茄子SmHY5蛋白及其編碼基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及茄子光信號通路中的關鍵酶及其編碼基因，具體 涉及一種前子SmHY5(Long Hypocotyl 5)蛋白及其編碼基因。
【背景技術】
[0002] HY5是最早被發(fā)現(xiàn)的正調控光形態(tài)建成的轉錄因子，其編碼的蛋白序列分析顯示， HY5屬于基本的亮氨酸型拉鏈(b-ZIP)型轉錄因子，它定位于細胞核，能夠與多種光調控基 因的啟動子直接結合來調控這些基因的表達。對HY5蛋白水平的研究發(fā)現(xiàn)，HY5蛋白積累受 到光的調控，持續(xù)黑暗條件下生長的擬南芥幼苗體內的HY5蛋白大部分被降解，幾乎檢測不 到HY5蛋白的積累；而在照光條件下，HY5蛋白可以迅速積累；這種HY5的降解依賴于26S泛素 蛋白酶體降解途徑，而調控HY5降解的E3泛素連接酶正是光形態(tài)建成負調控因子C0P1。黑暗 條件下由于COP 1定位在細胞核，降解了體內大部分的HY5蛋白，而在光照條件下，COP 1由細 胞核轉移到細胞質，對HY5的降解得到解除而大量積累，這樣HY5就可以行使功能了。
[0003]目前已從很多植物中克隆得到HY5基因，如擬南芥、葡萄、蘋果、玉米等。茄子是重 要的蔬菜作物，但相關研究相對比較滯后。目前，未有任何與茄子HY5基因及其編碼蛋白的 相關文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的在于填補茄子HY5基因的空白。本發(fā)明提供 了一種茄子HY5的cDNA以及氨基酸序列；進一步地，本發(fā)明提供了茄子SmHY5基因在不同組 織器官的表達模式。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種茄子HY5蛋白，包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 [0007]第二方面，本發(fā)明提供一種編碼茄子HY5蛋白的基因核酸序列，所述基因的cDNA序 列包括：
[0008] (a)如SEQ ID NO. 1第1~477位所示的堿基序列；或
[0009] (b)與SEQ ID NO. 1第1~477位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿基序 列;或
[0010] (c)能與SEQ ID NO. 1第1~477位所示的堿基序列進行雜交的堿基序列。
[0011] 優(yōu)選地，所述cDNA序列包括SEQ ID NO.1第1~477位所示的核酸序列中1~90個核 苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內核苷酸。
[0012] 第三方面，本發(fā)明提供一種用于擴增所述基因的引物對，所述引物對的堿基序列 如SEQIDN0·3、SEQIDN0·4所示。
[0013] 第四方面，本發(fā)明提供一種編碼茄子SmHY5蛋白的基因的熒光定量PCR分析的引物 對，所述引物對的堿基序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID N0.6所示。
[0014] 第五方面，本發(fā)明提供一種編碼茄子SmHY5蛋白的基因在基因工程調控植物在光 下生長狀況的用途。
[0015]優(yōu)選地，所述植物包括擬南芥。
[0016] 在本發(fā)明中，術語"SmHY5基因編碼序列"指SEQ ID N0.1所示的第1~477位核苷酸 序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~477位核苷酸中，有一 個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡 并性，所以與SEQ ID NO. 1所示的第1~477位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也 能編碼出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列 的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0017] 該術語還包括能編碼具有與天然的茄子SmHY5相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內核苷酸。
[0018] 在本發(fā)明中，可用實時熒光定量PCR的方法分析茄子SmHY5基因產物的表達模式， 即分析茄子SmCOPl基因的mRNA轉錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。
[0019] 此外，根據(jù)本發(fā)明的茄子SmHY5核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表 達蛋白質的同源性基礎上，篩選茄子SmHY5相關同源基因或同源蛋白。
[0020] 為了得到與茄子SmHY5相關基因的點陣，可以用DNA探針篩選茄子CDNA文庫，這些 探針是在低嚴謹條件下，用 32P對茄子SmHY5相關的全部或部分做放射活性標記而得的。適合 于篩選的cDNA文庫是來自茄子的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法 是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自 Clontech, Stratagene，Palo Alto，Cal ·。這種篩選方法可以識別與前子SmHY5相關的基因 家族的核苷酸序列。
[0021] 本發(fā)明的茄子SmHY5相關核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法 或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是 開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制 備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴 增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0022] 當獲得了有關序列后，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其 克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0023] 此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0024] 光信號能調控許多次生代謝途徑，例如花青素的合成。茄子是廣泛種植的蔬菜作 物，紫色茄子的果皮含有豐富的花青素。近年來的研究結果表明，紫色茄子的抗氧化保健作 用在常見蔬菜作物中是最好的。
[0025] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0026] 1、將SmHY5基因在擬南芥突變株hy5中表達，茄子HY5基因具有與擬南芥HY5基因相 似的功能。
[0027] 2、本發(fā)明針對目前茄子研究基礎薄弱的現(xiàn)狀，克隆光信號通路中的關鍵基因 SmHY5基因，為今后利用基因工程技術改良植物品質，獲得具有高抗氧化性的藥物或食物提 供理論依據(jù)，具有很大的應用價值。
【附圖說明】
[0028]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0029]圖1為本發(fā)明的茄子HY5蛋白與番茄HY5蛋白的氨基酸序列同源比較(FASTA)結果， 其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出；
[0030]圖2為本發(fā)明的茄子HY5基因在不同組織的表達情況；
[0031 ] 圖3為轉SmHY5基因植株的RT-PCR檢測；
[0032]圖4為轉SmHY5基因對擬南芥突變株hy5的表型恢復情況。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術 人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明 的保護范圍。
[0034]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0035] 實施例1、茄子SmHY5基因的克隆
[0036] 1.植物材料的獲得
[0037] 本實驗所用的植物材料為茄子優(yōu)良種質資源藍山禾線茄。實驗材料栽培于上海市 閔行區(qū)浦江鎮(zhèn)航天育種基地的人工塑料大棚中。在自然條件下育苗，生長并結實。采集茄子 的葉片用于提取RNA。
[0038] 2.RNA 的提取
[0039] 采用TRIzol法提取總RNA(TRIzol購自生工生物工程(上海)股份有限公司）。用甲 醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計(Thermo Scientific NAN0DR0P 1000 Spectrophotometer)上測定RNA的純度及濃度。
[0040] 3.基因的全長克隆
[0041 ] 基于Genbank中HY5基因的保守序列設^ -對簡并引物。將提取RNA進行反轉錄 (Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit:寶生物工程（大連）有限公司），以第 一鏈cDNA為模板，利用引物
[0042] FI (SEQ ID ^.3):57 -ATGCARGARCAAGCGACRAGYTC-37
[0043] R1(SEQ ID N0.4)：57-YTACTTCCKCCCTTCCTGTGCAC-37
[0044] 進行PCR，擴增得到預期長度后回收并連接到pMD-19T(寶生物工程(大連)有限公 司）載體上，轉化大腸桿菌DH5a，利用α互補及菌落PCR篩選陽性克隆，送至英濰捷基（上海） 貿易有限公司進行測序，得cDNA序列SEQ ID Ν0.1。
[0045] 實施例2、茄子HY5基因的序列信息與同源性分析
[0046] 本發(fā)明新的茄子HY5基因全長CDS開放讀框序列為477bp，詳細序列見SEQ ID NO. 1。根據(jù)CDS開放讀碼框序列推導出前子HY5的氨基酸序列，共158個氨基酸殘基，分子量 為17453.4道爾頓，理論等電點(pi)為9.64,詳細序列見SEQ ID NO.2所示序列。
[0047]將茄子HY5的⑶S開放讀框序列及其編碼蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations