環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多環(huán)芳烴檢測(cè)中的應(yīng)用
【專利摘要】環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多環(huán)芳烴檢測(cè)中的應(yīng)用，涉及多環(huán)芳烴檢測(cè)。菌株Cycloclasticus sp.P1保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.12328。環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的DNA序列，具有如SEQ ID NO.1所示的堿基序列。環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的多環(huán)芳烴結(jié)合域序列如SEQ ID NO.3所示。用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體，含有環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的DNA序列。包含所述用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體的宿主細(xì)胞及其表達(dá)純化環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶。所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因可在多環(huán)芳烴檢測(cè)中應(yīng)用。CGMCC No.1232820160401
【專利說明】
環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多環(huán)芳烴檢測(cè)中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及多環(huán)芳烴檢測(cè)，具體是涉及一種環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多 環(huán)芳烴檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 有機(jī)污染物多環(huán)芳烴，是指至少兩個(gè)苯環(huán)以稠環(huán)形式相連的一類化合物，主要是 由于煤、石油、氣體、垃圾及其他有機(jī)物不完全燃燒而形成的，通常存在于焦油、煉油、潤(rùn)滑 油、防銹油、橡膠、塑料等石化產(chǎn)品中。隨著我國(guó)工業(yè)化程度的不斷提高，日常生產(chǎn)中大量地 使用石油、煤、天然氣等資源，海上石油開采、輪船運(yùn)輸、海損溢油、工業(yè)、生活污水排放，使 得多環(huán)芳烴的污染日益嚴(yán)重。多環(huán)芳烴脂溶性高，不易降解且易在生物體內(nèi)積累，具有致 癌、致畸和致突變的作用，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有巨大的潛在危害，是全球關(guān)注的一類 環(huán)境污染物。
[0003] 在美國(guó)環(huán)保局提出的129種"優(yōu)先污染物"中，多環(huán)芳烴類化合物有16種；1990年我 國(guó)提出的水中優(yōu)先控制的68種污染物中，多環(huán)芳烴類化合物有7種;2005年歐盟發(fā)布的《關(guān) 于多環(huán)芳香烴的指令》限制包含苯并花(Bap)在內(nèi)的16種PAHs的使用。因此，有機(jī)污染物多 環(huán)芳烴檢測(cè)關(guān)系著環(huán)保、食品安全、衛(wèi)生、化工生產(chǎn)、貿(mào)易競(jìng)爭(zhēng)、外交等諸多方面。
[0004] 目前，針對(duì)環(huán)境及食品中的主流檢測(cè)方法為高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜一 質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)。近年來，有機(jī)污染物多環(huán)芳烴檢測(cè)也有了新的進(jìn)展，出現(xiàn)了新的方法， 這些方法包括毛細(xì)管電泳分析法、熒光法、免疫檢測(cè)法以及表面增強(qiáng)拉曼散色光譜檢測(cè)法。 然而，盡管上述這些方法在準(zhǔn)確度和精密度雖然符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求，但在方法快速、靈 敏、簡(jiǎn)單等方面的要求還存在著較大的差距。未來，隨著生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等學(xué)科的發(fā) 展，會(huì)有更多高效、便捷、快速的方法應(yīng)用到PAHs檢測(cè)中。
[0005] 環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)是新近發(fā)現(xiàn)的在細(xì)菌中普遍存在的 第二信使分子，參與調(diào)節(jié)多種生理功能，包括細(xì)胞分化、從運(yùn)動(dòng)狀態(tài)到生物被膜狀態(tài)的轉(zhuǎn) 變、致病因子產(chǎn)生等。細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的產(chǎn)生受二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase， DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)降解兩條途徑調(diào)控。在結(jié)構(gòu)上，通常DGC 含有保守的GGDEF結(jié)構(gòu)域，PDE含有保守的EAL結(jié)構(gòu)域。二者既可以直接作為跨膜蛋白感受外 界信號(hào)的變化，又能傳遞由信號(hào)傳感器如REC、PAS和GAF等結(jié)構(gòu)域傳來的信號(hào)。接收信號(hào)后， DGC或PDE自身被激活，引起細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平發(fā)生變化，開啟或關(guān)閉相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和 翻譯。因此，尋找到能夠感應(yīng)到外界環(huán)境PAHs的存在和濃度變化的DGC傳感器，接收信號(hào)后， DGC自身被激活，合成c-di-GMP。
[0006] 目前尚沒有任何感應(yīng)PAHs的DGC的公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的是提供菌株Cycloclasticus sp.Pl。
[0008] 本發(fā)明的第二目的是提供環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶。
[0009] 本發(fā)明的第三目的是提供環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的編碼基因。
[0010] 本發(fā)明的第四目的是提供環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多環(huán)芳烴檢測(cè)中的 應(yīng)用。
[0011 ] 所述菌株Cycloclasticus sp.Pl已于2016年04月01日保藏于中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所，郵編：100101，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC No. 12328。
[0012] 所述菌株Cycloclasticus sp.Pl是從西太平洋深海沉積物中富集分離得到的一 株能利用芘為唯一碳源降解菌，也是第一株從深海環(huán)境中獲得的解環(huán)菌。它能降解萘、2-甲 基萘、2,6_二甲基萘、苊、菲、蒽、芴、氧芴、硫芴、芘、聯(lián)苯等多環(huán)芳烴;對(duì)PAHs降解范圍廣泛， 并且可以以芘為唯一碳源生長(zhǎng)，使得該菌區(qū)別于該屬的其他菌。
[0013] 所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的DNA序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列。
[0014]所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015] 所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的多環(huán)芳烴結(jié)合域序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016] 本發(fā)明提供用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體，含有環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的 DNA序列。所述用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體可為融合型表達(dá)載體，優(yōu)選pET28a。
[0017] 本發(fā)明提供包含所述用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體的宿主細(xì)胞及其表 達(dá)純化環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶;所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌。
[0018] 所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因可在多環(huán)芳烴檢測(cè)中應(yīng)用。
[0019]所述多環(huán)芳烴類化合物包括但不限于萘、菲、熒蒽、芘、屈、苯并[α]芘等烴類化合 物。
[0020] 本發(fā)明所提供的環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶氨基酸序列分析表明，序列的Ν端區(qū)域?yàn)楦惺?外界信號(hào)的傳感器PAS;傳感器PAS能感應(yīng)環(huán)境中的萘、菲、熒蒽、芘、屈、苯并[α]芘等芳烴類 化合物；當(dāng)該環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶?jìng)鞲衅鱌AS感應(yīng)上述芳烴類化合物后，環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶自 身被激活，合成c-di-GMP。
[0021] 本發(fā)明為開發(fā)應(yīng)用于環(huán)境PAHs的監(jiān)測(cè)的生物傳感器提供了相關(guān)酶與基因及監(jiān)測(cè) 方法。
[0022] 本發(fā)明提供的用于編碼環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO. 1所示 的堿基序列。此外，本發(fā)明還提供了該DNA序列編碼的環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶以及其在多環(huán)芳烴 檢測(cè)的應(yīng)用。該酶能夠感應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)及體外環(huán)境中多環(huán)芳烴類化合物激活環(huán)化酶活性產(chǎn)生 環(huán)二鳥苷酸，在多環(huán)芳烴的環(huán)境檢測(cè)的生物傳感器的開發(fā)方面具有一定研究?jī)r(jià)值。
【附圖說明】
[0023]圖1為等溫滴定量熱法（ITC)確定DGC的結(jié)合特性。
[0024]圖2為等溫滴定量熱法（ITC)確定PAHs的結(jié)合特性。
[0025]在圖1和2中，展示萘和芘分別與DGC蛋白結(jié)合的ITC數(shù)據(jù);上圖顯示滴定的原始數(shù) 據(jù);較低的面板顯示滴定數(shù)據(jù)的集成和稀釋校正峰面積；"Molar Ratio"表示配體（多環(huán)芳 烴)/DGC的摩爾比。
[0026]圖3為P1菌DGC在不同濃度的PAHs的誘導(dǎo)下環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶活性的檢測(cè)(PAHs檢 測(cè)范圍0~500μΜ)。
[0027] 圖4為P1菌DGC在不同濃度的PAHs的誘導(dǎo)下環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶活性的檢測(cè)(PAHs檢 測(cè)范圍0~40μΜ)。
[0028] 在圖3和4中，Nap:萘;Phe:菲;Flu:熒蒽;Pyr:芘;Chr:屈;Bap:苯并[α]芘;CK:沒有 任何PAHs。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0030] 除非另外指明，以下各實(shí)施例中所使用的生物材料、載體、菌株、試劑、試劑盒等均 可通過常規(guī)商購(gòu)?fù)緩将@得，其中涉及的生物基因工程操作技術(shù)，如質(zhì)粒提取、酶切消化、片 段回收、核酸片段與質(zhì)粒載體連接反應(yīng)及克隆和篩選等，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)操作或參照 相應(yīng)產(chǎn)品的說明書進(jìn)行操作。
[0031] 實(shí)施例1解環(huán)菌Cycloclasticus sp.Pl環(huán)二鳥苷酸環(huán)化基因 DGC的克隆
[0032] 1.基因組的提取：
[0033] 解環(huán)菌(Cycloclasticus sp. )P1接種于30mL培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成（g.L-4如下：氯 化鈉 30g/L，硝酸銨lg/L，KC1 0 · 35g/L，磷酸二氫鉀lg/L，磷酸氫二鉀lg/L，溴化鉀0 · 08g/L， 氯化鈣0.05g/L，六水合氯化鍶24mg/L，七水合硫酸鋅1 X 10_4g/L，七水合硫酸鎂3.5g/L，氯 化鐵0.0 lg/L，丙酮酸鈉 3g/L，檸檬酸鈉 3g/L，酵母膏0.5g/L，胰蛋白胨lg/L，加 DDW至1L，調(diào) pH 8.0。121°(：高壓蒸汽滅菌20min。）中，30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用細(xì)菌基因組DNA提取 試劑盒(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取基因組。
[0034] 2、擴(kuò)增DGC全長(zhǎng)序列：
[0035] 根據(jù)解環(huán)菌Cycloclasticus sp.Pl基因組已有的DGC全長(zhǎng)DNA序列信息，在引物的 5'端和3'端分別引入BamHI和Sea頂每切位點(diǎn)(見橫線部分），引物序列如下：
[0036] DGCf:5'-GAG AGG ATC CATGTTAAACA AAGATCAGCT-3'；
[0037] DGCr:5 '-TCT CGA GCT CTTAATAAATTCGATTTCTGCCT-3'。
[0038] PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系： DNA 模板（~50ng) 1 μΕ 正向引物(10 μΜ) 1 μι 反向引物(10 μΜ) lpL Taq DNA聚合酶 1?
[0039] dNTP(10 mM ) 1 μL lOxPCR緩沖液 5pL 25 mM Mg02 4 μL DDW 補(bǔ)足 5(HiL。
[0040] PCR條件如下：
[0041 ] 94°C變性5min;按如下參數(shù)循環(huán)30次:94°C變性lmin 52°C退火30s，72°C延伸30s; 最后72°C延伸lOmin。
[0042]凝膠電泳分離純化約1338bp的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收。將回收產(chǎn)物連接到PMD18T- simple，構(gòu)建PMD18T-DGC重組質(zhì)粒。
[0043] 3. DGC基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0044] 采用BamHI和SacI雙酶切PMD18T-DGC重組質(zhì)粒和幾種不同質(zhì)粒(包括pET28a質(zhì)粒、 pET15b質(zhì)粒、pET22b質(zhì)粒等），并連接酶切產(chǎn)物，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，質(zhì)粒 pET28a明顯優(yōu)于其他質(zhì)粒。
[0045] 實(shí)施例2表達(dá)解環(huán)菌DGC基因的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建、篩選及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)
[0046] 1.采用該重組質(zhì)粒pET28a_DGC轉(zhuǎn)化不同的宿主(包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和 畢赤酵母等），結(jié)果顯示，大腸桿菌明顯優(yōu)于其他宿主。
[0047] 2.采用該重組質(zhì)粒pET28a-DGC轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取單菌落，接種到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C，220rpm下培養(yǎng)8~12h。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切篩選 獲得含有DGC基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)過測(cè)序確認(rèn)重組質(zhì)粒的閱讀框正確。
[0048] 3.將獲得的重組質(zhì)粒通過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，具體操作如下：取lyL重組質(zhì)粒，加 入到100yL大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞液中，冰上放置30min后，42°C熱擊90s，立即取出放 冰上2min，加入900yLLB液體培養(yǎng)基，37°C，220rpm下培養(yǎng)lh后，取150yL培養(yǎng)液涂布含有氯 霉素和卡拉霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h后所得的單菌落即為重組菌。提取質(zhì)粒，以 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0049] 4.挑取上述中篩選出的重組菌大腸桿菌(pET28a-DGC)及含有pET28a空質(zhì)粒的對(duì) 照菌大腸桿菌至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng) 過夜。
[0050] 按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37°(：，220印111培養(yǎng)至00600約為0.6時(shí)，加 入 IPTG 至終濃度 0.8111]\1，30°(：，220鄺111，誘導(dǎo)表達(dá)711后，8000印111，4°(：離心5111丨11，菌泥用200111]\1 Tris-HCl(pH8.0)重懸，超聲破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間歇4s，共3min)，6500rpm，4°C離 心5min，測(cè)定上清液的酶活。
[0051 ] 實(shí)施例3純化重組蛋白
[0052] 1.在注射器中注滿去離子水，拔掉預(yù)裝柱塞子，與注射器連接，往預(yù)裝柱中逐滴加 入去離子水避免空氣進(jìn)入。
[0053] 2.除去預(yù)裝柱密封端。用5mL去離子水清洗柱子。
[0054] 3.在柱中加入0.5mL 0.1M NiS〇4。
[0055] 4.再用5mL去離子水清洗。
[0056] 5.加入5倍體積連接緩沖液后，再加入5倍體積洗脫緩沖液。
[0057] 6.柱子準(zhǔn)備好后，用5~10倍體積的連接緩沖液平衡。
[0058] 7.用新注射器注入樣品。
[0059] 8.用5~10倍體積的連接緩沖液沖洗。
[0060] 9.用2~5倍體積洗脫緩沖液洗脫。
[0061 ] 10.將Hi Trap與裝柱接于FPLC上。
[0062] 11.將上述裂解液上柱。
[0063] 12.用4mL連接緩沖液沖洗柱子，兩次，分別收集。
[0064] 13.用0.5mL洗脫緩沖液洗脫，四次，分別收集。
[0065] 14 · SDS-PAGE分析收集組分。
[0066] 實(shí)施例4環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的多環(huán)芳烴結(jié)合特性
[0067] 使用溫滴定量熱法測(cè)試上述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶DGC與多環(huán)芳烴結(jié)合能力。
[0068] 1.測(cè)量是使用等溫滴定量熱儀NANO ITC 2G，該反應(yīng)在20°C下進(jìn)行。
[0069] 2.使用透析緩沖液（15mM Tris，50mM NaCl，9%(v/v)glycerol，和ImM DTT，pH值 7.8的緩沖液），對(duì)DGC蛋白進(jìn)行透析。
[0070] 3.將透析過的DGC蛋白質(zhì)導(dǎo)入到樣品小室，隨后，等分滴定多環(huán)芳烴配體溶液。配 體溶液為多環(huán)芳烴(萘，菲，芘)溶解在DMS0中。
[0071] 4. 一系列注射方案:使用250yL注射器填充上述配體溶液。第一注射:2μΜ隨后的 注射每次1〇μL。在70min的間隔總共進(jìn)行25次注射。
[0072] 5.數(shù)據(jù)分析使用Nano分析軟件的獨(dú)立模型。由于ITC實(shí)驗(yàn)是在只有一個(gè)緩沖液進(jìn) 行的，該結(jié)合常數(shù)是在該特定緩沖液條件下獲得。
[0073]結(jié)果表明，DGC蛋白與所有測(cè)試的多環(huán)芳烴均有結(jié)合。在20°C條件下，分別計(jì)算出 了萘和芘與DGC蛋白結(jié)合的KD值是1.68 X 10_5和2.16 X 10_7M(圖1和2)。這意味著，DGC具與芘 有一個(gè)更高的親和力。
[0074] 實(shí)施例5多環(huán)芳烴(PAHs)激活環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶活性測(cè)定
[0075] 將制備純化好的上述解環(huán)菌P1DGC蛋白加入2mL反應(yīng)體系：終濃度為20mmol/L Tris(pH7.5)、20mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl 2、2mmol/L GTP DGC蛋白約2mg及不同PAHs (萘、菲、熒蒽、芘、屈、苯并[a ]芘溶解在DSMO中；反應(yīng)體系中每種PAHs終濃度分別為ΙμΜ、2μ Μ、5μΜ、1 ΟμΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ、1 ΟΟμΜ、200μΜ、500μΜ; DMS0為對(duì)照），加入超純水至50mL，緩慢 搖擺，室溫條件(22°C)下反應(yīng)約2~3h。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，使用EnzChd< k焦磷酸反應(yīng)試劑 盒，測(cè)試上述不同濃度、不同PAHs的反應(yīng)體系中環(huán)二鳥苷酸的產(chǎn)生量計(jì)算出該環(huán)二鳥苷酸 環(huán)化酶活性(結(jié)果如圖3和4)。
[0076] 結(jié)果表明，解環(huán)菌P1DGC在體外反應(yīng)體系中，感應(yīng)不同PAHs(萘、菲、熒蒽、芘、屈、苯 并[a]芘）后自身被激活，合成c-di-GMP。解環(huán)菌P1DGC感應(yīng)上述所有PAHs的濃度范圍為1~ 500μΜ〇
[0077] 環(huán)化酶DGC的DNA序列（SEQ ID Ν0.1):
[0078] 1 ττ.ΛΛτ.ΛΛΛΤτ γγ'λτττγτ(?γ γττοττγγττ
[0079]
[0080]
[0081 ] 環(huán)化酶DGC的氨基酸序列（SEQ ID N0.2):
[0082]
[0083] 環(huán)化酶DGC的底物特異性結(jié)合域氨基酸序列（SEQ ID NO.3):
[0084]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 菌株Cycloclasticus sp.Pl，已于2016年04月01日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC No. 12328。2. 環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶，其特征在于其DNA序列具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列。3. 如權(quán)利要求2所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 不。4. 如權(quán)利要求2所述環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶，其特征在于其多環(huán)芳烴結(jié)合域序列如SEQ ID NO. 3所示。5. 用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載體，其特征在于含有環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的DNA 序列。6. 如權(quán)利要求5所述重組載體，其特征在于所述重組載體為融合型表達(dá)載體。7. 如權(quán)利要求6所述重組載體，其特征在于所述融合型表達(dá)載體為pET28a。8. 如權(quán)利要求5所述重組載體，其特征在于包含用于表達(dá)環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶的重組載 體的宿主細(xì)胞及其表達(dá)純化環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶;所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌。9. 環(huán)二鳥苷酸環(huán)化酶及其編碼基因在多環(huán)芳烴檢測(cè)中應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于所述多環(huán)芳烴類化合物包括但不限于萘、菲、熒 蒽、芘、屈、苯并[α]芘。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK106085914SQ201610539484
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】邵宗澤, 王萬(wàn)鵬
【申請(qǐng)人】國(guó)家海洋局第三海洋研究所