions ofN-linkedglycans.Science2001, 291:2364-2369.SilbersteinS,Gilmore 民.Biochemistry,molecularbiology,andgeneticsoftheoligosaccharyl transferase.FA沈BJournal1996, 10:849-858.)D除了負(fù)責(zé)糖基化蛋白的生成，寡糖基 轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體還在分泌蛋白調(diào)節(jié)過(guò)程中作為重要的"開(kāi)關(guān)"元件化empski肥，Imperiali B.Oligos過(guò)cch過(guò)ryltr過(guò)nsfer過(guò)se:gatekeepertothesecretoryp過(guò)thw過(guò)y.Current OpinioninQiemicalBiology2002,6:844-850·)。最近，釀酒酵母的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合 體的9個(gè)亞基被全部鑒定出來(lái)，其中包括STT3亞基。其中的任何一個(gè)亞基的突變，將會(huì) 造成復(fù)合體功會(huì)b的喪失（Κη過(guò)uer民，LehleL.Theoligos過(guò)cch過(guò)ryltr過(guò)nsfer過(guò)secomplex fromyeast.BiochimicaBiophysicaActa1999,1426:259-273·)。STT3 亞基的突變， 將會(huì)影響復(fù)合體對(duì)底物的特異性識(shí)別（ZuffereyR，KnauerR，BurdaP，etal.STT3，a highlyconservedproteinrequiredforyesstoligos過(guò)cch過(guò)ryltr過(guò)nsfer過(guò)se activityinvivo.EMBOJournal1995,14:4949-4960·)。位于內(nèi)膜系統(tǒng)STT3a亞基的突 變，可^提高擬南芥對(duì)于NaCl和滲透壓的敏感度化oiwa H，Li F，McCully MG，et βΙ.?ιθ STT3a subunit isoform of the Arabidopsis oligosaccharyltransferase controls adaptive responses to salt/osmotic stress. Plant Cell 2003, 15:2273-2284·)。擬 南芥STT3a突變后，會(huì)減少受體類激酶表達(dá)量的減少，從而使植物的免疫力下降（Saijo Υ,Tintor N, Lu X，et al.民eceptor quality control in the endoplasmic reticulum for plant innate immunity. EMBO Journal 2009,28:3439-3449·)。釀酒酵母的STT3 突變后，可W影響蛋白持的N-糖基化進(jìn)程，進(jìn)而影響細(xì)胞壁的合成（化avan Μ, Suzuki Τ,民ekowicz Μ, et al. Genetic, biochemical, and morphological evidence for the involvement of N-glycosylation in biosynthesis of the cell wall betal, 6-glucan of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of fhe United States of America 2003,100:15381-15386. )D
[0004]W前對(duì)于寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基的研究，主要集中于酶學(xué)方面的基本性 質(zhì)（如酶在新合在蛋白質(zhì)的加工、細(xì)胞壁合在^及信號(hào)傳導(dǎo)中的作用等），在真菌中的研究 較少，尤其是其與致病性之間的關(guān)系。因此，W大麗輪枝菌的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞 基作為祀基因，研究其與病原菌致病力之間的關(guān)系，篩選得到與抗大麗輪枝菌相關(guān)的寡糖 基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基祀基因片段，對(duì)于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性將具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的之一是提供大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合 體STT3亞基祀基因片段W及所轉(zhuǎn)錄的RNA;
[0006] 本發(fā)明所目的之二是提供含有所述大麗輪枝菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基祀 基因片段的RNA干擾載體和宿主細(xì)胞；
[0007] 本發(fā)明目的之Ξ是將所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基祀基因片段或其轉(zhuǎn)錄的 RNA應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性或構(gòu)建獲得抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品 種。
[000引為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明首先公開(kāi)了大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體 STT3亞基祀基因片段，其核巧酸序列分別為沈QIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQ IDNo.4或SEQIDNo.5所示；優(yōu)選的，所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基祀基因片段的 核巧酸序列為SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；最優(yōu)選的，所述寡糖基轉(zhuǎn)移 酶復(fù)合體STT3亞基祀基因片段的核巧酸序列為SEQIDNo.4所示。
[0010] 本發(fā)明采用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)化ost-in化ced gene silencing)，W高致 病力的大麗輪枝菌株V991為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)大麗輪枝菌STT3編碼序列信息（其核巧酸序 列為SEQ IDNo.6所示），設(shè)計(jì)5對(duì)引物，克隆獲得針對(duì)祀基因的5個(gè)不同區(qū)段，其核巧酸序 列分別為SEQ IDNo.1-5所示。本發(fā)明進(jìn)一步將克隆獲得的大麗輪枝菌基因的5個(gè)祀標(biāo)片 段分別構(gòu)建至TRV2載體中，成為VIGS系列RNAi載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用于本氏煙草的注射， 從注射VIGS干擾載體后的第7天進(jìn)行大麗輪枝菌接種。病情指數(shù)分析結(jié)果表明，與空載