檢測(cè)7q21.13區(qū)域SNP試劑的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)7q21.13區(qū)域SNP的試劑的應(yīng)用，具體地，檢測(cè)7q21.13區(qū)域SNP的試劑在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于制備肝癌患者篩查的產(chǎn)品，所述SNP為rs10272859。由此，利用所述檢測(cè)SNP的試劑可以有效用于肝癌患者篩查。
【專利說明】
檢測(cè)7q21 .13區(qū)域SNP試劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及檢測(cè)7q21.13區(qū)域SNP試劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌化epatocellular Cance;r，HCC，W下簡(jiǎn)稱肝癌）是常見的惡性 腫瘤之一，年發(fā)病率在惡性腫瘤中居第五位。我國是肝癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例約50萬， 占全球肝癌新發(fā)病例的半數(shù)W上。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究均表明，肝癌屬于多因素復(fù)雜疾病， 是病毒因素、環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。在我國，乙型肝炎（Hepatitis B Virus,皿V)感染是肝癌發(fā)生的最主要的因素，大約與80%的肝癌相關(guān)。但是，皿V慢性感染 者中，僅有少部分個(gè)體最終罹患肝癌，同時(shí)，肝癌的發(fā)生具有家族聚集傾向，提示遺傳因素 在肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)的基于候選基因的病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究W及近年 來興起的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study,GWAS)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了若干與 皿V相關(guān)肝癌顯著相關(guān)的單核巧酸多態(tài)性（Single nucleotide polymo;rphism，SNP)，進(jìn)一 步證實(shí)了皿V相關(guān)肝癌的發(fā)生存在遺傳病因，即存在皿V相關(guān)肝癌的易感基因。易感基因在 皿V相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。皿V相關(guān)肝癌易感基因的鑒定W及該基因 相關(guān)分子機(jī)制的解析，將為肝癌高危人群的預(yù)防和臨床診治提供理論依據(jù)，進(jìn)而有望實(shí)現(xiàn) 對(duì)肝癌的早期預(yù)防與個(gè)體化治療，達(dá)到提高肝癌治療效果的目的。
[0003] 全基因組關(guān)聯(lián)研究被證明可W無偏、有效的發(fā)掘疾病或表型相關(guān)的SNP。至今，已 有超過2000篇全基因組關(guān)聯(lián)研究被報(bào)道，其中，一半W上是針對(duì)腫瘤的研究。盡管基于病 例-對(duì)照的研究策略統(tǒng)計(jì)效能較高，但是由于存在人群混雜或人群分層等因素，該研究策略 容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。全基因組關(guān)聯(lián)研究為避免全基因組層面過多的假陽性結(jié)果，一般需 要選取關(guān)聯(lián)程度最強(qiáng)的數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)位點(diǎn)在驗(yàn)證人群中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，由此可能遺漏可 能相關(guān)的位點(diǎn)。此外，基于病例-對(duì)照的全基因組關(guān)聯(lián)研究最終報(bào)道的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)經(jīng)過了 多個(gè)獨(dú)立人群的重復(fù)驗(yàn)證，仍舊無法完全排除運(yùn)些位點(diǎn)可能是人群分層導(dǎo)致的假陽性結(jié) 果。
[0004] 目前，基于SNP的肝癌患者篩查的檢測(cè)技術(shù)仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是基于發(fā)明人對(duì)W下事實(shí)和問題的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)作出的：
[0006] 為了進(jìn)一步發(fā)掘新的皿V相關(guān)肝癌易感基因，發(fā)明人開展了新一輪的皿V相關(guān)肝癌 的全基因組關(guān)聯(lián)研究?；诩蚁档难芯坎呗圆皇苋巳悍謱蝇F(xiàn)象的影響，充分彌補(bǔ)了病例-對(duì) 照研究策略的不足。由此，發(fā)明人采用基于家系和基于病例-對(duì)照策略，可W有效、準(zhǔn)確地發(fā) 現(xiàn)疾病相關(guān)位點(diǎn)。在發(fā)掘階段，發(fā)明人綜合采用基于家系和基于病例-對(duì)照的策略，W充分 發(fā)揮兩種策略各自的優(yōu)勢(shì)。在驗(yàn)證階段，發(fā)明人采用基于病例-對(duì)照的策略完成兩階段的人 群驗(yàn)證。最終，成功定位了 7q21.13為肝癌新的易感區(qū)域。進(jìn)一步，發(fā)明人對(duì)該區(qū)域進(jìn)行了更 細(xì)致的分析。
[0007] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出檢測(cè)SNP的試劑在制備試劑盒中的用途，其 中，所述試劑盒用于肝癌患者篩查，所述SNP為rsl0272859,該位點(diǎn)位于人類第7號(hào)染色體 90,318,474位置(基于人類基因組第19版本）。發(fā)明人綜合采用基于家系和基于病例-對(duì)照 的策略，W充分發(fā)揮兩種策略各自的優(yōu)勢(shì)。在驗(yàn)證階段，采用基于病例-對(duì)照的策略完成兩 階段的人群驗(yàn)證，最終驗(yàn)證rsl0272859與肝癌顯著相關(guān)，由此，利用所述檢測(cè)SNP的試劑可 W有效進(jìn)行肝癌患者篩查。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述試劑包括引物和/或探針。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述rsl0272859為GC或GG的基因型是肝癌高風(fēng)險(xiǎn)的指 示。通過分析rsl0272859基因型與肝癌病人的生存期，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，攜帶rsl0272859風(fēng)險(xiǎn)等 位G等位的肝癌患者(GG或GC)生存期顯著短于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位患者。由此，可W通過檢測(cè) rsl0272859的基因型來有效進(jìn)行肝癌患者篩查。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出一種用于肝癌患者篩查的試劑盒，所述試劑 盒含有檢測(cè)SNP的試劑，所述SNP為rsl0272859。發(fā)明人綜合采用基于家系和基于病例-對(duì)照 的策略，W充分發(fā)揮兩種策略各自的優(yōu)勢(shì)。在驗(yàn)證階段，采用基于病例-對(duì)照的策略完成兩 階段的人群驗(yàn)證，最終驗(yàn)證rsl0272859與肝癌顯著相關(guān)，由此，利用所述試劑盒可W有效檢 測(cè)肝癌。
[001^ 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述試劑包括引物和/或探針。所述試劑的使用方法包 括但不限于化qMan分型和Sequenom分型等。
[OOU] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述引物為GTCTCTTTCCACCTCTTCAACCA(沈Q ID N0:1) 和AGTCAGCAGGCAGTTAGAATACAGTATC(SEQ ID ^:2)。其中，61'(：1'(：1'1'1'撕40：1'(：1'1^440：4為前 向引物，AGTCAGCAGGCAGTTAGAATACAGTATC為后向引物，利用前向引物和后向引物可W有效 地檢測(cè)本發(fā)明所述SNP位點(diǎn)。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述探針為（FAM)TCAGCCATATCTGCTTATTCTTGAGCACC (沈Q ID N0:3)和/或化EX)TTCAGCCATATCTGGTTATTCTTGAGCACC(SEQ ID N0:4)。利用所述探 針可W有效地檢測(cè)本發(fā)明所述SNP位點(diǎn)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述rsl0272859為GC或GG的基因型是肝癌高風(fēng)險(xiǎn)的指 示。通過分析rsl0272859基因型與肝癌病人的生存期，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，攜帶rsl0272859風(fēng)險(xiǎn)等 位G等位的肝癌患者(GG或GC)生存期顯著短于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位患者。由此，可W通過利用所 述試劑盒來檢測(cè)rsl0272859的基因型來有效檢測(cè)肝癌。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，本發(fā)明提出一種用于肝癌患者篩查的設(shè)備，包括：
[0017] 測(cè)序裝置，所述測(cè)序裝置用于對(duì)患者的全基因組中至少之一進(jìn)行測(cè)序，W便獲得 測(cè)序結(jié)果;其中，所述全基因組中至少之一為包括rsl0272859的區(qū)域。
[0018] 比對(duì)裝置，所述比對(duì)裝置與所述測(cè)序裝置相連，且用于基于所述測(cè)序結(jié)果，確定 rsl0272859的基因類型；
[0019] 分析裝置，所述分析裝置與所述比對(duì)裝置相連，且用于基于所述SNP類型確定肝癌 風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明人綜合采用基于家系和基于病例-對(duì)照的策略，W充分發(fā)揮兩種策略各自的優(yōu) 勢(shì)。在驗(yàn)證階段，采用基于病例-對(duì)照的策略完成兩階段的人群驗(yàn)證，最終驗(yàn)證rsl0272859 與肝癌顯著相關(guān)，由此，利用所述設(shè)備可W有效檢測(cè)肝癌。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述測(cè)序裝置用于對(duì)患者的全基因組中預(yù)定區(qū)域進(jìn)行 測(cè)序，W便獲得測(cè)序結(jié)果；其中，所述預(yù)定區(qū)域?yàn)閞sl0272859上游Ikb，下游Ikb。由此，可W 更加有效地進(jìn)行測(cè)序。
【附圖說明】
[0021] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1的廣西家系人群關(guān)聯(lián)結(jié)果的分位數(shù)圖。
[0022] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1的廣西家系人群關(guān)聯(lián)結(jié)果曼哈頓圖。
[0023] 圖3是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1的廣西病例-對(duì)照人群關(guān)聯(lián)結(jié)果的分位數(shù)圖。
[0024] 圖4是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1的廣西病例-對(duì)照人群關(guān)聯(lián)結(jié)果曼哈頓圖。
[0025] 圖5是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1的rsl0272859各階段苔萃分析森林圖。
[0026] 圖6是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2的rsl0272859風(fēng)險(xiǎn)等位G與肝癌患者預(yù)后相關(guān)性示意 圖。
[0027] 圖7是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3的rsl0272859基因型與CDK14基因表達(dá)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考 附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 實(shí)施例
[0030] 實(shí)施例1皿V相關(guān)肝癌的全基因組關(guān)聯(lián)研究
[0031] 2.材料與方法
[0032] 2.1研究對(duì)象
[0033] 2.1.1全基因組關(guān)聯(lián)研究樣本
[0034] 本項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究分為Ξ個(gè)研究階段:發(fā)掘階段，驗(yàn)證階段I和驗(yàn)證階段II。 所有研究對(duì)象均為中國成年個(gè)體，招募自中國東部、南部、西部和北部。所有病例-對(duì)照個(gè)體 均為HBV持續(xù)感染者，入選標(biāo)準(zhǔn)為血清乙肝表面抗原化epatitis B surface antigen, 皿sAg)和乙肝核屯、抗體(anti-HBc immunoglobulin G，IgG anti-HBc)呈陽性至少6個(gè)月。 肝癌患者的入選標(biāo)準(zhǔn)為診斷為原發(fā)性肝癌，未接受放、化療，且經(jīng)過病理證實(shí)。病例-對(duì)照人 群個(gè)體均不存在親緣關(guān)系。所有患者均已簽署知情同意書，且本研究經(jīng)放射與福射醫(yī)學(xué)研 究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。
[0035] 發(fā)掘階段包括廣西肝癌核屯、家系人群（205個(gè)肝癌核屯、家系，每個(gè)家系包含一個(gè) HBV相關(guān)肝癌患者與其健康雙親，共205X3 = 615人)和廣西病例-對(duì)照人群（355例病例和 360例對(duì)照，病例為皿V相關(guān)肝癌患者，對(duì)照為慢性皿V攜帶者，下同）。廣西核屯、家系人群由 廣西腫瘤醫(yī)院2005年6月至2010年7月招募自廣西，經(jīng)過全基因組SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后，保留 189個(gè)皿V相關(guān)肝癌核屯、家系用于后續(xù)分析。其中，核屯、家系先證者的平均年齡35.7±6.9， 男女比例9.5。廣西病例-對(duì)照人群由廣西腫瘤醫(yī)院2002年至2008年招募，該人群即發(fā)明人 開展的國際首項(xiàng)肝癌全基因組關(guān)聯(lián)研究的發(fā)掘階段人群。經(jīng)過全基因組SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 后，可用于后續(xù)分析的病例％8例，對(duì)照359例。病例人群平均年齡45.8± 10.6，男女比例 6.7 ;對(duì)照人群平均年齡41 . 6 ± 1 2 . 1，男女比例6.3。發(fā)掘階段，全基因組SNP (包括 rsl0272859)通過全基因組忍片檢測(cè)。
[0036] 驗(yàn)證階段I包括陜西病例-對(duì)照人群（1,095例病例和394例對(duì)照）。病例個(gè)體由第四 軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院和唐都醫(yī)院2011年6月至2013年7月招募自陜西，病例人群平均年齡51.0 ±10.5,男女比例8.1。對(duì)照人群由西藏民族學(xué)院2011年12月至2012年7月招募自陜西，對(duì)照 人群平均年齡40.9± 14.1，男女比例1.6。
[0037] 驗(yàn)證階段II包括廣東病例-對(duì)照人群巧74例病例和580例對(duì)照）、北京病例-對(duì)照人 群(276例病例和266例對(duì)照）、江蘇病例-對(duì)照人群(50例病例和141例對(duì)照)和廣西病例-對(duì) 照人群(285例病例和623例對(duì)照）。其中廣東病例-對(duì)照人群由中山大學(xué)附屬第Ξ醫(yī)院2011 年10月至2014年11月招募自廣東，病例人群平均年齡49.4 ± 11.9，男女比例9.6，對(duì)照人群 平均年齡48.1 ±12.4,男女比例8.4。北京病例-對(duì)照人群由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院2003 年3月至2009年2月招募自北京，病例人群平均年齡55.9 ± 9.1，男女比例6.1，對(duì)照人群平均 年齡55.50 ± 12.2，男女比例5.5。江蘇病例-對(duì)照使用全基因組分型數(shù)據(jù)，其中部分對(duì)照數(shù) 據(jù)(91例對(duì)照)來自南京醫(yī)科大學(xué)已發(fā)表的全基因組關(guān)聯(lián)研究，其余病例-對(duì)照數(shù)據(jù)來自復(fù) 旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院未發(fā)表數(shù)據(jù)，病例人群平均年齡52.4±7.8,全部為男性個(gè)體，對(duì)照人 群平均年齡56.7 ± 9.6，男女比例7.3。廣西病例-對(duì)照人群病例人群由廣西腫瘤醫(yī)院2004年 1月至2012年10月招募自廣西。病例人群平均年齡47.8 ± 11.3，男女比例8.2;對(duì)照人群來自 發(fā)明人招募的廣西玉林地區(qū)肝癌高危人群前瞻性隊(duì)列樣本(2011年2月至2012年10月），平 均年齡41.0±10.4,男女比例2.9。用于全基因組關(guān)聯(lián)研究樣本的人群信息可參見表1。
[0038] 驗(yàn)證階段，rsl0272859通過化qMan檢測(cè)，檢測(cè)引物：
[0039] 前向引物:GTCTCTTTCCACCTCTTCAACCA(SEQ ID N0:1);
[0040] 后向引物:AGTCAGCAGGCAGTTAGAATACAGTATC(SEQ ID N0:2);
[0041] 探針l:(FAM)TCAGCCATATCTGcTTATTCTTGAGCACC(SEQ ID N0:3);
[0042] 探針2:(HEX)TTCAGCCATATCTG巧TATTCTTGAGCACC(SEQ ID N0:4)。
[0043]
[0044] 2.2關(guān)聯(lián)研究
[0045] 廣西病例-對(duì)照人群的關(guān)聯(lián)研究使用基于加性模型的邏輯斯蒂化ogistic)回歸分 析方法。邏輯斯蒂回歸校正性別、年齡、是否吸煙、是否飲酒W及是否有家族史。使用化INK 軟件1.07版本計(jì)算。
[0046] 廣西家系人群的關(guān)聯(lián)研究使用傳遞不平衡檢驗(yàn)（Transmission/Disequi librium Test, TDT)分析。TDT分析通過檢驗(yàn)?zāi)硞€(gè)SNP從雜合子的父母?jìng)鬟f給患病后代的機(jī)率是否高 于預(yù)期值，判斷該SNP是否可能與該疾病相關(guān)。使用化INK軟件1.07版本計(jì)算。
[0047] 為檢驗(yàn)研究是否存在人群分層等因素導(dǎo)致的系統(tǒng)性偏差，我們使用分位數(shù)圖 (quantile-quantile plot,Q-Q plot)和膨脹系數(shù)（genomic inflation factor)進(jìn)行判 另IJ。膨脹系數(shù)衡量實(shí)際獲得的關(guān)聯(lián)P值與預(yù)期P值之間存在的差異。分位數(shù)圖和膨脹系數(shù)均 使用R軟件進(jìn)行計(jì)算。
[004引 2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)
[0049] 苔萃分析使用METAL軟件進(jìn)行，用W將各階段關(guān)聯(lián)分析得到的比值比和95%置信 區(qū)間進(jìn)行合并。Cochran Q檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)量I2用W評(píng)估各個(gè)階段是否存在異質(zhì)性，W判斷苔萃 分析使用隨機(jī)效應(yīng)模型或固定效應(yīng)模型。候選SNP位點(diǎn)與個(gè)體的性別和年齡交互作用分析 使用邏輯斯蒂回歸分析。人群歸因分?jǐn)?shù)根據(jù)W下公式計(jì)算:PAF% = 100X(x-l)/x，其中x = (1-P) 2+化（1-P) 〇Ri+P%R2，運(yùn)里P代表群體等位頻率，ORi和OR2代表雜合子和純合子的風(fēng)險(xiǎn) 比。
[0050] 3.結(jié)果
[0051] 3.1全基因組SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制結(jié)果
[0052] 廣西病例-對(duì)照人群使用Affymetrix公司SNP 5.0忍片(Affymetrix 5.0)進(jìn)行分 型。經(jīng)過質(zhì)量控制，348例病例和359例對(duì)照，288,424個(gè)常染色體SNP進(jìn)入后續(xù)分析。所有樣 本平均檢出率達(dá)到99.03%。廣西家系人群使用111膽111曰公司中華忍片。1111111111曰 Human0mniZhongHua-8Bead化ip)進(jìn)行分型。經(jīng)過質(zhì)控控制，189個(gè)核屯、家系，694,794個(gè)5肥 進(jìn)入后續(xù)分析(表2)。所有樣本平均檢出率達(dá)到99.69%。
[0053] 表2廣西家系人群質(zhì)量控制過程
[0054] (a)使用化INK軟件去除不合格家系
[0化5]
[0056]注:檢測(cè)率低于90%被認(rèn)為檢測(cè)率低;孟德爾錯(cuò)誤高過5%被認(rèn)定不是生物學(xué)意義 上
[0化7]的家系。
[005引（b)SNP質(zhì)量控制過程
[0化9]
[0060] 3.3關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0061] 廣西家系人群采用基于家系的研究策略。發(fā)明人使用TDT對(duì)廣西家系人群進(jìn)行關(guān) 聯(lián)分析。在僅有少量真實(shí)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)淹沒在大量假陽性位點(diǎn)的情況下，TDT分析被認(rèn)為特別有 效，由此，TDT分析可用來證實(shí)或拒絕報(bào)道的顯著關(guān)聯(lián)結(jié)果。據(jù)此，有理由相信，通過TDT分 析，可W篩選出真實(shí)的與肝癌相關(guān)的位點(diǎn)。TDT結(jié)果顯示，廣西家系人群中，關(guān)聯(lián)結(jié)果的膨脹 系數(shù)為1.04,該數(shù)值小于1.05。同時(shí)，分位數(shù)圖無明顯偏移，如圖1所示，其中，圖1中P值由廣 西家系人群TDT分析獲得，黑線是對(duì)90%觀測(cè)值分布的擬合。由此，說明廣西家系人群的關(guān) 聯(lián)結(jié)果不存在系統(tǒng)性偏差。值得注意的是，基于家系的研究策略對(duì)基因型錯(cuò)誤較之病例-對(duì) 照策略更加敏感，SNP推算導(dǎo)致的基因型錯(cuò)誤往往較大程度影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。發(fā)明人注意 到，推算SNP關(guān)聯(lián)結(jié)果與實(shí)際分型SNP關(guān)聯(lián)結(jié)果膨脹系數(shù)相差不大，一定程度上提示推算的 結(jié)果不存在明顯偏差。
[0062] 進(jìn)一步地，通過TDT分析，發(fā)現(xiàn)眾多與肝癌顯著相關(guān)的位點(diǎn)。關(guān)聯(lián)結(jié)果曼哈頓圖如 圖2所示，其中圖2中橫坐標(biāo)為染色體位置，縱坐標(biāo)為-logio(P)。其中包含W往通過全基因組 關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的位于1(伴18、化4-〇941/01^1、化4-〇〇和84邸2基因區(qū)域的8肥位點(diǎn)。提示基于 家系的TDT分析可W有效發(fā)現(xiàn)肝癌相關(guān)位點(diǎn)。
[0063] 為增加發(fā)掘階段的統(tǒng)計(jì)效能，基于廣西病例-對(duì)照人群，進(jìn)行基于加性模型的邏輯 斯蒂回歸分析。關(guān)聯(lián)結(jié)果的膨脹系數(shù)為1.01，如圖3所示，其中圖3中P值由廣西病例-對(duì)照人 群邏輯斯蒂回歸分析獲得，黑線是對(duì)90%觀測(cè)值分布的擬合。關(guān)聯(lián)結(jié)果曼哈頓圖如圖4所 示，其中圖4中橫坐標(biāo)為染色體位置，縱坐標(biāo)為-loglO(P)。
[0064] 3.4人群驗(yàn)證結(jié)果
[0065] 人群驗(yàn)證分為兩個(gè)階段:驗(yàn)證階段I對(duì)14個(gè)候選SNP位點(diǎn)在陜西病例-對(duì)照人群中 進(jìn)行分型?；诩有阅Ｐ偷倪壿嬎沟倩貧w分析方法得到2個(gè)SNP位點(diǎn)（rsl 1163360和 rsl0272859)仍舊顯著關(guān)聯(lián)且關(guān)聯(lián)方向與發(fā)掘階段一致。驗(yàn)證階段II對(duì)運(yùn)2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)一 步在廣東、北京、江蘇和廣西病例-對(duì)照人群中進(jìn)行分析?；诩有阅Ｐ偷倪壿嬎沟倩貧w分 析方法發(fā)現(xiàn)rsl0272859仍舊顯著關(guān)聯(lián)且關(guān)聯(lián)方向一致(表3)。
[0066] 進(jìn)一步查看rsl0272859位點(diǎn)在各個(gè)階段的分型情況，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在廣西家系人群 中是通過推斷獲得的（在廣西病例-對(duì)照中是實(shí)際分型獲得）。為排除SNP推斷導(dǎo)致的錯(cuò)誤， 進(jìn)一步對(duì)rsl0272859在廣西家系人群中進(jìn)行了化qMan分型。選取其中524個(gè)樣本，成功分型 495個(gè)，成功率94.5% DTaqMan分型結(jié)果與SNP推算的結(jié)果一致率較高，達(dá)到98.4% (表4)。雖 然二者一致率較高，但對(duì)TDT檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。利用化qMan結(jié)果，對(duì)TDT檢驗(yàn)進(jìn)行更新 后，rsl0272859在廣西家系人群中仍舊顯著關(guān)聯(lián)，P = 0.023。
[0067] 苔萃分析發(fā)現(xiàn)，合并所有人群的結(jié)果，rsl0272859的P值達(dá)到2.62Xl〇-s(表3)，超 過了全基因組關(guān)聯(lián)研究要求的5Χ10-8的闊值，提示rsl0272859與肝癌顯著相關(guān)。苔萃分析 的森林圖如圖5所示，其中，圖5中四條藍(lán)線自上而下代表本研究中GWAS階段家系人群、GWAS 階段病例-對(duì)照人群、研究階段I和II的風(fēng)險(xiǎn)比。菱形代表合并后的風(fēng)險(xiǎn)比。苔萃分析使用 METAL軟件。
[006引進(jìn)一步對(duì)rsl0272859與個(gè)體的性別和年齡是否存在交互作用進(jìn)行了分析。沒有發(fā) 現(xiàn)顯者差異（Pheterogeneity 二 0.79和0.39 ,表5 )。
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] 實(shí)施例2 rsl0272859與肝癌病人預(yù)后相關(guān)
[0073] 已報(bào)道的研究顯示，部分SNP與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。如位于化C39A6基因5'非翻 譯區(qū)（5'UTR)上的rs7242481與食管鱗狀細(xì)胞癌病人的總體生存期顯著相關(guān)，(XL20基因附 近的rs4458204與雌激素受體化strogen rec邱to;r，ER)陰性的乳腺癌病人總體生存期顯著 相關(guān)。有趣的是，發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)rsl7401966,最近被證明 與肝癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)。那么，rsl0272859基因型是否與肝癌病人預(yù)后顯著相關(guān)。驗(yàn)證 階段II中，廣西病例-對(duì)照人群中部分樣本具有較全面臨床信息(n=104)，發(fā)明人定義該樣 本集為樣本集USample set 1)。通過分析rsl0272859基因型與肝癌病人的生存期，發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)，攜帶rsl0272859風(fēng)險(xiǎn)等位G等位的肝癌患者(GG或GC)生存期顯著短于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等 位患者(CC)(P = 9.0X10-3，皿=2.33，圖6(A)，風(fēng)險(xiǎn)比由Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型校正性另リ、年齡和 ?m分期計(jì)算而得）。發(fā)明人在南京八一醫(yī)院腫瘤外科收集的肝癌病人具有較全面臨床信息 (n = 88)，并且定義該樣本集為樣本集2(Sample set 2)。采用TaqMan技術(shù)對(duì)運(yùn)些樣本的 rs 10272859進(jìn)行分型。通過計(jì)算發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，攜帶rs 10272859風(fēng)險(xiǎn)等位G等位的肝癌患者 (GG或GC)生存期也顯著短于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位患者(CC)(P = 8.6X10-3，HR = 2.46，圖6(B)，風(fēng) 險(xiǎn)比由Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型校正性別、年齡和?!分期計(jì)算而得）。進(jìn)一步通過基因表達(dá)綜合數(shù) 據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集(GSE38323,樣本集3)驗(yàn)證運(yùn)一發(fā)現(xiàn)。該樣本集共包含286例肝癌患者。該樣 本集樣本未對(duì)rsl0272859進(jìn)行分型，但與其強(qiáng)連鎖不平衡的SNP位點(diǎn)rs6976601(r2 = 0.98) 在該樣本集中實(shí)際分型。發(fā)明人通過分析發(fā)現(xiàn)，攜帶rs6976601風(fēng)險(xiǎn)等位A的肝癌病人(AA或 AG)生存期明顯短于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位患者(GG)(P = 0.14,皿=1.30,圖6C)。雖然該P(yáng)值未到 達(dá)顯著，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，攜帶rs6976601風(fēng)險(xiǎn)等位A的肝癌病人，五年生存率顯著低于未攜帶風(fēng) 險(xiǎn)等位患者巧9.1%比71.3%;? = 0.031)。綜上，證明了^10272859基因型與肝癌患者的生 存期顯著相關(guān)。
[0074]實(shí)施例3易感基因定位分析和致病位點(diǎn)探索分析
[00巧]rsl0272859位于7q21.13區(qū)域，該位點(diǎn)所在連鎖不平衡模塊大約110-化，模塊內(nèi)包 含CDK14基因。該模塊內(nèi)，rsl859023(該位點(diǎn)與rsl0272859在中國人群中強(qiáng)連鎖不平衡， = 0.78)被報(bào)道在非裔美國人群中與冠屯、病的發(fā)生顯著相關(guān)。
[0076] 為進(jìn)一步證明CDK14該區(qū)域的候選易感基因，發(fā)明人對(duì)肝臟樣本中rsl0272859基 因型與CDK14基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行了分析。首先對(duì)用于生存分析的"樣本集合2"共88個(gè)肝癌 樣本進(jìn)行CDK14基因表達(dá)定量。其中24個(gè)樣本mRNA定量失敗，最終64個(gè)樣本進(jìn)入分析。發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)，攜帶rsl0272859風(fēng)險(xiǎn)等位G的樣本(GG和GC)，CDK14表達(dá)顯著高于未攜帶風(fēng)險(xiǎn)等位 的樣本(CC)(P = 0.0052,圖7(A))。進(jìn)一步利用癌癥基因組圖譜計(jì)劃中的82例肝癌病人的 SNP和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，得到了類似的結(jié)論(P = 0.011，圖7(B)，P值使用雙端非配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì) 算)。
[0077] 綜上，研究新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)皿V相關(guān)肝癌的易感區(qū)域7q21.13。該區(qū)域的候選易感基 因可能是CDK14。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可能有助于更好地篩選皿V相關(guān)肝癌的高危個(gè)體。
[0078] 此外，術(shù)語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性 或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可W明示或者 隱含地包括至少一個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，"多個(gè)"的含義是至少兩個(gè)，例如兩個(gè)，Ξ 個(gè)等，除非另有明確具體的限定。
[0079] 在本說明書的描述中，參考術(shù)語"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不 必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可W在任 一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中W合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可W將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例W及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié) 合和組合。
[0080]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可W理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可W對(duì)上述 實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)SNP的試劑在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于肝癌患者篩查，所述SNP為 rsl0272859。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，所述試劑包括引物和/或探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述rsl0272859為GC或GG的基因型是肝癌 尚風(fēng)險(xiǎn)的指不。4. 一種用于肝癌患者篩查的試劑盒，其特征在于： 含有檢測(cè)SNP的試劑，所述SNP為rsl0272859。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述試劑包括引物和/或探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述引物為GTCTCTTTCCACCTCTTCAACCA和 AGTCAGCAGGCAGTTAGAATACAGTATC 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，所述探針為(FAM)TCAGCCATATCTGcTTATTCTTGAGCACC 和/或（HEX)TTCAGCCATATCTGgTTATTCTTGAGCACC。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述rs 10272859為GC或GG的基因型是肝 癌尚風(fēng)險(xiǎn)的指不。9. 一種用于肝癌患者篩查的設(shè)備，其特征在于，包括： 測(cè)序裝置，所述測(cè)序裝置用于對(duì)患者的全基因組至少之一進(jìn)行測(cè)序，以便獲得測(cè)序結(jié) 果； 比對(duì)裝置，所述比對(duì)裝置與所述測(cè)序裝置相連，且用于基于所述測(cè)序結(jié)果，確定 rsl0272859的基因類型； 分析裝置，所述分析裝置與所述比對(duì)裝置相連，且用于基于所述SNP類型確定肝癌風(fēng) 險(xiǎn)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011244SQ201610373409
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】周鋼橋, 張紅星, 賀福初, 李元豐, 翟蕓
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所