專利名稱：一株鞘氨醇單胞菌tp-5及其生產(chǎn)韋蘭膠的方法和應用的制作方法
一株鞘氨醇單胞菌TP-5及其生產(chǎn)韋蘭膠的方法和應用
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物材料技術(shù)領域，具體地說，它涉及一株鞘氨 醇單胞菌TP-5 (S/7A/"go/mwossp.TP-5)菌株，及其產(chǎn)生的韋蘭膠類生物聚合物的應用。
背景技術(shù)：
許多微生物在生長代謝過程中，在不同的外部條件下都能產(chǎn)生一定量的 各種多糖聚合物。這類多糖聚合物安全無毒，具有獨特的理化性質(zhì)，且與植物和動物多糖 聚合物相比，微生物多糖聚合物的生產(chǎn)受地理環(huán)境、氣候、自然災害等因素的影響較小， 產(chǎn)量及質(zhì)量都很穩(wěn)定。韋蘭膠易溶于水，水溶液具有獨特的流變學特性和良好的增粘、耐 酸堿性。其水溶液對溫度的耐受性可高達150'C，高于同類多糖聚合物黃原膠的耐受溫度 120。C。
由于韋蘭膠的剪切稀化作用及其優(yōu)良的流變性能，它主要作為增稠劑、懸浮劑、乳化 劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑、成膜劑和黏合劑應用于工農(nóng)業(yè)的各個方面。特別是在食品、混凝土、 石油、油墨等工業(yè)中有廣泛的應用前景。在食品工業(yè)方面，韋蘭膠在烘焙制品、乳制品、 果汁、牛奶飲料、糖衣、糖霜、果醬、肉制品和各種甜點的加工中有潛在的應用價值。在 石油工業(yè)中，韋蘭膠可用于調(diào)配鉆井泥漿，以保持水基鉆井液的黏度和控制其流變性能。 韋蘭膠還是一種新型的驅(qū)油劑，用于油井的三次采油，將韋蘭膠調(diào)配成適合濃度的水溶液 注入井內(nèi)，壓進油層驅(qū)油，可大大提高采油率。韋蘭膠也可廣泛應用于水泥和混凝土中， 它能夠增強泥漿的保水性^當它作為保水劑時不需要像其它的添加劑那樣使用分散劑。與 其它添加劑相比，較低濃度的韋蘭膠就可以取得很好的效果。因此，近年來它們已作為乳 化劑、懸浮劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑、成膜劑和潤滑劑等廣泛應用于食品、制藥、石 油、化工等多個領域。
目前Kelco公司已成為韋蘭膠在全球唯一的生產(chǎn)、供應商，而國內(nèi)先后有南京工業(yè)大 學、南昌大學和河北鑫合生物化工有限公司從事這方面的研究，但所用菌種、發(fā)酵生產(chǎn)工 藝和后提取方法均不相同，此外還未見有關(guān)韋蘭膠生產(chǎn)的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)韋蘭膠的鞘氨醇單胞畬；同時提供一種 利用鞘氨醇單胞菌的廉價高產(chǎn)韋蘭膠工藝，以及從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取韋蘭膠的方法。
本發(fā)明方法以淀粉水解糖、硝酸鈉、玉米漿、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和碳酸鈣組成發(fā)酵 培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠，并采用預處理、超濾、醇沉和干燥技術(shù)從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取 韋蘭膠。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/ / /wgo/womw sp. TP-5)菌株，于2009年6月12 日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(北京市朝陽區(qū)大屯路3號， 中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCC No.3097,分類命名為鞘氨醇單胞菌 <S/>/H' gowowoy sp.0本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (Sp/^gomo"ossp.TP-5)菌株，該菌可在普通牛肉
汁、LB、營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，也可在含糖的無機鹽培養(yǎng)基中生長。菌株在28
37'C之間的任一溫度下好氧生長。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (Sp/w'"go附o"必sp.TP-5)菌株，是以無機鹽培養(yǎng)基
從糖蜜生產(chǎn)廢水中分離，接著以糖為唯一碳源在30°C反復馴化培養(yǎng)而獲得。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (Si7/H'"go附o"oysp. TP-5)菌落特征在LB平板上 30。C培養(yǎng)兩天即可長出淡黃色、圓形菌落，菌落大小直徑l 2mm，邊緣整齊，表面光滑。 繼續(xù)培養(yǎng)菌落會變大變厚。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (^/H'"go柳"氾sp.TP-5)菌株的形態(tài)特征革蘭氏 染色陰性，菌體呈短桿狀，有鞭毛，無芽孢，好氧，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后細胞平均大 小0.5-0.6 nm(寬)xl.2 -1.6^ 11(長)。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (5^z/"go/wo"ossp.TP-5)菌株生理生化特征生長 溫度28—37。C,生長pH范圍5-12, NaCl耐受性3X。氧化酶，亞硝酸鹽還原，脲酶，硫 化氫產(chǎn)生，反硝化，淀粉水解，M.R.， V-P，吲哚產(chǎn)生實驗均為陰性；接觸酶，分解七葉 苷，硝酸鹽還原，明膠水解實驗為陽性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；石蕊牛奶試驗為酸凝型。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (i^/"go附朋os sp. TP-5)菌株的16S rRNA基因序 列特征將TP-5菌株接種于LB培養(yǎng)基，30'C搖床培養(yǎng)(180rpm) 24小時，離心收集菌 體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用上游引物 (5'隱GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和下游引物(5'-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3'),用這對引物對其16SrDNA基因進行PCR擴增，將擴增引物送大連寶生物 公司進行測序。PCR條件為94。C, 5min; 94°C， 45s， 56.2°C， 45s, 72'C 90s， 30個循 環(huán);72。C 9min，4'C保存。16SrDNA基因序列長度為1610p，與SpW"gwno"asasacc/iarafyft-ca 的16S rDNA (GenBank accession No. AY509241.1)序列相似性為98%。其16S rDNA的 序列如序列表所示。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/^!'wgom卵ossp.TP-5)菌株，可在以淀粉水解糖、 硝酸鈉、玉米槳、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和碳酸鈣組成發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵以生產(chǎn)韋蘭膠， 并采用預處理、超濾、醇沉、脫色和干燥技術(shù)從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取制得韋蘭膠。
具體工藝步驟是
1、 以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入含普通LB培養(yǎng)基的搖 瓶中，培養(yǎng)制成種子液；
2、 將種子液以4~6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蒸餾水中按質(zhì)量體積比計包括8%的淀粉水解糖、0.4%的硝酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸鎂和 0.15%的碳酸鈣)中進行一級發(fā)酵，制成一級發(fā)酵液；
3、 將一級發(fā)酵液以8~10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蒸餾水中按質(zhì)量體積比計包括 8%的淀粉水解糖、0.4%的硝酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸 鎂、0.15%的碳酸銬、0.0005%的硫酸亞鐵和0.005%的消泡劑)中進行二級發(fā)酵，制成二 級發(fā)酵液(即發(fā)酵終產(chǎn)物)。若進行大規(guī)模生產(chǎn)可進行三級發(fā)酵，發(fā)酵放大方法同二級發(fā) 酵；
4、 將發(fā)酵終產(chǎn)物進行后提取處理工藝得到韋蘭膠，包括如下步驟
(1) 、預處理。用絮凝技術(shù)結(jié)合工業(yè)濾布除去大部分菌體碎片和發(fā)酵液中的不溶性雜質(zhì)；
(2) 、超濾。利用超濾膜截留分子量為106~107道爾頓的較大的物質(zhì)；
(3) 、醇沉。邊加入酒精邊攪拌，使韋蘭膠呈纖維狀析出；
(4) 、脫色。利用酸洗、堿洗和醇洗步驟洗脫色素和雜質(zhì)；
(5) 、干燥。將沉淀用真空干燥或噴霧干燥的方式干燥，即制得韋蘭膠粉末。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (^/H'wgo附omw sp. TP-5)菌株所發(fā)酵生產(chǎn)的韋蘭膠， 具有良好的穩(wěn)定性和獨特的剪切稀釋性。其水溶液對熱穩(wěn)定，在溫度提升至150'C時粘度 基本不變；對酸、堿穩(wěn)定，pH2~13范圍內(nèi)粘度基本不受影響；對鹽的穩(wěn)定性高(氯化物 濃度〈100g/L)，且與大多數(shù)鹽都有配伍性。在溫度繼續(xù)升高后溶液的粘度下降，在溫度降 低后又可完全恢復。當施加一定的剪切力時，粘度迅速下降， 一旦失去剪切力粘度仍能恢 復。這一點在石油鉆井海水泥漿中發(fā)揮突出的作用。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/7/H'wgo附omw sp. TP-5)菌株所發(fā)酵生產(chǎn)的韋蘭膠， 具有理想的增稠性和強韌的成膠特性。低濃度的韋蘭膠水溶液即有很高的粘度，25'C時 1%的韋蘭膠水溶液粘度可達4300mPa's，因此用韋蘭膠作為稠化劑可用于生物聚合物驅(qū)油 試驗中。此外，韋蘭膠在0.1X的NaOH溶液加熱可形成凝膠，與結(jié)冷膠復配后在G^+鹽 存在下亦可形成凝膠，且凝膠強度大，可用于油藏深部調(diào)剖堵水試驗中。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S;;/K'wgo附omwsp.TP-5)菌株相比其它生產(chǎn)工藝， 利用了廉價的碳源和無機氮源，在28 37'C最適溫度條件下利用淀粉水解糖、硝酸鈉、玉 米槳、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和碳酸鈣組成的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠，對糖的轉(zhuǎn)化率可達 56%以上，保持高產(chǎn)的同時比利用有機氮源(如蛋白胨)擁有較大的粘度。利用預處理、 超濾、醇析、脫色和干燥組合工藝進行產(chǎn)物后提取，得到的韋蘭膠質(zhì)量較高。較現(xiàn)有技術(shù) 而言更易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，且生產(chǎn)的韋蘭膠產(chǎn)品質(zhì)量較好。


6圖1是LB培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)2天后的TP-5菌落照片； 圖2是剪切速率對1%的韋蘭膠水溶液表觀粘度的影響； 圖3是溫度對1%的韋蘭膠鹽溶液表觀粘度的影響； 圖4是韋蘭膠濃度對表觀粘度的影響。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/7W"gowo"氾sp. TP-5)菌株，于2009年6月12 日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(北京市朝陽區(qū)大屯路3號， 中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCC No.3097，分類命名為鞘氨醇單胞菌 )^ /H'"go附omw sp. o
具體實施方式
實施例l
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (5^z'"go腳"ossp.TP-5)菌株的篩選和育種。 從天津津南區(qū)某糖蜜廠采集廢水樣，取10mL于90mL葡萄糖無機鹽培養(yǎng)基中(培養(yǎng) 基組成KH2P04 3.48， Na2HP04*12H20 1.5, NH4 S04 2, MgS04*7H20 0.70，酵母提取物 0.05;葡萄糖5%;蒸餾水，1000ml; pH7.2; 105。C滅菌30min)，置于200r/min低溫搖 床3(TC富集培養(yǎng)5天，劃線篩選直徑較大且明顯粘稠的菌落；進一步挑選該菌落至新鮮 的lOOmL葡萄糖無機鹽培養(yǎng)基中進行傳代馴化，培養(yǎng)條件同上；經(jīng)過5 7個周期富集后 最終得到TP-5;在LB固體平板上反復劃線，挑取單菌落劃斜面保存；將TP-5菌落分別 取一環(huán)接入裝有5mLLB培養(yǎng)液的試管內(nèi)，30'C震蕩培養(yǎng)48h，作為種子液；分別取lmL 種子液接入裝有100mL葡萄糖無機鹽培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30'C震蕩培養(yǎng)3d，檢測 多糖聚合物的產(chǎn)量和種類。
實施例2
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/7/n'"go附o"ossp.TP-5)菌株的形態(tài)特征和生理生 化特征。
參照《Bergey，sMannual of Systematic Bacteriology》(Vol. V1D)的實驗方法進行，檢測 其革蘭氏染色，菌體大小和形態(tài)，有無鞭毛和芽孢，生長溫度，生長pH范圍，NaCl耐受 性。接觸酶，氧化酶，M.R.實驗，V-P實驗，吲哚產(chǎn)生，硝酸鹽還原，淀粉水解，產(chǎn)氨實 驗，脲酶，硫化氫產(chǎn)生,，明膠水解，葡萄糖發(fā)酵，石蕊牛奶試驗，分解七葉苷實驗。
鞘氨醇單胞菌TP-5 (S;7/n'"gomomw sp. TP-5 )在LB平板上30°C培養(yǎng)兩天即可長出淡 黃色、圓形菌落，菌落大小直徑l 2mm，邊緣整齊，表面光滑(見圖l)。繼續(xù)培養(yǎng)菌落 會變大變厚。革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，有鞭毛，無芽孢，好氧，在LB培養(yǎng)基培 養(yǎng)2天后細胞平均大小0.5-0.6拜(寬)xl.2-1.6拜(長)。生長溫度28—37°C,生長pH范圍5-12， NaCl耐受性3X。氧化酶，亞硝酸鹽還原，脲酶，硫化氫產(chǎn)生，反硝化，淀粉水解， M.R.， V-P,吲哚產(chǎn)生實驗均為陰性；接觸酶，分解七葉苷，硝酸鹽還原，明膠水解實驗 為陽性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；石蕊牛奶試驗為酸凝型。
實施例3
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (^/w'"g腦w^sp.TP-5)菌株的的16SrRNA基因的 PCR擴增和序列測定。
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S;7/K'"g謡o"wsp.TP-5)菌株的16SrRNA基因序 列特征將TP-5菌株接種于LB培養(yǎng)基，3(TC搖床培養(yǎng)(180rpm) 24小時，離心收集菌 體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用上游引物 (5'墨GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和下游引物(5'-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3'),用這對引物對其16SrDNA基因進行PCR擴增，將擴增引物送大連寶生物 公司進行測序。PCR條件為:94。C， 5min; 94°C, 45s， 56.2。C, 45s， 72°C 90s, 30個循 環(huán)；72°C 9min,4'C保存。16S rDNA基因序列長度為1610p，與S/ /H-"go附omw osacc/wra/^rica 的16S rDNA (GenBank accession No. AY509241.1)序列相似性為98%。其16S rDNA的 序列如序列表所示。
實施例4
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (Sp/w'"gomo"ossp.TP-5)菌株的多糖聚合物種類檢測。
菌株產(chǎn)生的聚合物溶于水，不溶于醇、酮等有機溶劑。
聚合物的雙縮脲反應、斐林試劑反應均為陰性，說明樣品中不含游離的氨基酸和單糖 類物質(zhì)。采用不同的特異性顯色方法對聚合物樣品和酸水解后的樣品進行薄層定性分析。 酸水解前后的聚合物樣品用硫酸-蒽酮顯色后都呈明顯的藍綠色斑點，說明樣品中含有糖 類成分；聚合物樣品的丁酮抽提物用鉬酸銨-高氯酸顯色無明顯斑點，說明聚合物中不含 有脂類物質(zhì)；用茚三酮顯色水解聚合物樣品無明顯斑點，說明聚合物樣品中不含有多肽組 分。
用硫酸-咔唑法對糖醛酸進行定量測定，結(jié)果表明葡萄糖醛酸占糖組分的10.4%。聚合 物樣品經(jīng)過三氟乙酸水解后，氣相色譜法測定單糖組成，相對保留時間為16.03》的峰為 內(nèi)標肌醇六乙酸酯，保留時間12.389、 14.238和14.542的組分依次為鼠李糖、甘露糖和 葡萄糖，根據(jù)各組分峰面積，由內(nèi)標法計算可知樣品中葡萄糖、鼠李糖、甘露糖的比例為 2:2:1。進一步采用高碘酸氧化法，測得鼠李糖末端連接的和l， 4連接的比例為1: 2，葡萄糖基本上為1， 3連接。這種典型結(jié)構(gòu)證實該多糖類生物聚合物是韋蘭膠類鞘氨醇膠。 實施例5
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (SpW"go/womwsp.TP-5)菌株制備韋蘭膠的方法。 將生產(chǎn)菌種在以淀粉水解糖、硝酸鈉、玉米漿、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和碳酸鈣組成發(fā) 酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，發(fā)酵過程是在33'C， pH6.8的條件下進行好氧發(fā)酵，對發(fā)酵終產(chǎn)物采 用預處理、超濾、醇沉和干燥技術(shù)提取制得韋蘭膠。具體工藝步驟是
1、 以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入20倍體積的普通LB培 養(yǎng)基中，好氧發(fā)酵24 36h制成種子液；
2、 將種子液以4~6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蒸餾水中按質(zhì)量體積比計包括8%的 淀粉水解糖、0.4%的硝酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸鎂和 0.15%的碳酸鈣)中，28 37'C好氧發(fā)酵28h，制成一級發(fā)酵液；
3、 將一級發(fā)酵液以8~10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(蒸餾水中按質(zhì)量體積比計包括 8%的淀粉水解糖、0.4%的硝酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸 鎂、0.15%的碳酸轉(zhuǎn)、0.0005%的硫酸亞鐵和0.005%的消泡劑)中，好氧條件發(fā)酵24h， 制成二級發(fā)酵液(終產(chǎn)物)；
4、 將發(fā)酵終產(chǎn)物進行后提取處理得到韋蘭膠，包括如下步驟
(1) 、預處理。用5。/。的氯化鋁絮凝Ih，繼而以2500rpm離心10分鐘除去部分菌體碎 片和發(fā)酵液中的不溶性雜質(zhì)；
(2) 、超濾。利用超濾膜截留分子量為106~107道爾頓，操作壓力為0.4MPa,室溫流速 為3m/ss
(3) 、醇沉。邊加入等體積的95%酒精邊攪拌，使韋蘭膠呈纖維狀析出；
(4) 、脫色。利用1/10體積的0.1% (v/v)的鹽酸、0.1%的氫氧化鈉和95%的酒精各洗 滌沉淀1次；
(5) 、干燥。將沉淀用真空干燥或噴霧干燥的方式干燥，即制得韋蘭膠粉末。經(jīng)稱重計 算韋蘭膠得率為29g/L，糖轉(zhuǎn)化率為56.3%。
實施例6
本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5 (S;7/^go/nomwsp.TP-5)菌株制備的韋蘭膠特性。 配制1.0%的韋蘭膠水溶液，室溫下通過選擇不同的轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)剪切速率，用DVLV-II 型旋轉(zhuǎn)粘度計測定韋蘭膠水溶液的表觀粘度，二者關(guān)系曲線見圖2， 25'C時1%的韋蘭膠 水溶液粘度可達4300mPa's，韋蘭膠水溶液的粘度隨著剪切速率的增大而降低，當轉(zhuǎn)速降 低時粘度又可回升，呈現(xiàn)典型的假塑流體特征，證明具有良好的剪切稀釋性。
配制1.0%的韋蘭膠水溶液，加入不同量的氯化鉀，.使氯化鉀的最終濃度分別為0.1%、0.3%、 0.5%，在2(M50'C范圍內(nèi)、恒定轉(zhuǎn)速30r/min條件下用DVLV-II型旋轉(zhuǎn)粘度計測定
溶液的表觀粘度(圖3)。在加入不同濃度的氯化鉀后，韋蘭膠溶液的粘度顯著增大。對
溫度的穩(wěn)定性增強，其粘度幾乎不隨溫度的改變而改變，并表現(xiàn)出更強的溫度耐受性，說 明其具有良好的耐溫性和耐鹽性。
配制0.2%、 0.4%、 0.6%、 0.8%濃度的韋蘭膠水溶液，在室溫下選擇不同的轉(zhuǎn)速，用 DVLV-II型旋轉(zhuǎn)粘度計測定溶液的表觀粘度(圖4)。在相同的剪切速率下，表觀粘度與溶 液濃度正相關(guān)，表現(xiàn)出良好的增稠效果。且剪切速率越小，這種趨勢越顯著。說明低濃度 韋蘭膠也具有較高的粘度。
配制1%的韋蘭膠0.1% NaOH溶液，或在1%的韋蘭膠水溶液中添加0.1%的Ge^離子， 60 120'C加熱lmin并冷卻后可形成凝膠；此外將韋蘭膠與結(jié)冷膠按1:3 (m/m)比例復 配后可形成凝膠，形成凝膠所需的最低溶液濃度有較大差異，在不加金屬離子的條件下， 形成凝膠所需復配膠濃度21%，結(jié)冷膠為1.2%;加入金屬離子，0.04%的結(jié)冷膠即可形成 凝膠，而復配膠只需要0.03%，且形成的凝膠透明，強度大，可用于油藏深部調(diào)剖堵水試 驗中。
常見的一價離子如K+、 Na+, 二價離子除Cu2+、 Fe2+外，Ca2+、 Mg2+、 Zn2+、 Mn2+ (濃度均為O.Olmol/L)均可使0.02%的復配膠溶液形成凝膠；三價離子如Fe^和Al3+， 可使復配膠形成團塊狀沉淀。
表1不同離子對復配膠形成凝膠的影響
c"2+Mi"
復配膠V々增粘—
—價及三價離子K+"+擰樣酸鐵崎卿2
.復配膠V沉淀沉淀
10序列表
<110>南開大學
<120> —株鞘氨醇單胞菌TP-5及其生產(chǎn)韋蘭膠的方法和應用 <160>1
<170> Pateiitin Version 3.3 <210> 1 <211> 1610 <212>DNA
<213>鞘氨醇單胞菌TP-5 (S/ /H'ngoTMowossp. TP-5) <400> 1
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權(quán)利要求
1、一種鞘氨醇單胞菌TP-5菌株，保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，分類命名為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.，其保藏號為CGMCC No.3097。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5菌落特征在LB平板上30°C培養(yǎng)兩天即可長出淡 黃色、圓形菌落，菌落大小直徑l 2mm,邊緣整齊，表面光滑，繼續(xù)培養(yǎng)菌落會變大變 厚；本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5菌株的形態(tài)特征革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀， 有鞭毛，無芽孢，好氧，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后細胞平均大小0.5-0.6 ,寬><1.2-1.6拜 長；本發(fā)明提供的鞘氨醇單胞菌TP-5菌株生理生化特征生長溫度28—37'C，生長pH 范圍5-12， NaCl耐受性3^;氧化酶，亞硝酸鹽還原，脲酶，硫化氫產(chǎn)生，反硝化，淀粉 水解，M.R.， V-P，吲哚產(chǎn)生實驗均為陰性；接觸酶，分解七葉苷，硝酸鹽還原，明膠水 解實驗為陽性；葡萄糖發(fā)酵為氧化型；石蕊牛奶試驗為酸凝型。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征為16SrDNA序列如序列表所示。
4、 一種使用權(quán)利要求1所述菌株制備韋蘭膠的方法，該方法在以淀粉水解糖、硝酸 鈉、玉米漿、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和碳酸鈣組成的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵生產(chǎn)，并采用預 處理、超濾、醇沉、脫色和干燥技術(shù)，從發(fā)酵終產(chǎn)物中提取制得韋蘭膠，具體工藝步驟是第一、以無菌水將原始菌種從一個或多個斜面上洗下，直接接入普通LB培養(yǎng)基中， 好氧發(fā)酵培養(yǎng)制成種子液；第二、將上步培養(yǎng)的種子液以4~6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行一級發(fā)酵，制成 一級發(fā)酵液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按質(zhì)量體積比計包括8%的淀粉水解糖、0.4%的硝 酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸鎂和0.15%的碳酸鈣，以蒸 餾水配制；第三、將第二步制成的一級發(fā)酵液以8~10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行二級發(fā) 酵，制成二級發(fā)酵液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按質(zhì)量體積比計包括8%的淀粉水解糖、 0.4%的硝酸鈉、0.1%的玉米漿、0.358%的磷酸氫二鈉、0.02%的硫酸鎂、0.15%的碳酸 轉(zhuǎn)、0.0005%的硫酸亞鐵和0.005%的消泡劑，以蒸餾水配制；第四、將第三步制成的二級發(fā)酵液作為發(fā)酵終產(chǎn)物，依次經(jīng)過預處理—超濾—醇沉— 脫色—干燥的后提取處理工藝得到韋蘭膠。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，第四步所述的后提取處理工藝的具體 步驟是預處理用絮凝技術(shù)結(jié)合工業(yè)濾布除去大部分菌體碎片和發(fā)酵液中的不溶性雜質(zhì)； 超濾利用超濾膜截留分子量為106~107道爾頓的較大物質(zhì)；醇沉邊加入酒精邊攪拌，使韋蘭膠呈纖維狀析出；脫色利用酸洗、堿洗和醇洗步驟洗脫色素和雜質(zhì)；干燥將沉淀用真空干燥或噴霧干燥的方式干燥，即制得韋蘭膠粉末。
6、權(quán)利要求4所述的方法制備的韋蘭膠，應用在鉆井泥漿或驅(qū)油復合劑中。
全文摘要
一株鞘氨醇單胞菌TP-5及韋蘭膠的制備方法和應用。本發(fā)明菌株是從糖蜜廠含糖廢水中分離馴化得到，其分類命名為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.，其保藏號為CGMCCNo.3097。該菌可在普通牛肉汁、LB、營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，也可在含糖的無機鹽培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明提供的TP-5菌株在28～37℃溫度條件下，能夠在糖、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)提取即得韋蘭膠。韋蘭膠的耐溫極限值為150℃，在加入不同濃度的氯化鉀后，韋蘭膠溶液的粘度顯著增大，對溫度的穩(wěn)定性增強，其粘度幾乎不隨溫度的改變而改變，表現(xiàn)出更強的溫度耐受性，這一特征使其可應用于海水鉆井泥漿和高鹽油藏稠化水驅(qū)體系中。
文檔編號C12N1/20GK101619300SQ200910069960
公開日2010年1月6日 申請日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者劉如林, 李丹萍, 李國強, 梁鳳來, 挺 馬 申請人:南開大學