本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種肝癌相關(guān)microRNA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶miRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。肝細(xì)胞肝癌(HCC)是我過(guò)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因和多步驟的復(fù)雜過(guò)程。新近研究結(jié)果表明，多種miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因參與HCC的細(xì)胞生物程序調(diào)控，間接發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能。研究發(fā)現(xiàn)，與臨近肺腫瘤組織相比，77.8％的肝癌組織中miR-138表達(dá)下調(diào)。肝癌組織中過(guò)度表達(dá)的miR-138可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，阻止細(xì)胞集落形成，降低腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活率。此外還有研究表明，提高miR-122的表達(dá)水平可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)；miR-26a在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)表達(dá)下降，降低磷酸化的PRB，阻止細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)度；miR-101上調(diào)可使肝癌G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞減少，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究表明，其通過(guò)抑制EZH2基因表達(dá)，對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖活性具有負(fù)調(diào)控作用；以及mir-21在肝癌轉(zhuǎn)移和侵犯的作用和基本作用機(jī)制得到明確。目前，針對(duì)miRNA的檢測(cè)方法主要有NorthernBlot、基因芯片、熒光定量探針?lè)?、基于微球的流式?xì)胞術(shù)技術(shù)。但NorthernBlot方法敏感度低、耗時(shí)長(zhǎng)且RNA的用量較大，不適合高通量分析；基因芯片技術(shù)能實(shí)現(xiàn)miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)miRNA，但缺點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差，實(shí)驗(yàn)價(jià)格昂貴；熒光定量探針?lè)z測(cè)靈敏度高，但檢測(cè)費(fèi)用昂貴；而基于微球的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)將探針固定于微球上并置于液相中，更有利于捕獲miRNA序列，因此提高了準(zhǔn)確性，但是由于miRNA同源性高，長(zhǎng)度較短，細(xì)胞或組織內(nèi)含量低，針對(duì)它的高靈敏高選擇性檢測(cè)方法仍然有待進(jìn)一步完善。原位雜交技術(shù)是一種定位和形態(tài)學(xué)檢測(cè)保存的組織切片或細(xì)胞制備物中特異性miRNA 序列的方法。然而目前現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)miRNA的多重平行檢測(cè)仍存在許多困難。首先，需要分別制備各靶miRNA的標(biāo)記探針；其次，難以同時(shí)原位檢測(cè)多種靶miRNA的表達(dá)。因此，目前報(bào)道的對(duì)多種miRNA的檢測(cè)只能用不同的標(biāo)記方法，然而，用不同的標(biāo)記方法不能很好地控制探針與細(xì)胞中非特異性序列可能的交叉雜交。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的肝癌相關(guān)microRNA檢測(cè)試劑盒。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種肝癌相關(guān)microRNA檢測(cè)試劑盒，包括有：針對(duì)每種待檢測(cè)的肝癌相關(guān)microRNA有至少一條一級(jí)信號(hào)放大探針、至少一條二級(jí)信號(hào)放大探針、和至少一條三級(jí)信號(hào)放大探針，以及捕獲探針，所述肝癌相關(guān)microRNA選自選自::hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p中的至少一種，其中：所述捕獲探針用于連接目標(biāo)核酸與一級(jí)信號(hào)放大探針，每條捕獲探針從5’端到3’端依次為特異性P1序列、間隔臂序列、P2序列，針對(duì)不同目標(biāo)基因的P2序列互不相同；所述一級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：P4序列、間隔臂序列、P3序列，P3序列與P2序列互補(bǔ)配對(duì)；所述二級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：P5序列、間隔臂序列、P6序列；所述P4序列含有至少一個(gè)與P5序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段，且每個(gè)與P5序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列；所述三級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端還修飾有熒光基團(tuán)，針對(duì)不同目標(biāo)核酸的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長(zhǎng)互不相同；所述P6序列含有至少一個(gè)與P7序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段，且每個(gè)與P7序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列；所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，各探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與整個(gè)檢測(cè)體系的其它核酸之間均不存在特異性結(jié)合的序列。所述待檢測(cè)的肝癌相關(guān)miRNA的捕獲探針的特異性P1序列選自以下中的至少一種：針對(duì)hsa-miR-138-5p的SEQIDNO.1，針對(duì)hsa-miR-122-5p的SEQIDNO.2，針對(duì)hsa-miR-101-3p的SEQIDNO.3，針對(duì)hsa-miR-21-5p的SEQIDNO.4，針對(duì)hsa-miR-326的SEQIDNO.5， 針對(duì)hsa-miR-297的SEQIDNO.6，針對(duì)hsa-miR-520b的SEQIDNO.7，針對(duì)hsa-miR-181b-5p的SEQIDNO.8，針對(duì)hsa-miR-519b-3p的SEQIDNO.9，針對(duì)hsa-miR-602的SEQIDNO.10，針對(duì)hsa-miR-26a-5p的SEQIDNO.11，針對(duì)hsa-miR-199a-5p的SEQIDNO.12。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述P2序列選自：SEQIDNO.13～SEQIDNO.24；所述P5序列選自：SEQIDNO.37～SEQIDNO.48，所述P7序列選自SEQIDNO.61～SEQIDNO.72；所述P4序列中的所述間隔臂序列為3—10個(gè)T；所述P6序列的所述間隔臂序列為2—10個(gè)T；P8序列為polyT。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述polyT為3-10個(gè)T。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述P4序列選自：SEQIDNO.25～SEQIDNO.36，所述P6序列選自：SEQIDNO.49～SEQIDNO.60。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述一級(jí)信號(hào)放大探針中所述P4序列與P3序列之間的間隔臂序列選自5－20個(gè)T；二級(jí)信號(hào)放大探針中所述P5序列與P6序列之間的間隔臂序列選自5－10個(gè)T；三級(jí)信號(hào)放大探針中P7序列與P8序列之間的間隔臂序列選自3－10個(gè)T。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光基團(tuán)選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且針對(duì)不同目標(biāo)核酸的熒光基團(tuán)互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明提供一種肝癌相關(guān)miRNA的檢測(cè)捕獲探針以及由其構(gòu)成的檢測(cè)試劑盒，所述的捕獲采用的三明治結(jié)構(gòu)(與靶標(biāo)miRNA反向互補(bǔ)序列P1—間隔序列—與一級(jí)信號(hào)放大探針P3序列互補(bǔ)結(jié)合的P2序列)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，更具有實(shí)用性。而且本技術(shù)方案所設(shè)計(jì)的捕獲探針能夠?qū)崿F(xiàn)特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明所選擇的信號(hào)放大探針，是發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)進(jìn)行綜合評(píng)估、統(tǒng)計(jì)分析、多種參數(shù)的優(yōu)化組合而得出的。(2)原位雜交方法本身具有熒光信號(hào)靈敏度低的缺點(diǎn)，但是本發(fā)明采用新型的原位雜交方法，通過(guò)信號(hào)放大體系提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。本發(fā)明檢測(cè)流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的miRNA雜交探針通過(guò)信號(hào)放大系統(tǒng)，與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，顯著提高miRNA原位雜交的檢測(cè)靈敏度。(3)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種肝癌相關(guān)miRNA的探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng)。(4)本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽(yáng)性。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。實(shí)施例1肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例提供一種肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)試劑盒，包括有捕獲探針以及信號(hào)放大探針，信號(hào)放大探針包括有，一級(jí)信號(hào)放大探針、二級(jí)信號(hào)放大探針、三級(jí)信號(hào)放大探針。以上探針具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。1、捕獲探針捕獲探針是連接靶核酸與一級(jí)信號(hào)放大探針，每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測(cè)的靶核酸結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與一級(jí)信號(hào)放大探針結(jié)合P3互補(bǔ)配對(duì)的P2序列，針對(duì)不同目標(biāo)基因的P2序列互不相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與特異性序列P1間隔開(kāi)來(lái)，通過(guò)在探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個(gè)T，本實(shí)施例優(yōu)選為5個(gè)T。本實(shí)施例針對(duì)hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p設(shè)計(jì)捕獲探針，具體如表1、表2：表1捕獲探針的P1序列表2捕獲探針的P2序列SEQIDNO.P2序列(5’→3’)SEQIDNO.P2序列(5’→3’)13GTCTATAGTG19GATGACAGTA14GATTCAGTGA20AGTACTTGTG15TTGAGTAATG21AGTCTTGAAG16TGTAATGAGT22TGATGAATTG17GATTAGTGAT23ATGACGATAG18GTAGATTAGT24TTGACGTGAA2、信號(hào)放大探針1)一級(jí)信號(hào)放大探針信號(hào)放大組分中包括一條或以上的一級(jí)信號(hào)放大探針，所述每條一級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：與P2序列反向互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的P3序列、間隔臂序列、P4序列，P3序列通過(guò)與捕獲探針P2序列的結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。本實(shí)施例中，所述P3序列為與P2序列反向互補(bǔ)的堿基序列。本發(fā)明P3與P4序列之間的間隔臂序列可以選自5－20個(gè)T，本實(shí)施例使用的間隔臂為 10個(gè)T。所述P4序列含有一個(gè)或以上與二級(jí)信號(hào)放大探針的P5序列反向互補(bǔ)的堿基片段，優(yōu)選含有2～5個(gè)與P2序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段，本實(shí)施例中，P4含有3個(gè)與P5反向互補(bǔ)的堿基片段，相同堿基片段之間設(shè)有間隔臂序列，所述間隔臂序列優(yōu)選為3—10個(gè)T，本實(shí)施例中為設(shè)有3個(gè)T。表3一級(jí)信號(hào)放大探針的P4序列SEQIDNO.P4序列(5’→3’)25GATCTCTTTGATCTCTTTGATCTC26ATATCATTTATATCATTTATATCA27TATCTCTTTTATCTCTTTTATCTC28CACATCTTTCACATCTTTCACATC29TCACATTTTTCACATTTTTCACAT30ACATCATTTACATCATTTACATCA31CATCGATTTCATCGATTTCATCGA32TCAGTCTTTTCAGTCTTTTCAGTC33ACTCTCTTTACTCTCTTTACTCTC34ATCATCTTTATCATCTTTATCATC35ACATCCTTTACATCCTTTACATCC36TCAGTATTTTCAGTATTTTCAGTA2)二級(jí)信號(hào)放大探針本發(fā)明含有一條或以上的二級(jí)信號(hào)放大探針，所述二級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：與P4序列反向互補(bǔ)結(jié)合的P5序列、間隔臂序列、P6序列，所述P4含有一個(gè)或以上的P5序列反向互補(bǔ)堿基序列；本發(fā)明P5與P6序列之間的間隔臂序列可以選自5－10個(gè)T，本實(shí)施例使用的間隔臂為6個(gè)T。表4二級(jí)信號(hào)放大探針的P5序列SEQIDNO.P5序列(5’→3’)SEQIDNO.P5序列(5’→3’)37GAGATC43TCGATG38TGATAT44GACTGA39GAGATA45GAGAGT40GATGTG46GATGAT41ATGTGA47GGATGT42TGATGT48TACTGA所述P6序列含有一個(gè)或以上與三級(jí)信號(hào)放大探針的P7序列反向互補(bǔ)的堿基序列，優(yōu)選含有2-5個(gè)與P7序列互補(bǔ)配對(duì)的堿基片段，本實(shí)施例中，所述P6序列含有三個(gè)與P7序列反向互補(bǔ)片段，相同堿基序列之間設(shè)有間隔臂序列，間隔臂序列優(yōu)選為2—10個(gè)T，本實(shí)施例中為有2個(gè)T。表5二級(jí)信號(hào)放大探針的P6序列SEQIDNO.P6序列(5’→3’)49CATGATTCATGATTCATGA50ACGACTTACGACTTACGAC51GACTCTTGACTCTTGACTC52CAGTTTTCAGTTTTCAGTT53ACATGTTACATGTTACATG54AGCATTTAGCATTTAGCAT55CTAGATTCTAGATTCTAGA56ACGTGTTACGTGTTACGTG57GACGATTGACGATTGACGA58GCTGATTGCTGATTGCTGA59TCTGATTTCTGATTTCTGA60GTATCTTGTATCTTGTATC3)三級(jí)信號(hào)放大探針本發(fā)明所述三級(jí)信號(hào)放大探針從5’端到3’端依次為：P8序列、間隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一個(gè)或以上與P7序列反向互補(bǔ)序列；所述P8序列5’端還修飾有熒光基團(tuán)；本發(fā)明P7與P8序列之間的間隔臂序列可以選自3－10個(gè)T，本實(shí)施例使用的間隔臂為5個(gè)T。表6三級(jí)信號(hào)放大探針的P7序列SEQIDNO.P7序列(5’→3’)SEQIDNO.P7序列(5’→3’)61TCATG67TCTAG62GTCGT68CACGT63GAGTC69TCGTC64AACTG70TCAGC65CATGT71TCAGA66ATGCT72GATAC本實(shí)施例中，P8序列為5個(gè)堿基的polyT序列，其5’端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，熒光基團(tuán)可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，針對(duì)不同目標(biāo)核酸的熒光基團(tuán)互不相同，即所選擇的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長(zhǎng)互不相同，以便于區(qū)分不同類(lèi)型的目標(biāo)核酸。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的信號(hào)放大探針，除上述條件限定的特定探針?lè)聪蚧パa(bǔ)完全匹配的情況以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與整個(gè)檢測(cè)體系的其它核酸之間均不存在特異性結(jié)合的序列。實(shí)施例2一種肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)試劑盒本發(fā)明提供了一種肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能夠檢測(cè)靶標(biāo)miRNA包括：hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-297、hsa-miR-520b、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-602、hsa-miR-26a-5p以及hsa-miR-199a-5p等表達(dá)水平，在實(shí)際檢測(cè)中，能根據(jù)具體的需要，使用相應(yīng)的P1～P8序列，組成檢測(cè)試劑盒，即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。本實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的組分包括有：捕獲探針、信號(hào)放大探針和熒光基團(tuán)，具體探針組分見(jiàn)表7所示。本實(shí)施例所述檢測(cè)試劑盒，在使用時(shí)，隨機(jī)分成3組進(jìn)行檢測(cè)。表7針對(duì)具體目標(biāo)基因的檢測(cè)試劑盒(表格數(shù)字為SEQIDNO.)實(shí)施例3運(yùn)用實(shí)施例2中的試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)本實(shí)施例將使用實(shí)施例2的試劑盒，對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。肝癌細(xì)胞來(lái)源為：肝癌細(xì)胞株HuH-7，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細(xì)胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細(xì)胞株。所述各種溶液的配方如下：本實(shí)施例中的信號(hào)放大探針混合液均使用實(shí)施例3相應(yīng)列表中的全部探針。一、樣本預(yù)處理，將CTCs過(guò)濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清。2.加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過(guò)濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器中，打開(kāi)真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。三、消化細(xì)胞，暴露miRNA，使其與探針雜交1.配制相應(yīng)濃度的消化酶工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量消化酶1.25μLPBS48.75μL總體積50μL2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標(biāo)miRNA序列結(jié)合1.捕獲探針混合液、探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制捕獲探針工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量捕獲探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中捕獲探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時(shí)。5.去除液體，每孔加入1mlRI洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。五、目標(biāo)mRNA序列信號(hào)放大1.探針緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量信號(hào)放大探針混合液8μL探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μL總體積50.0μL渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時(shí)。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。六、顯色，熒光標(biāo)記目標(biāo)信號(hào)1.顯色緩沖液(40℃預(yù)熱)避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色緩沖液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。七、熒光顯微鏡觀察CTCs本發(fā)明的對(duì)照品使用DAPI作為細(xì)胞核熒光基團(tuán)，其發(fā)射藍(lán)色熒光信號(hào)。1.將濾膜細(xì)胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μL抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過(guò)20倍物鏡計(jì)數(shù)CTC異性核數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個(gè)異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計(jì)數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表8熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)八、檢測(cè)結(jié)果判斷及分析1.陽(yáng)性肝癌細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)在濾膜上，富集有肝癌細(xì)胞，肝癌細(xì)胞陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為：1)具有相應(yīng)靶標(biāo)miRNA特異性標(biāo)識(shí)物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在相應(yīng)的熒光通道下顯示熒光信號(hào)點(diǎn)。2)細(xì)胞核DAPI染色陽(yáng)性。3)肝癌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細(xì)胞大小與濾膜孔大小相近。2.使用上述檢測(cè)方法，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)和觀察，其中，針對(duì)細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測(cè)到熒光；針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)miRNA的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取每個(gè)樣本中10個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體結(jié)果為：表9樣本檢測(cè)結(jié)果(熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù))實(shí)施例4試劑盒的穩(wěn)定性1、試劑盒穩(wěn)定性檢測(cè)本發(fā)明提供一種肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)的試劑盒，所述的試劑盒針對(duì)不同的目標(biāo)檢測(cè)miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實(shí)現(xiàn)不同數(shù)量肝癌相關(guān)miRNA的并行檢測(cè)。本實(shí)施例將使用實(shí)施例2的探針組Group1組成的試劑盒，對(duì)三組不同細(xì)胞株來(lái)源的15種樣本(每種細(xì)胞株5個(gè)樣本)中的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)估本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性。2、關(guān)于檢測(cè)樣本來(lái)源本實(shí)施例使用肝癌的3中不同的細(xì)胞株來(lái)源的肝癌細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，從而驗(yàn)證其有效性和穩(wěn)定性(可重復(fù)性)，具體細(xì)胞株和樣本如表10所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)細(xì)胞株名稱，即可在現(xiàn)有產(chǎn)品中獲得相關(guān)的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例3。表10細(xì)胞株和檢測(cè)樣本樣本號(hào)肝癌細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組樣本16～樣本20HuH-7Group4樣本21～樣本25HepG2Group5樣本26～樣本30QGY-7701Group63、檢測(cè)結(jié)果使用上述試劑盒，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)和觀察，其中，針對(duì)細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測(cè)到熒光；針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)miRNA標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取每個(gè)樣本中10個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體結(jié)果為：表11樣本檢測(cè)結(jié)果(熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù))從上述檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，一方面，不同細(xì)胞株來(lái)源的樣本，其檢測(cè)結(jié)果不同，因此，本發(fā)明是能夠?qū)崿F(xiàn)不同miRNA表達(dá)水平檢測(cè)的，是有效的；另一方面，相同細(xì)胞株來(lái)源的5個(gè)樣本，其hsa-miR-138-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p等4中miRNA的熒光點(diǎn)數(shù)檢測(cè)結(jié)果相近(±3)，具體見(jiàn)Group4(樣本16～20)、Group5(樣本21～25)或Group6(樣本26～30)，因此，本試劑盒重復(fù)性好；由此可見(jiàn)，本發(fā)明試劑盒是有效的，穩(wěn)定性可靠的，其它針對(duì)不同miRNA種類(lèi)的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例5靶標(biāo)miRNA數(shù)量選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明提供一種靶標(biāo)miRNA檢測(cè)的試劑盒，所述的試劑盒針對(duì)不同的目標(biāo)檢測(cè)miRNA，選取不同數(shù)量的捕獲探針，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實(shí)現(xiàn)不同數(shù)量miRNA的并行檢測(cè)。本實(shí)施例分別針對(duì)1種、3種、5種、7種miRNA，選用捕獲探針，信號(hào)放大探針選擇一級(jí)信號(hào)方法探針、二級(jí)放大探針以及三級(jí)信號(hào)放大探針，組成檢測(cè)試劑盒，對(duì)同一細(xì)胞株HuH-7來(lái)源的樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比其檢測(cè)效果，具體組成如表12，所述探針選自實(shí)施例1～2，實(shí)驗(yàn)步驟參考實(shí)施例3。表12選擇不同數(shù)量靶標(biāo)miRNA的捕獲探針(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)和觀察，其中，針對(duì)細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測(cè)到熒光；針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)miRNA標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取每個(gè)樣本中10個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體結(jié)果為：表13樣本檢測(cè)結(jié)果(熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù))通過(guò)上述4組實(shí)驗(yàn)對(duì)比可知，本試劑盒可以針對(duì)不同數(shù)量的靶標(biāo)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，使用1條、3條和5條、7條的針對(duì)不同miRNA捕獲探針均可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好。其它針對(duì)標(biāo)志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例6標(biāo)記探針的選擇1、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)放大探針組合的選擇)本發(fā)明提供一種肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)的試劑盒，所述的試劑盒針對(duì)不同的目標(biāo)檢測(cè)miRNA，選取不同信號(hào)探針組合，組成相應(yīng)的探針混合液，從而實(shí)現(xiàn)miRNA的并行檢測(cè)。本實(shí)施例將使用實(shí)施例1的所提供的各級(jí)信號(hào)放大探針組成的試劑盒，對(duì)同一細(xì)胞株(HuH-7)來(lái)源的5個(gè)樣本中的hsa-miR-138-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-326和hsa-miR-181b-5p表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，從而評(píng)估本發(fā)明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信號(hào)放大探針的適用性。具體的試劑盒組成如下：表14不同信號(hào)放大探針組合(表格數(shù)字為SEQIDNO.)2、使用上述試劑盒，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)(應(yīng)用實(shí)施例3所述檢測(cè)方法)和觀察，其中，針對(duì)細(xì)胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否檢測(cè)到熒光；針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)miRNA標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取每個(gè)樣本中10個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的miRNA熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體結(jié)果為：表15不同信號(hào)放大探針組合的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)上述3組實(shí)驗(yàn)對(duì)比可知，使用不同信號(hào)探針組合組成的試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果相一致，除了本實(shí)施例檢測(cè)的miRNA以及其放大探針組合外，本發(fā)明所提供的其他miRNA以及其他信號(hào)放大探針的組合，同樣能實(shí)現(xiàn)本實(shí)施例的檢測(cè)效果，具體試驗(yàn)結(jié)果省略。由此可知，本發(fā)明提供的信號(hào)放大探針可以根據(jù)實(shí)際操作需要進(jìn)行任意搭配，并且能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的miRNA檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明本發(fā)明所提供的信號(hào)放大探針對(duì)于肝癌相關(guān)miRNA檢測(cè)具有良好的適用性。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3