082] 1.2本氏煙草的轉(zhuǎn)化
[0083] 取生長(zhǎng)在MS基本培養(yǎng)基上的本氏煙草葉片，除去邊緣和主要葉脈，切成 0. 4X0. 6cm大小的小段，放入0D600為0. 1-0. 2的含有陽(yáng)性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌液中 浸泡5min，用無(wú)菌濾紙吸干植物材料表面的菌液。然后將小葉片置于鋪有一層濾紙的煙草 芽分化培養(yǎng)基（MS+NAA0. 2mg/L+6-BA2mg/L)上進(jìn)行培養(yǎng)，25°C暗室內(nèi)培養(yǎng)3天。將經(jīng)過(guò) 共培養(yǎng)的煙草外植體轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基（MS+NAA0. 2mg/L+6-BA2mg/ L+KanlOOmg/L+Carb500mg/L)中進(jìn)行培養(yǎng)，光照周期為1化光照/化黑暗。2-3周后待 抗性芽生長(zhǎng)至l-2cm高時(shí)，用無(wú)菌手術(shù)刀切下小芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+KanlOOmg/L+Carb 500mg/L)中誘導(dǎo)生根，1~2周后就會(huì)有不定根形成。然后提取轉(zhuǎn)基因植物DM,并進(jìn)行PCR 檢測(cè)（表4)，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
[0084] 表4、檢測(cè)引物信息
[0085]
[0086] 1. 3真菌生物量檢測(cè)
[0087] 為了比較轉(zhuǎn)基因本氏煙草與野生型本氏煙草中病原菌的生物量變化，本發(fā)明利用 qRT-PCR測(cè)定不同植物基因型根部大麗輪枝菌的生物量。提取接菌12天本氏煙草根部總 DNA，W大麗輪枝菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS為祀標(biāo)片段，同時(shí)W本氏煙草的持家基因actin為 持家片段，進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定（表5)。
[0088] qRT-PCR反應(yīng)在AB口500上反應(yīng)完成，結(jié)果采用2& 法進(jìn)行結(jié)果分析。引物的 單峰性W及擴(kuò)增效率滿足實(shí)驗(yàn)要求。
[0089] 表5巧光定量引物信息
[0090]
[0091] 1. 4祀基因的表達(dá)量分析
[0092] 為了確定本氏煙草抗性的提高與祀基因的下降存在一定的關(guān)系，本發(fā)明利用 qRT-PCR進(jìn)一步測(cè)定本氏煙草中祀基因的轉(zhuǎn)錄水平。提取接菌12天本氏煙草根中總RNA， 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄分析。W病原中STT3基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物作為目的片段（表6)，同時(shí)W 病原菌actin作為持家片段，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)定量測(cè)定。
[0093] qRT-PCR反應(yīng)在AB口500上反應(yīng)完成，結(jié)果采用2& 法進(jìn)行結(jié)果分析。引物的 單峰性W及擴(kuò)增效率滿足實(shí)驗(yàn)要求。
[0094] 表6巧光定量引物信息
[0095]
[009引 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0097] 2. 1轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0098] 通過(guò)VIGS篩選的方法，獲得了可W提高植物對(duì)病原菌抗性的祀標(biāo)區(qū)段。為了進(jìn)一 步驗(yàn)證寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基與病原菌致病性之間的關(guān)系，W及干擾后能顯著降 低病原菌致病力的區(qū)段，并獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因本氏煙草，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)祀基因的 引物，引物兩端帶有BP位點(diǎn)，通過(guò)擴(kuò)增獲得了目的基因片段。從電泳圖5中可W發(fā)現(xiàn)明亮 的目的條帶。通過(guò)進(jìn)一步的DNA測(cè)序、比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，序列與祀標(biāo)序列完全一致。
[0099] 通過(guò)BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，將克隆獲得的3個(gè)寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基祀標(biāo)片 段連接到Gateway干擾載體地7GWIWG2 (I)，0上（圖6)，形成含有真菌祀基因的植物轉(zhuǎn)化載 體。
[0100] 為了獲得能夠穩(wěn)定遺傳針對(duì)病原菌祀基因STT3的dsRNA，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)及組織 培養(yǎng)的方法，將構(gòu)建好的Gateway干擾載體轉(zhuǎn)化至本氏煙草，最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草（圖7、8、 9)。
[0101] 2. 2轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性分析
[0102] 對(duì)獲得的含有寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基不同區(qū)段dsRNA的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草， 進(jìn)行大麗輪枝菌接種。然后從接種后第10天、第11天和第12天進(jìn)行病情指數(shù)分析。從圖 10可W看出，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌的抗性明顯提高，病情指數(shù)下降約55-80%。
[0103] 提取轉(zhuǎn)基因煙草根部DNA，利用qRT-PCR進(jìn)行真菌生物量分析。從圖11可W看出， 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性煙草的真菌生物量明顯降低，僅為野生型的30-50%。
[0104] 病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)W及真菌生物量分析，可W明顯觀察到RNAi-4組轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病 原菌具有更強(qiáng)的抗性。
[0105] 2. 3祀基因的表達(dá)量分析
[0106] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證植物病情指數(shù)降低與祀基因表達(dá)之間的關(guān)系，通過(guò)對(duì)植物根部病 原菌祀基因的表達(dá)量分析，可W觀察到與野生型植物相比，轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)祀基因表達(dá)量 下降了約30-50% (圖12)。運(yùn)說(shuō)明STT3基因的區(qū)段4 (核巧酸序列為SEQIDNo. 4所示） 作為祀標(biāo)片段設(shè)計(jì)dsRNA，可W達(dá)到最佳的干擾效果，從而可W有效降低病原菌的致病力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae)寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段， 其特征在于：其核苷酸序列為SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4 或 SEQIDNo. 5所示；優(yōu)選的，其核苷酸序列為SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 4或SEQIDNo. 5所 不。2. 由權(quán)利要求1所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段所轉(zhuǎn)錄的RNA。3. 含有權(quán)利要求1所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段的RNA干擾載體； 優(yōu)選的，所述RNA干擾載體是Gateway干擾載體。4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求3所述RNA干擾載體的方法，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1所 述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段插入到Gateway干擾載體，即得； 優(yōu)選的，通過(guò)BP反應(yīng)，將權(quán)利要求1所述的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段 連接至PD0NR207中，再通過(guò)LR反應(yīng)，將其構(gòu)建至pK7GWIWG2 (I)，0中，得到Gateway干擾載 體。5. 權(quán)利要求1所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段或權(quán)利要求2所述的RNA 在提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性中的應(yīng)用。6. 按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：（1)構(gòu)建含有權(quán)利要求1 所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段的RNA干擾載體；（2)將所構(gòu)建的RNA干擾 載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。7. 權(quán)利要求3所述RNA干擾載體在提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性中的應(yīng)用。8. 按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：（1)將權(quán)利要求3所述 RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（2)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基因 植物。9. 一種培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段的RNA干擾載體； (2) 將所構(gòu)建的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性 提尚的轉(zhuǎn)基因植物新品種。10. 按照權(quán)利要求5或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括：大麗輪枝菌的寄主 植物；優(yōu)選的，所述植物包括：棉花、煙草、番茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、黃瓜或花生中的任意 一種或多種。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了大麗輪枝菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段及其干擾載體和應(yīng)用，屬于大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因的克隆及應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明采用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)篩選寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基基因中能明顯降低病情指數(shù)的靶基因片段，進(jìn)一步構(gòu)建Gateway干擾載體，獲得對(duì)病原菌抗性明顯提高的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因煙草。通過(guò)病情指數(shù)、真菌生物量分析和靶基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，最終篩選得抗大麗輪枝菌效果最佳的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因干擾區(qū)段。本發(fā)明大麗輪枝菌相關(guān)的寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體STT3亞基靶基因片段及RNA干擾載體能應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病能力以及培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
【IPC分類】C12N15/31, A01H5/00, C12N15/63, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105255909
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510792533
【發(fā)明人】蘇曉峰, 齊希梁, 程紅梅, 郭惠明
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月17日