一種抗炎環(huán)肽Cyclosquamosin D的化學(xué)合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是環(huán)（亮氨酰-絲氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)肽 Cyclosquamosin D 是 TNF 和 IL-6 的抑制劑，具有抗炎作用（1^;1^:]\481·;^· Food Chem. 2008, 56, 386-392)。目前關(guān)于環(huán)膚Cyclosquamosin D功能性方面的研究是一 個(gè)熱點(diǎn)方向。但是市場上對環(huán)肽Cyclosquamosin D的合成方法仍處于初級階段，本發(fā)明可 以有效的提高產(chǎn)物的成功率和收率，降低合成的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種固相合成環(huán)肽Cyclosquamosin D的方法。本發(fā)明的技 術(shù)方案為：環(huán)肽Cyclosquamosin D的一種固相合成方法，包括以下步驟：
[0004] 1.以Fm〇C-Val-OH等為原料合成直鏈八肽亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔 丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸。
[0005] 2.使用PyBop，HOBt和DIEA體系對直鏈肽進(jìn)行液相環(huán)合，最后在TFA/DCM (1 : 4) 作用下脫去保護(hù)基得到環(huán)肽Cyclosquamosin D。
[0006] 具體反應(yīng)步驟為：
[0007] (l)Fmoc-Val-OH和2-氯三苯甲基氯樹脂溶解到適量的二氯甲烷中，加入DIPEA， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，合成的N-芴甲氧羰基纈氨酸-2-氯三苯甲酯再經(jīng)過20%的哌啶脫保護(hù) 得到纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂。
[0008] ⑵將Fmoc-Gly-ΟΗ加入到纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂溶液中，室溫?cái)嚢瑁偌尤?DMF，DCC，HOBt，反應(yīng)4h，得到N-芴甲氧羰基甘氨酰-纈氨酸2-氯三苯甲酯樹脂，經(jīng)過20 % 的哌啶脫保護(hù)后得到甘氨酰-纈氨酸2-氯三苯甲酯樹脂。后面的6個(gè)氨基酸按相同的方 法依次反應(yīng)生成帶有直鏈八肽的樹脂，亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪 胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂樹脂。
[0009] (3)用乙酸/三氟乙酸/二氯甲烷（1 : 2 : 16)體系將直鏈八肽從樹脂上切下， 得到直鏈八膚 NH2-Leu-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Tyr (tBu) -Pr〇-Gly-Gly-Val-C00H。
[0010] (4)將直鏈八膚 NH2-Leu-Ser (tBu)-Tyr (tBu)-Tyr (tBu)-Pr〇-Gly-Gly-Val-C00H 溶于二氯甲烷，加入PyBop，HOBt，DIEA，冰浴下攪拌反應(yīng)，生成環(huán)（亮氨酰-絲氨酰（叔丁 基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽。
[0011] (5)將環(huán)（亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽，在TFA/DCM(1 : 4)作用下脫去保護(hù)基得到環(huán)肽 Cyclosquamosin D〇
[0012] 本發(fā)明中的一些縮寫具有以下含義：
[0013] Fmoc :荷甲氧羰基
[0014] DMF :N，N-二甲基甲酰胺
[0015] DCC :二環(huán)己基碳二亞胺
[0016] HOBt : 1-羥基苯并三唑
[0017] PyBop :六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
[0018] DIEA:二異丙基乙胺
[0019] TFA:三氟乙酸
[0020] DCM:二氯甲烷
[0021] Sephadex LH-20 :輕丙基葡聚糖凝膠
[0022] NH2-Leu-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Tyr (tBu) -Pro-Gly-Gly-Val-COOH :亮氨醜-絲氨醜 (叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸
[0023] 合成路線如下：
[0024]
[0025] Scheme 1. Reagents and conditions ： (a) (i) Fmoc-Val-〇H/DCM, DIPEA, lh(ii)20 % piperidine/DMF,2h ； (b) (i)Fmoc-aa-〇H/DMF, DCC, HOBt,4h(ii)20 % piperidine/DMF,2h ； (c)Ac0H/TFE/DCMl ： 2 ： 16,lh(70%).
[0026]
[0027] Scheme 2. Reagents and conditions ：(d)PyBop, HOBt, DIEA, DCM,0°C (82% )； (e)TFA/DCM(l ： 4)(/8%).
【具體實(shí)施方式】：
[0028] 實(shí)施例1，參照合成路線schemel，F(xiàn)moc-Val-OH(507mg，1. 5eq)，2-氯三苯甲基氯 樹脂（lg，）溶解在無水DCM(20mL)中，加入DIPEA(0.52mL，3eq)，室溫反應(yīng)lh，用甲醇和二 氯甲烷洗滌樹脂，干燥后加入20%的哌啶（20mL)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，脫去Fmoc，再用二氯甲 烷（20mL)洗滌樹脂，真空干燥，得到纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂。將Fmoc-甘氨酸（450mg， 1.5eq)溶于DMF(lOmL)和DCM(lOmL)中，用H0Bt(304mg)活化，再將該溶液加入到纈氨 酸-2-氯三苯甲酯樹脂中，冰浴下加入DCC(464mg)，然后撤去冰浴，室溫反應(yīng)4h。再用上 述相同的方法脫去Fmoc。后面的氨基酸用相同的方法連接上去，最后得到含有直鏈八肽的 樹脂，亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨 酰-甘氨酰-纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂樹脂。將獲得的樹脂在乙酸/三氟乙酸/二氯甲 烷1 : 2 : 16(20mL)中室溫反應(yīng)lh，過濾，樹脂用DCM(15mL)洗滌3次，濾液真空濃縮，可 得直鏈八肽亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰-纈氨酸。
[0029] 實(shí)施例2,參照合成路線scheme2,將HOBt (329mg，溶于少量無水DMF)， PyB0P(l. 27g)和DIPEA(0. 49mL)溶于無水DCM中倒入圓底燒瓶，將直鏈八肽亮氨酰-絲氨 酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸 溶于DCM(0. 5mg/mL)，0°C下滴加到圓底燒瓶中，快速攪拌，滴加完后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。蒸 去溶劑，用S印hadex LH-20處理得到固體環(huán)（亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁 基）_酪胺酰（叔丁基）_脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽。得到的環(huán)肽加入TFA/ DCM(1 : 4,20ml)室溫?cái)嚢鑜h，脫去tBu保護(hù)基得到環(huán)肽Cyclosquamosin D粗品。粗品用反 相 HPLC(RP-HPLC)純化，流動相用 water/acetonitrilel : 1，可獲得純的 Cyclosquamosin D〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1.環(huán)（亮氨酰-絲氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽的 合成方法包括以下步驟： (1) 將N-芴甲氧羰基纈氨酸溶解在二氯甲烷中，加入2-氯三苯甲基氯樹脂，N，N-二異 丙基乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，生成的N-芴甲氧羰基纈氨酸-2-氯三苯甲酯經(jīng)過20%的哌啶 脫保護(hù)得到纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂。 (2) 將N-芴甲氧羰基甘氨酸加入到纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂溶液中，室溫?cái)嚢瑁?加入二環(huán)己基碳二亞胺，1-羥基苯并三唑和N，N-二甲基甲酰胺，反應(yīng)4h，得到N-芴甲氧羰 基甘氨酰-纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂，該產(chǎn)物再經(jīng)過20 %的哌啶脫保護(hù)得到甘氨酰-纈 氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂。后面的6個(gè)氨基酸按相同的方法依次反應(yīng)生成帶有直鏈八肽的 樹脂，亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨 酰-甘氨酰-纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂。 (3) 將亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘 氨酰-甘氨酰纈氨酸-2-氯三苯甲酯樹脂用乙酸/三氟乙酸/二氯甲烷1 : 2 : 16脫去 2_氯三苯甲基氯樹脂，得到直鏈八肽亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺 酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸。 (4) 將直鏈八肽亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酸溶于二氯甲烷，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡 咯烷基，1-羥基苯并三唑和二異丙基乙胺，冰浴下攪拌反應(yīng)，生成環(huán)（亮氨酰-絲氨酰（叔 丁基）-酪胺酰（叔丁基）-酪胺酰（叔丁基）-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽。 (5) 將環(huán)（亮氨酰-絲氨酰（叔丁基）_酪胺酰（叔丁基）_酪胺酰（叔丁基）_脯 氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰）肽，在TFA/DCM(1 : 4)作用下脫去保護(hù)基得到環(huán)肽 CyclosquamosinD〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及環(huán)(亮氨酰-絲氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰)肽的一種合成方法。主要合成步驟：a.將Fmoc-Val-OH引入到2-氯三苯甲基氯樹脂后，利用Fomc氨基酸保護(hù)與哌啶脫Fmoc保護(hù)策略，固相合成直鏈八肽NH2-Leu-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Val-COOH。b.利用PyBOP/HOBt/DIPEA體系對得到的直鏈肽進(jìn)行液相環(huán)合，再利用TFA/DCM(1∶4)脫去叔丁基保護(hù)即可得到目標(biāo)環(huán)(亮氨酰-絲氨酰-酪胺酰-酪胺酰-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-纈氨酰)肽。本發(fā)明具有有效的提高產(chǎn)物的成功率和收率，降低合成的成本的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C07K1/04, C07K1/06, C07K7/64
【公開號】CN105440110
【申請?zhí)枴緾N201410471159
【發(fā)明人】孫良玉, 夏斌
【申請人】上海翱博生物科技有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月16日