一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌及其在促進(jìn)連作西瓜生長中的應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一株鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)細(xì)菌及其在促進(jìn)連作西瓜生長中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
】[0002]中國是世界上最大的西瓜產(chǎn)地，種植面積約占世界總種植面積的55%，并占世界總產(chǎn)量的70%以上。但是隨著西瓜的連年種植，連作障礙已經(jīng)成為我國西瓜栽培中重要瓶頸之一（柯用春，王爽，任紅，等.強化還原處理對海南西瓜連作障礙土壤性質(zhì)的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志，2014,33(4):880-884;徐偉慧，吳鳳芝，王志剛，等.連作西瓜光合特性及抗病性對小麥伴生的響應(yīng)[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014,22(6):655-660.)。通過增施化肥和農(nóng)藥等方法來緩解連作障礙具有高污染和高風(fēng)險的缺點，近些年來，植物根際促生菌在緩解連作障礙上的研究正在興起，有報道指出土壤經(jīng)過不同種類微生物接種后能夠有效增加植物生長所必需的各類營養(yǎng)元素（夏覓真，馬忠友，曹媛媛，等.棉花根際固氮菌、解磷菌及解鉀菌的相互作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010,22(2):102-105.)，促進(jìn)有益微生物群落大量繁殖，抑制有害菌生長，減少病菌積累（馬玲，馬琨，湯夢潔，等.間作與接種AMF對連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2013,22(8):1341-1347.LEESW，LEESH，BALARAJUK，etal.Growthpromotionandinduceddiseasesuppressionoffourvegetablecropsbyaselectedplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR)strainBacilussubtilis21-lundertwodifferentsoilconditions[J].ActaPhysiologiaePlantarumj2014,36(6):1353-1362.LANDABB,M0NTES-B0RREG0MjNAmS-CORTESJA.UseofPGPRforControllingSoilborneFungalPathogens：AssessingtheFactorsInfluencingItsEfficacy[M]//BacteriainAgrobiology：DiseaseManagement.SpringerBerlinHeidelberg，2013:259-292.)，幫助植物建立良好的根際生長條件（HAYATR，AHMEDI，SHEIRDILRA.Anoverviewofplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR)forsustainableagriculture[M]//CropProductionforAgriculturalImprovement.SpringerNetherlands,2012:557-579.MEHTAPjWALIAAjCHAUHANAjetal.Plantgrowthpromotingtraitsofphosphate-solubilizingrhizobacteriaisolatedfromappletreesintransHimalayanregionofHimachalPradesh[J].Archivesofmicrobiology，2013,195(5):357-369.)，這些報道充分顯示了微生物在防治連作障礙上的潛質(zhì)D[0003]磷是植物生長所必須的重要營養(yǎng)元素之一（趙國杰，牛世全，達(dá)文燕，等.四株無機解磷菌處理堿化土壤的理化性質(zhì)及質(zhì)量評價[J].土壤通報，2014,45(4):996-1002.SINDHUSSjPHOURMjCH0UDHARYSRjetal.PhosphorusCycling：ProspectsofUsingRhizosphereMicroorganismsforImprovingPhosphorusNutritionofPlants[M]//GeomicrobiologyandBiogeochemistry.SpringerBerlinHeidelberg,2014:199-237.)?解磷菌能夠?qū)⑼寥乐胁荒鼙恢参镂盏挠袡C磷轉(zhuǎn)化為可被植物直接利用的有效磷，增加土壤含磷量（王光華，趙英，周德瑞，等.解磷菌的研究現(xiàn)狀與展望[J].生態(tài)環(huán)境，2003,12(1):96-101.王志剛，徐偉慧，莫繼先，等.東北黑土區(qū)大豆根際促生菌群落組成研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012,20(5):592-596.)，促進(jìn)植物磷攝取。此外，解磷菌在代謝過程中還能夠分泌生長激素，促進(jìn)植物生長，緩解連作導(dǎo)致的植株發(fā)育不良，為農(nóng)作物產(chǎn)量的增大提供有利條件。[0004]本發(fā)明經(jīng)篩選和鑒定得到了一株鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)細(xì)菌，其最大解磷量可達(dá)到642.60mg/L，IAA最大分泌量可達(dá)到22.87mg/L，此外，本發(fā)明還研究了其對連作西瓜幼苗生長的影響，以期為利用微生物緩解西瓜連作障礙提供技術(shù)支持?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)細(xì)菌，該細(xì)菌具有較高的解磷能力，能夠優(yōu)化西瓜根系形態(tài)，改善根系組成，可有效緩解西瓜連作障礙，對連作西瓜植株具有明顯的促生效應(yīng)；[0006]本發(fā)明的目的之二是提供所述分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)細(xì)菌在促進(jìn)連作西瓜植株生長、緩解西瓜連作障礙中的應(yīng)用。[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：[0008]本發(fā)明的一株經(jīng)分離獲得的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.)細(xì)菌，命名為Sphingomonassp.CLO1，分類命名為鞘氨醇單胞菌屬CLO1，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其微生物保藏號是CCTCCNO:M2015198,保藏日期為2015年4月6曰。[0009]本發(fā)明發(fā)明人于2014年3月采集黑龍江省齊齊哈爾市某園林中的植物根際土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通過濃度梯度稀釋，得到104、105、106濃度土壤懸液，平板涂布后，存放于28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5d，挑取解磷圈較大的單菌落進(jìn)行純化。將純化菌株制作種子液，按1%的接種量接入液體蒙金娜培養(yǎng)基，在28°C、120r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，取上清液通過鉬銻抗比色法進(jìn)行解磷能力的測定。對比各菌株解磷值，選取解磷能力最高的一株進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示，篩選后得到解磷能力最強的菌株CL01，鑒定為Sphingomonassp.，最大解磷量可達(dá)到642.60mg/L，IAA最大分泌量可達(dá)到22.87mg/L，經(jīng)0D_nni=0.50和OD_ηηι=1.00濃度的菌液分別處理后，結(jié)果顯示連作西瓜幼苗根干重、根長、根體積、根尖個數(shù)和毛根（〇.00mm<d彡0.50mm)比例均顯著增加，根系平均直徑均顯著降低；相比較而言，使用濃度〇D_nni=0.50的菌液處理促進(jìn)連作西瓜幼苗生長的效果更好，且用量少。[0010]因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了以上所述的鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌Sphingomonassp.CLOl在促進(jìn)連作西瓜生長、緩解西瓜連作障礙中的應(yīng)用。[0011]其中，所述的促進(jìn)連作西瓜生長以及緩解西瓜連作障礙主要包括增加幼苗的根干重、根長、根體積、根尖個數(shù)和毛根比例，以及降低根系平均直徑等等。[0012]綜上所述，經(jīng)本發(fā)明分離獲得Sphingomonassp.CLOl具有較高的解磷能力，可分泌IAA，且能夠優(yōu)化西瓜根系形態(tài)，改善根系組成，可有效緩解西瓜連作障礙，在緩解西瓜連作障礙方面具有較好的利用前景。【附圖說明】[0013]圖1為各菌株48h時水溶性磷含量；[0014]圖2為Sphingomonassp.CLOl系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；[0015]圖3為Sphingomonassp.CLOl生長曲線（a)及接菌后IAA濃度變化（b);[0016]圖4為不同處理西瓜根系形態(tài)掃描圖譜。【具體實施方式】[0017]下面結(jié)合具體實施例和附圖來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。[0018]實施例1菌株Sphingomonassp.CLOl的分離純化和鑒定[0019]1材料與方法[0020]I.1培養(yǎng)基[0021]蒙金娜有機培養(yǎng)基（IL):葡萄糖10.00g，（NH4)2SO40·50g，MgSO4·7H200·30g，NaCl0.30g，KCl0.30g，F(xiàn)eSO4·7Η200.03g，MnSO4.H2O0.03g，卵磷脂0.20g，CaCO3I.00g，酵母粉〇.50g，瓊脂20.00g，蒸餾水定容至1000.00ml，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。[0022]L2解磷菌株粗篩[0023]于2014年3月采集黑龍江省齊齊哈爾市某園林中的植物根際土壤，采用抖土法收集根系表面土壤，通過濃度梯度稀釋，得到104、105、106濃度土壤懸液，平板涂布后，存放于28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5d，挑取解磷圈較大的單菌落進(jìn)行純化。[0024]1.3解磷菌株解磷能力測定及篩選[0025]I.3.1磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[0026]分別將2μg/ml的磷標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋為含磷量為0.00μg/ml、0.04μg/ml、0·08μg/ml、0.24μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml、I.20μg/ml制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在室溫下加入鉬銻抗顯色劑，顯色20min，測得吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0·5256χ+0·0359,相關(guān)系數(shù)R2=0·9945。[0027]1.3.2解磷能力測定與篩選[0028]對純化菌株進(jìn)行種子液制備，具體方法如下：使用接種環(huán)挑取純化菌株的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28°C、120r/min的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，通過分光光度計測定菌液吸光值（〇D6_J，確定其對數(shù)生長期，使用對數(shù)生長期菌液作為種子液。[0029]按1%(v/v)的接種量將種子液接入液體蒙金娜培養(yǎng)基，在28°C、120r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24h取5.OOml菌懸液在4000r/min下離心20min，取上清液通過鉬鋪抗比色法進(jìn)行解磷能力的測定。對比各菌株解磷值，選取解磷能力最高的一株進(jìn)行后續(xù)實驗。[0030]1.4菌株鑒定與生長曲線測定[0031]對篩選菌株進(jìn)行形態(tài)和16SrDNA分類鑒定，采用Mega5.0制作進(jìn)化樹。挑取篩選菌株單菌落接種于100.0Oml液體蒙金娜培養(yǎng)基中，28°C，120r/min搖瓶培養(yǎng)，每4h測定吸光值（〇D6_J，制作菌株生長曲線。[0032]I.5IAA分泌量測定[0033]I.5.IIAA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定[0034]標(biāo)準(zhǔn)曲線采用分析純IAA進(jìn)行制備，將50.00μg/ml的IAA標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋為0·00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、30.00μg/ml、40.00μg/ml、50.00μg/ml，測定標(biāo)曲，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0115x+0.003,相關(guān)系數(shù)R2=0.99當(dāng)前第1頁1 2