專利名稱：利用熒光光素酶和fmn:nadh氧化還原酶進(jìn)行重金屬汞定量檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)汞的方法，特別是涉及一種利用海洋發(fā)光細(xì)菌Woto6octen'w附/e/og^淑YL胞內(nèi) 熒光光素酶和FMN:NADH氧化還原酶進(jìn)行重金屬汞定量檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)本發(fā)明人通過査閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，目前已知的海洋發(fā)光細(xì)菌只有三屬，分別是弧菌屬(W6n'o)， 明亮發(fā)光菌屬(i^otoZwcten'鵬)，及希瓦氏菌屬(幼ewa"e&)，陸地上則有異短桿菌屬(Xe"wto^^)。在 有氧的自然環(huán)境下，發(fā)光細(xì)菌可產(chǎn)生熒光素酶(LE)，催化黃素單核苷酸(FMNH2)及長(zhǎng)鏈脂肪醛類發(fā)生 氧化反應(yīng)，而發(fā)出藍(lán)綠色的熒光。
目前在我國應(yīng)用較廣的是明亮發(fā)光桿菌(尸/2oto6acto"/wTT7 /^cw; torcz/m),利用明亮發(fā)光桿菌進(jìn)行環(huán)境 污染物檢測(cè)的研究有所報(bào)道。而除了明亮發(fā)光桿菌以外，均沒有利用其他種屬的發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行環(huán)境污染物 檢測(cè)的報(bào)道。本發(fā)明中涉及的菌種鰒發(fā)光桿菌(P/zotoZw"m'M附fe'ogmrfW)與明亮發(fā)光桿菌(Ptoto6。"m'鵬 P/wv/wmm附)為同屬異種，在菌體形態(tài)特征、生理生化特征及16SrDNA序列上二者均有很大差異。該菌 株尸/20to6ac欣/w加/"og加決z' YL表現(xiàn)出穩(wěn)定的發(fā)光性能，對(duì)重金屬汞敏感，可以定量檢測(cè)汞。
發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理的研究表明，不同種類的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理是相同的，屬酶促氧化反應(yīng)。是由 分子氧作用，胞內(nèi)熒光酶(LE)催化，將還原態(tài)的黃素單核苷酸(FMNH2)及八碳以上的長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO) 氧化為FMN及長(zhǎng)鏈脂肪酸，同時(shí)釋放出最大發(fā)光強(qiáng)度在波長(zhǎng)為450 490nm的藍(lán)綠光。
熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶共同存在下的酶促氧化反應(yīng)的原理如下
FMN:NADH氧化還原酶對(duì)FMN有特異性，在NADH存在的條件下，將FMN還原為FMNH2，為發(fā) 光酶促反應(yīng)提供底物。熒光光素酶催化FMNH2和RCHO發(fā)生氧化還原反應(yīng)，同吋發(fā)出藍(lán)綠色熒光。
目前尚未有利用熒光光素酶和FMN:NADH氧化還原酶進(jìn)行重金屬汞定量檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌菌株P(guān)/wto幻她W, YL (鰒發(fā)光桿菌
YL)胞內(nèi)熒光光素酶和FMN:NADH氧化還原酶進(jìn)行汞的定量檢測(cè)。
本發(fā)明分離純化出一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌YL為革蘭氏陰性桿菌，被鑒定為鰒發(fā)光桿菌 (戶/wtobacto7'鵬/^gMaW)。該菌株于2006年12月27日委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC) 保藏，保藏號(hào)為M 206139。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，存取號(hào)為 EF017227。
本發(fā)明通過提取發(fā)光細(xì)菌胞內(nèi)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑，建立一種熒光光素酶 FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光的體系，實(shí)現(xiàn)了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體系在活體細(xì) 胞外的表達(dá)，通過重金屬汞對(duì)雙酶體系發(fā)光的抑制來測(cè)定汞的濃度。
其雙酶體系特征是 '
(1) 最佳底物配比十二烷醛1004L (27raM)、 FMN-Na53叱(10mM)和NADH 200叱(0. 14mM),體系 pH 7. 0。
(2) 發(fā)光檢測(cè)在微弱發(fā)光儀中進(jìn)行，檢測(cè)條件是設(shè)置波長(zhǎng)474nm， lmL酶液中，快速加入各底物， 立刻進(jìn)行定時(shí)跟蹤測(cè)定，連續(xù)測(cè)定間隔時(shí)間為ls。
其檢測(cè)體系特征是
提取發(fā)光細(xì)菌胞內(nèi)產(chǎn)物作為熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑進(jìn)行重金屬汞的定量測(cè)
定；
反應(yīng)溫度為4'C,反應(yīng)時(shí)間為15min。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶在活體細(xì)胞外的表達(dá)，構(gòu)建了熒光光素酶 FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系。該體系發(fā)光性能穩(wěn)定，發(fā)光強(qiáng)度高，底物配比簡(jiǎn)便可行，并可實(shí) 現(xiàn)汞的定量檢測(cè)。利用本發(fā)明檢測(cè)汞具有成本低、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠滿足汞的快速定量檢 測(cè)的需要。


附圖1重金屬離子對(duì)熒光光素酶酶活的影響。 附圖2 Hg^離子對(duì)熒光光素酶酶活的影響。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1酶液制備收集細(xì)胞懸浮液20mL， 4'C低溫離心(5000ipm， 5min)，棄上清，加入一定量PBS (5mL)，磁力振 蕩器混勻，冰上超聲破碎，每個(gè)樣本超聲時(shí)間15s，每個(gè)間隔30s，粉碎15次，功率300W。提取得到粗 酶液。實(shí)施例2酶體系酶活測(cè)定lmL粗酶液中， 一次性快速加入底物12烷醛100|uL (27mM)、 FMN-Na53pL (10mM)， Na2S204 lOOpL (34mM)， NADH lOOpL (0,14mM)，進(jìn)行酶活測(cè)定。發(fā)光檢測(cè)在微弱發(fā)光儀中進(jìn)行，檢測(cè)條件是加入溶液或試劑后，立刻進(jìn)行定時(shí)跟蹤測(cè)定，連續(xù)測(cè)定 間隔時(shí)間為ls。實(shí)施例3酶體系對(duì)重金屬敏感性的篩選lmL酶液中加入500nL重金屬溶液，4'C放置反應(yīng)15min， 一次性快速加入底物12垸醛lOOpL (27mM)、 F畫-Na53fiL (10mM), Na2S2O4100nL (34mM)， NADH 100|iL (0.14mM)，進(jìn)行酶活測(cè)定。 篩選酶敏感的重金屬。重金屬離子可與菌體蛋白質(zhì)結(jié)合使之變性或與某些蛋白的巰基結(jié)合而使酶失活[13]，不同濃度的各重金屬離 子對(duì)酶活的影響如圖5所示，差異很大。酶對(duì)Hg^最敏感，其次是C,+、 Cd2+，當(dāng)濃度為0.5ng/L時(shí)，Hg2+ 對(duì)酶的活性抑制率達(dá)到94%以上，Cr"對(duì)酶的活性抑制率為13.69%， Cc^+為3.51%。同樣選取對(duì)酶活影響 最大的Hg2、進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。實(shí)施例4尸./e/ogw^/H'YL熒光光素酶體系檢測(cè)南美白對(duì)蝦中的Hg2+① Hg+濃度抑制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線酶活測(cè)定方法同實(shí)施例2，以不同濃度Hg&溶液為橫坐標(biāo)，酶活抑制率為縱坐標(biāo)，每次測(cè)定重復(fù)3次， 做Hg&濃度抑制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以Hg"溶液濃度為橫坐標(biāo)，酶活抑制率為縱坐標(biāo)，得到Hg^離子對(duì)酶 活影響的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖1所示，方程為y = 15.486x - 22.986， R2 = 0.9676。標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢出限為 0細(xì)5ng/L。② 酶體系檢測(cè)南美白對(duì)蝦中Hg^的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品檢測(cè)稱取5.0g南美白對(duì)蝦蝦肉樣品于瓷坩堝中，添加不同濃度的Hg^溶液，添加5mL濃硝酸，先小火在 可調(diào)萬用電爐上炭化至無煙，移入馬弗爐500'C灰化6 8h時(shí)，冷卻。若個(gè)別樣品灰化不徹底，則加lmL 混合酸在萬能電阻爐上小火加熱,反復(fù)多次直至消化完全，放冷。。樣品灰化后加入5mL雙蒸水混溶。4'C 下存儲(chǔ)備用。lmL酶液中加入500pL Hg^樣品溶液，4'C放置反應(yīng)15min， 一次性快速加入發(fā)光體系各組分，測(cè)定 酶活抑制率。比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算HgS+實(shí)際檢測(cè)濃度。檢測(cè)重復(fù)7次，取平均值。以不加內(nèi)標(biāo)的南美白對(duì)蝦樣品作為空白本底。通過內(nèi)標(biāo)逐漸遞加的方法，確定酶進(jìn)行Hg^檢測(cè)的方法檢出限(表l)。表1酶體系檢測(cè)南美白對(duì)蝦中Hg^的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品檢測(cè)(n=7)樣品濃度(Hg/Kg)測(cè)量值(ng/Kg)回收率％RSD%0扁50細(xì)23446.8019.540.00060.00038063.3315.210扁70.00052174.4310.110扁80.00071489.258.760.0010扁38311.30.01、0.010910910.90.0250.0233993.568.4權(quán)利要求
1一種利用海洋發(fā)光細(xì)菌Photobacterium leiognathi YL菌株胞內(nèi)熒光光素酶和FMN:NADH氧化還原酶進(jìn)行重金屬Hg定量檢測(cè)的方法。其雙酶體系特征是(1)最佳底物配比十二烷醛100μL(27mM)、FMN-Na53μL(10mM)和NADH 200μL(0.14mM)，體系pH 7.0。(2)發(fā)光檢測(cè)在微弱發(fā)光儀中進(jìn)行，檢測(cè)條件是設(shè)置波長(zhǎng)474nm，1mL酶液中，快速加入各底物，立刻進(jìn)行定時(shí)跟蹤測(cè)定，連續(xù)測(cè)定間隔時(shí)間為1s。其檢測(cè)體系特征是提取發(fā)光細(xì)菌胞內(nèi)產(chǎn)物作為熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑進(jìn)行重金屬汞的定量測(cè)定；反應(yīng)溫度為4℃，反應(yīng)時(shí)間為15min。
全文摘要
本發(fā)明的目的是利用一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌菌株P(guān)hotobacterium leiognathi YL(鰒發(fā)光桿菌YL)胞內(nèi)熒光光素酶和FMN:NADH氧化還原酶進(jìn)行汞的定量檢測(cè)。本發(fā)明分離純化出一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細(xì)菌YL為革蘭氏陰性桿菌，被鑒定為鰒發(fā)光桿菌(Photobacterium leiognathi)。該菌株于2006年12月27日委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)保藏，保藏號(hào)為M 206139。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，存取號(hào)為EF017227。本發(fā)明通過提取發(fā)光細(xì)菌胞內(nèi)熒光光素酶和FMN-NADH氧化還原酶粗酶制劑，建立一種熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光的體系，實(shí)現(xiàn)了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶雙酶體系在活體細(xì)胞外的表達(dá)，通過重金屬汞對(duì)雙酶體系發(fā)光的抑制來測(cè)定汞的濃度。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶在活體細(xì)胞外的表達(dá)，構(gòu)建了熒光光素酶FMN-NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系。該體系發(fā)光性能穩(wěn)定，發(fā)光強(qiáng)度高，底物配比簡(jiǎn)便可行，并可實(shí)現(xiàn)汞的定量檢測(cè)。利用本發(fā)明檢測(cè)汞具有成本低、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠滿足汞的快速定量檢測(cè)的需要。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101625322SQ200810157628
公開日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2008年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者朱蘭蘭, 洪 林, 梅冊(cè)霞, 王亞群, 王靜雪 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)