一種含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載 體及所述植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] harpin蛋白，是一種由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的能在非寄主植物上激發(fā) HR (hypersensitive response)反應(yīng)的蛋白，是一類能誘導(dǎo)抗病性的蛋白類激發(fā)子。20年 來的研究表明，harpin蛋白在病原細(xì)菌與植物互作中扮演了多重角色，但目前對在病菌侵 染期間harpin蛋白與植物相互作用的確切機(jī)制仍不是十分清楚，harpin蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程的 順利與否和它功能的發(fā)揮密不可分。
[0003] 在前期研究中，發(fā)明人從棉花角斑病菌Z. citri subsp. (a synonym ofXanthomonascampestrispv.malvacearum(Smith 1901) Dye 1978, Xcm), 首次鑒定了新的harpin類蛋白------hpaXm。hpaXm具有harpin的共同特性，并且定位于 A/y?區(qū)域。hpaXm能激發(fā)HR,激發(fā)煙草對TMV的抗性。特別地，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示N 端的第1-15個氨基酸為信號肽類似序列（signal peptide)，并且，缺失信號肽類似序列的 不能被大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌出胞外但純化后仍能激發(fā)HR反應(yīng)。
[0004] 為了探究N端前1-15個氨基酸對于hpaXm蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的互作結(jié)合位點(diǎn) 及泌出情況的影響，以及hpaXm蛋白的內(nèi)源表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植物抗性的影響，必須構(gòu)建該目 的基因的植物表達(dá)載體才能進(jìn)行一系列的探究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載體，具有 后期操作快捷簡單，便于觀察等特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提出了一種植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，步驟合理，便于推 廣。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載體，包括pB121載體和連接在所述pB121 載體上，能夠編碼hpaXm蛋白的基因片段。
[0008] 進(jìn)一步，所述植物表達(dá)載體包括pBI121-A/?a為和pBI121 Z/*。
[0009] 所述植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： a) 目的基因全長如aZm或缺失信號肽類似序列的突變體如aZffiZl 擴(kuò)增； b) 將融合基因片段克隆到pMD?18-T載體中； c) 將融合基因轉(zhuǎn)移到PBI121載體上。
[0010] 進(jìn)一步，步驟C中，以PBI121載體上的為<3席卩及以作為酶切位點(diǎn)。
[0011] 為了從多角度觀察hpaXm及其缺失信號肽類似序列的hpaXm A LP在植物體內(nèi)的 表達(dá)及定位，使添加和未添加gfp (綠色突光蛋白）的hpaXm及hpaXm A LP作為平行實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行比對及驗(yàn)證，獲得更加科學(xué)以及更加具有說服力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)與檢測的 實(shí)行，發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的創(chuàng)造。
[0012] 所述含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載體，除包括pBI 121載體和連接在所述 PBI121載體上，能夠編碼hpaXm蛋白的基因片段外，還包括表達(dá)綠色熒光蛋白的基因於方。
[0013] 進(jìn)一步，所述與所述相互融合。
[0014] 進(jìn)一步，所述植物表達(dá)載體包括pBI 12為和pBI 121- 為Zl ，^令。
[0015] 所述含有^的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟： (1)根據(jù)目的基因如.? #或如序列，和載體pBI121序列選擇酶 切位點(diǎn)席P ZaaJ并設(shè)計引物。
[0016] (2)融合基因 為????#_/>或 為Zl 的擴(kuò)增； (3) 以PCR產(chǎn)物為模板重疊延伸獲得融合基因片段； (4) 將融合基因片段克隆到pMD?18-T載體中； (5) 將融合基因連接到pBI 121載體上。
[0017] 進(jìn)一步，步驟b中，以切膠回收純化具有重疊鏈的基因片段如 因和基因作為模板，進(jìn)行PCR重疊延伸，且該過程分為兩步，分別為： (2a) PCR反應(yīng)體系中不加引物進(jìn)行擴(kuò)增； (2b)在第一步的反應(yīng)體系中補(bǔ)加兩端引物進(jìn)行擴(kuò)增； 所述步驟（3)中，包含以下步驟： (3a)將擴(kuò)增得到的基因片段3'端沒有加上A堿基，在與T載體進(jìn)行連接之前進(jìn)行加A 處理； (3b)融合基因與pMD?18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中； (3c)陽性重組子的鑒定和測序。
[0018] 進(jìn)一步，所述步驟（4)中，以pBI121載體上的為<3席卩作為酶切位點(diǎn)。
[0019]本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明中的含有編碼hpaXm蛋白基因的植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化模式植物或者其他 作物中將目的基因如及如合到植物基因組中，利用免疫膠體金等方法檢測 目的基因在植物中的表達(dá)、定位及泌出情況。
[0020] 2)進(jìn)一步，本發(fā)明中將編碼目的蛋白與綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein)的融合基因整合到植物基因組后，將使我們能更直觀地從顯微鏡下觀察到融合基 因的表達(dá)情況以及所表達(dá)的目的蛋白在植物細(xì)胞中的互作結(jié)合位點(diǎn)以及泌出情況。
[0021] 3)本發(fā)明的構(gòu)建方法設(shè)計合理，便于操作推廣。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0023] 圖1為融合基因重置PCR不意圖； 圖2 :pBI121-如為模板擴(kuò)增目的基因； 圖3 :pBI121-如Z八v^f/7為模板擴(kuò)增目的基因； 圖4郵1121-如<3為::1^為模板擴(kuò)增目的基因 ； 圖5 :pBI121-如Z八v^f/7為模板擴(kuò)增目的基因。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明公開的方法，進(jìn)行如下操作： 實(shí)施例1 構(gòu)建pB1121_如aZffl植物表達(dá)載體 1. 目的基因片段^他/7)的擴(kuò)增及缺失信號肽類似序列的突變體Xmal-hpaXmALP-Xbal(360bp)'^\ 貧譚 根據(jù)目的基因序列及PBI121序列選取酶切位點(diǎn)設(shè)計目的基因擴(kuò)增引物。 目的基因片段PCR擴(kuò)增參數(shù)如下所述。
[0026] PCR 反應(yīng)體系（50iiL ): 模板(質(zhì)粒） 2iiL 上游引物 luL 下游引物 1UL lOXBuffer 5 u L 2. 5mMdNTP 4u L (Trans)THq-TDNA polymerase 1 u L 補(bǔ)足超純水至50 ii L 其中模板使用從棉花角斑病菌（X.)中克隆出來的攜帶有如al全長序列的質(zhì)粒 pHMl-如幽（由本實(shí)驗(yàn)室保存)，擴(kuò)增如a磁長基因使用引物為HpaXm-F(5, -GCTCTAGAAT GAAITCITTGAACACACAGA-3'）和 HpaXm-R (5'-TCCCCCCGGGTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC-3,）； 擴(kuò)增如因所使用的引物為下游引物為HpaXm A LP-F(5' -GCTCTAGAATGCAG GTCGACCCGAGCCAGA-3,）和 HpaXm-R (5,-TCCCCCCGGGTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC-3' ） PCR反應(yīng)條件為： 94 °C預(yù)變性4min; -94°C變性 30sec ; J 58°C復(fù)性30sec ; 30個循環(huán) 72°C延伸 lmin ; 最后72°C延伸lOmin。
[0027] 取少量PCR產(chǎn)物按照前述方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片 段大小一致，然后將剩余的PCR產(chǎn)物用大孔的膠進(jìn)行電泳，并回收DNA片段。按照上述方法 得到的如為hpaXm A LP基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖1和圖2)。
[0028] 2.將目的基因片段與pMD?18-T載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中 反應(yīng)體系10 u L pMD18_T simple vector 0. 5 u L Control Insert 0. 5 u L 切膠回收產(chǎn)物 4uL Solution Buffer 5 u L 反應(yīng)條件16 °C連接過夜 (1)在微型離心管里加入luL T載體和4uL的融合基因片段。
[0029] (2)輕輕混合，室溫（20°C -37°C)反應(yīng)15分鐘，將離心管置于冰上。
[0030] (3)加連接產(chǎn)物于50 ii L Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時加