專利名稱：一種鞘氨醇桿菌及利用其制備左乙拉西坦酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種桿菌及其用途，特別涉及ー種鞘氨醇桿菌以及利用該鞘氨醇桿菌作為生物催化劑制備左こ拉西坦酸的方法。
背景技術(shù)：
已知左こ拉西坦酸是合成左こ拉西坦((Λ-α -こ基-2-氧合-I-こ酰胺吡咯烷，Levetiracetam)的關(guān)鍵手性中間體,其結(jié)構(gòu)式如圖I所示。左こ拉西坦是比利時UCB (優(yōu)時比)公司開發(fā)研制的ー種新型抗癲癇藥，與2000年4月獲FDA批準(zhǔn)，在美國和歐盟上市，主要用于治療局限性及繼發(fā)性全身性癲癇。目
前在全球超過66個國家和地區(qū)上市,全球有超過100萬人的治療記錄,是目前美國癲癇治療中應(yīng)用最多的新型抗癲癇藥物。研究結(jié)果表明，右旋體對于抑制癲癇發(fā)作只有輕微或者不明顯的藥效作用，而左こ拉西坦則是ー種安全、高效的抗癲癇藥物。目前左こ拉西坦的合成大致可以分為化學(xué)法和化學(xué)-酶法。其中，化學(xué)法主要可以分為以下幾類方法第一類是以2-氨基丁酸及類似物為原料，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到左旋的α -氨基丁酰胺衍生物，然后與4-氯丁酰氯或4-氯丁酸酯反應(yīng)環(huán)合再轉(zhuǎn)化為左こ拉西坦的方法。第二類是以2-吡咯烷酮為原料，引進(jìn)側(cè)鏈制備消旋酸再拆分得到左こ拉西坦的方法。但該兩種方法均需要用到與物料等摩爾劑量的手性酸或堿拆分劑和大量有機(jī)溶劑，拆分成本較高，操作步驟較為繁瑣費時。近年來，已有文獻(xiàn)報道了利用環(huán)境友好、溫和高效的酶作為催化劑來合成左こ拉西坦及其中間體。如利用腈水合酶作為催化劑來合成左こ拉西坦及其中間體，其關(guān)鍵步驟是腈水合酶催化動力學(xué)拆分消旋的2-吡咯烷酮腈化物直接得到左こ拉西坦。拆分產(chǎn)率達(dá)到43%，產(chǎn)物a e.值為94%。此方法的優(yōu)點是路線簡介，反應(yīng)條件溫和，底物濃度較高。不足之處是在中間體合成中采用了有一定毒性的腈化物。根據(jù)左こ拉西坦的結(jié)構(gòu)特點，發(fā)現(xiàn)如果可以篩選到高立體選擇性水解こ拉西坦酸酷(α -こ基-2-氧代-I-吡咯烷こ酸酷)的生物催化劑，同樣可以合成手性藥物中間體左こ拉西坦酸((S)-Ci -こ基-2-氧代-I-吡咯烷こ酸)。即利用酶催化上述羧酸酯的水解動力學(xué)拆分來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)拆分法。這種羧酸酯水解酶在手性酸、醇和酯的合成中具有廣泛的用途。該技術(shù)路線中的生物催化劑無毒、溫和、具有高選擇性和催化效率，并且避免了腈水合酶路線中有毒的腈化物原料，具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー在于為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的用到大量有機(jī)溶劑、操作繁瑣、原料有毒性等技術(shù)問題，而提供一種鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp.) SIT102,CGMCC NO. 6158。本發(fā)明的目的之ニ在于提供上述的一種鞘氨醇桿菌{Sphingobac teri um sp.)SIT102的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的之三在于提供ー種將上述的鞘氨醇桿菌{Sphingobac teri umsp.) SIT102作為生物催化劑應(yīng)用的方法，即作為生物催化劑催化外消旋こ拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左こ拉西坦酸的制備方法。本發(fā)明所提供的鞘氨醇桿菌i^phingobacterium sp.) SIT102作為生物催化劑可以高選擇性、高收率、低生產(chǎn)成本的催化合成左こ拉西坦酸。本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明的一種鞘氨醇桿菌sp.) SIT102是ー種屬于細(xì)菌類鞘氨醇桿菌屬的菌株，該菌株是通過以下 方法得到的，即從中國東南方地區(qū)上海富含油脂的土壤中采集土樣，以こ拉西坦酸甲酯或其類似物為唯一碳源經(jīng)過多輪富集培養(yǎng)后篩選得到的。本發(fā)明的鞘氨醇桿菌ダsp. ) SIT102菌種具有如下的微生物學(xué)特征
I、形態(tài)特征
本發(fā)明所得的鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp.) SIT102細(xì)胞呈橢圓型,O. 4、. 8μ mX O. 8^2. 5 Mm,不具有端生或周生鞭毛，不形成菌絲體。2、培養(yǎng)學(xué)特征
在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖瓊脂上菌落不透明，圓形并向上突起，邊緣光滑，呈淡黃色。3、生理生化特征
(1)革蘭氏陰性桿狀菌；好氧菌；
(2)運動性運動能力較差；
(3)吲哚產(chǎn)生試驗陰性；
(4)硫化氫產(chǎn)生實驗陰性；
(5)淀粉水解試驗陽性；
(6)明膠液化試驗陽性；
(7)甲基紅試驗陰性
(8)伏-普ニ氏試驗(VP實驗)陽性
(9)檸檬酸鹽利用試驗弱陽性
(10)尿素利用試驗陰性
(11)碳源同化
陽性麥芽糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸、阿拉伯糖、N-こ酰葡糖胺 陰性硝酸鹽、亞硝酸鹽、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶
(12)生長最適宜溫度25 35°C；
根據(jù)生理生化試驗和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，結(jié)合16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，該細(xì)菌屬于鞘氨醇桿菌sp.),但又與現(xiàn)有技術(shù)中報道的鞘氨醇桿菌有明顯不同，其主要不同之處在于可以作為生物催化劑，催化外消旋こ拉西坦酸酯對映選擇性水解產(chǎn)生左こ拉西坦酸，并具有較高的產(chǎn)率和較好的立體選擇性(產(chǎn)物 e. e. >96%) ο本發(fā)明的銷氛醇桿菌(Sphingobacterium sp. )SIT102于2012年5月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC NO. 6158。采用上述鞘氨醇桿菌(5)9Ai/7ダsp. ) SIT102作為生物催化劑催化外消旋こ拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左こ拉西坦酸的制備方法，其制備過程的反應(yīng)方程示意圖如圖3所示，其制備過程包括下列步驟
(I )、鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102 的培養(yǎng)
取4°C保存的鞘氨醇桿菌(5)9Ai/7ダsp. )SIT102斜面菌種,挑取一環(huán)接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在25 35°C下，160 220rpm振搖培養(yǎng)24 48h，離心收獲鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102菌體，然后將所得的鞘氨醇桿菌(Sphingobac teri um sp. ) SIT102 菌體置于緩沖溶液中；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖10. Og/L，蛋白胨20. Og/L,KH2PO4 lg/L, K2HPO4 2g/L，
MgSO4 O. 5g/L, ρΗ7· 0 ；
所述的緩沖溶液為PH值為6. 5 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液；
(2)、向步驟(I)中含有鞘氨醇桿菌(5)9Ai/7ダοAacieriw sp. ) SIT102的緩沖溶液中加入外消旋こ拉西坦酸酯，加入的外消旋こ拉西坦酸酯經(jīng)鞘氨醇桿菌如cteri sp. ) SIT102靜息細(xì)胞催化進(jìn)行對映選擇性水解反應(yīng)后得反應(yīng)液；
上述的對映選擇性水解反應(yīng)過程控制溫度為20 40°C，時間為3 48h ;
上述反應(yīng)過程中所用的鞘氨醇桿菌ダsp. )SIT102細(xì)胞量、外消旋こ拉西坦酸酯、緩沖溶液的量按鞘氨醇桿菌如cieriw sp. )SIT102細(xì)胞濕重外消旋こ拉西坦酸酯緩沖溶液為5 150g 5 IOOmmol 1L計算；
上述的外消旋こ拉西坦酸酯的結(jié)構(gòu)式如圖2所示；
(3)、將步驟(2)所得的反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物左こ拉西坦酸。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明采用鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102作為生物催化劑對外消旋こ拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解制備左こ拉西坦酸，最終左こ拉西坦酸的產(chǎn)率可達(dá)48%以上，光學(xué)純度e.e.達(dá)96%。另夕卜，由于本發(fā)明的生物催化劑鞘氨醇桿菌(秘/取1 如cieri sp. )SIT102,其培養(yǎng)方便，原料易得，以鞘氨醇桿菌iSphingobacterium sp. ) SIT102作為生物催化劑對外消旋こ拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解制備左こ拉西坦酸反應(yīng)條件溫和，無需大量有機(jī)溶齊U，從而降低生產(chǎn)成本，有利于進(jìn)ー步的エ業(yè)化生產(chǎn)。


圖I、外消旋こ拉西坦酸酯的結(jié)構(gòu)式示意 圖2、左こ拉西坦酸的結(jié)構(gòu)式示意 圖3、本發(fā)明的鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102,作為生物催化劑催化外消旋こ拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左こ拉西坦酸的反應(yīng)方程示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)ー步詳細(xì)描述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明所用的試劑皆為分析純或化學(xué)純規(guī)格。
本發(fā)明用的外消旋こ拉西坦酸酯是通過外消旋的こ拉西坦酸與無水甲醇或無水こ醇在三甲基氯硅烷催化作用下合成的。左こ拉西坦酸的檢測方法手性液相色譜(色譜柱為Chiralcel OD-H色譜柱，流動相為正己燒異丙醇:三氟こ酸=95 5 :0. I,紫外檢測波長210nm,流速I ml/min)；
本發(fā)明中所指的細(xì)胞羧酸酯酶活力単位的定義為在30°C，pH7. O的條件下，每分鐘催化外消旋こ拉西坦酸甲酯水解生成I. O μ mol左こ拉西坦酸所需的酶量即為I個活力単位。實施例I
鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102 的培養(yǎng)
新鮮斜面培養(yǎng)基葡萄糖10. O 8/し酵母膏5.0 8/し蛋白胨5.0 g/L，MgSO4 O. 5g/L，
NaCl O. 5g/L, KH2PO4 lg/L, K2HPO4 2g/L，瓊脂 15-20 g/L, pH 7.0。斜面種子的培養(yǎng)
取冰箱4°C保存的鞘氨醇桿菌ダsp. ) SIT102菌種,取出后接種到上述所述的新鮮斜面培養(yǎng)基上，在30°C下培養(yǎng)48h,得鞘氨醇桿菌iSphingobacterium sp.)SIT102斜面種子，并將其保存在4°C的冰箱中。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10. O 8/し蛋白胨20.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 lg/L,K2HPO4 2g/L，pH 7.0。取4°C保存的鞘氨醇桿菌ダsp. ) SIT102斜面種子,挑取ー環(huán)接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30°C下，180rpm振搖培養(yǎng)48h，以1000Q§·離心約15min得到鞘氨醇桿菌sp. ) SIT102浄息細(xì)胞。最終所得的發(fā)酵液產(chǎn)羧酸酯酶活力約為30 50 U/L，細(xì)胞濃度按濕重計算約15 25g/L，單位細(xì)胞產(chǎn)羧酸酯酶活力約為2U/g濕細(xì)胞。實施例2
外消旋こ拉西坦酸甲酯的制備
將外消旋的こ拉西坦酸(8. 5g, O. 05mol),無水甲醇(40mL, lmol),三甲基氯娃燒(9mL, O. 15mol)室溫下攪拌反應(yīng)24 h ；
減壓除掉溶劑，剰余物加入こ酸こ酯重新溶解，用飽和Na2CO3溶液(共3次，每次5ml)和蒸餾水(共4次，毎次5ml)洗滌，之后用無水硫酸鈉干燥，減壓除掉溶劑后得到外消旋こ拉西坦酸甲酷，收率約為75%，純度為99%。取濕重I. O g的實施例I所得的鞘氨醇桿菌ダsp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(O. lmol/L, pH 7. 0)，加入上述所得的外消旋こ拉西坦酸甲酯O. lmmol，反應(yīng)混合物在30°C、180r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)24h后加入2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. O,以こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為43%，對映體過量值(e. e.)為92%。實施例3
取濕重I. O g的實施例I所得的鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(0. I M, pH 7. 0)，加入實施例2中所得的外消旋こ拉西坦酸甲酯0. lmmol，反應(yīng)混合物在30°C、180 r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)36h后加Λ 2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. O,以こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為52%，對映體過量值(e. a )為90%。實施例4
取濕重I. Og的實施例I所得的鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(O. I M, pH 7. 0)，加入實施例2中所得的外消旋こ拉西坦酸甲酯O. 05mmol，反應(yīng)混合物在30°C、180r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)24h后加入2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. O,以こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所 得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為46%，對映體過量值(e. α )為94%。實施例5
取濕重2. O g的實施例I所得的鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(O. 1M, pH7. 5)，加入實施例2中所得的外消旋こ拉西坦酸甲酯O. lmmol，反應(yīng)混合物在30°C、180r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)24h后加入2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. O,以こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為48%，對映體過量值(e. e.)為96%。實施例6
外消旋こ拉西坦こ酯的制備
將外消旋的こ拉西坦酸(8. 5g,0. 05mol),無水こ醇(40mL, O. 8mol)，三甲基氯娃燒OmL,O. 15mol)室溫下攪拌反應(yīng)24h，減壓除掉溶劑，剰余物加入こ酸こ酯重新溶解，用飽和Na2CO3溶液(共3次，每次5 ml)和蒸餾水(共4次，每次5ml)洗滌。之后用無水硫酸鈉干燥，減壓除掉溶劑后得到外消旋こ拉西坦こ酯，收率約為75%，純度為99%。取濕重I. Og的實施例I所得的鞘氨醇桿菌ダsp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(O. 1M, pH7. 0)，加入上述所得的外消旋こ拉西坦こ酯O. lmmol,反應(yīng)混合物在3(TC、180r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)24h后加入2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. 0，以こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為50%，對映體過量值(a e.)為80%。實施例7
取濕重I. Og的實施例I所得的鞘氨醇桿菌{Sphingobacterium sp. ) SIT102靜息細(xì)胞，懸浮于IOml磷酸鉀鹽緩沖溶液中(O. 1M, pH7. 0)，加入實施例6所得的外消旋こ拉西坦こ酯O. 15mmol，反應(yīng)混合物在30°C、180r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，反應(yīng)24h后，加入2mol/L鹽酸調(diào)水相pH值到2. 0，用こ酸こ酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，即得左こ拉西坦酸。用手性液相色譜分析上述所得的左こ拉西坦酸的對映體過量值和產(chǎn)率，左こ拉西坦酸的產(chǎn)率為41%，對映體過量值(a e.)為88%。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種銷氛醇桿菌{Sphingobacterium sp.) SIT102, CGMCC NO. 6158。
2.如權(quán)利要求I所述的鞘氨醇桿菌SIT102的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟如下 以葡萄糖為碳源、以蛋白胨為氮源將鞘氨醇桿菌SIT102進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中控制pH為7. O、溫度為25 35°C，時間為24 48h。
3.利用權(quán)利要求I所述的鞘氨醇桿菌SIT102作為生物催化劑催化外消旋乙拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于具體包括下列步驟 (1)、鞘氨醇桿菌SIT102的培養(yǎng)，即以葡萄糖10.Og/L，蛋白胨20. Og/L, KH2PO4 lg/L,K2HPO4 2g/L，MgSO4 O. 5g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基，將4°C保存的鞘氨醇桿菌SIT102斜面菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中控制PH為7. O、溫度為25 35°C，時間為24 48h后離心收獲鞘氨醇桿菌SIT102菌體，然后將所得的鞘氨醇桿菌SIT102菌體置于緩沖溶液中； (2)、向步驟(I)所得的緩沖溶液中加入外消旋乙拉西坦酸酯，其經(jīng)鞘氨醇桿菌SIT102菌體催化進(jìn)行對映選擇性水解反應(yīng)后得反應(yīng)液； 上述的對映選擇性水解反應(yīng)過程控制反應(yīng)溫度為20 40°C，反應(yīng)時間為3 48h ; 上述的對映選擇性水解反應(yīng)過程中所用的鞘氨醇桿菌SIT102細(xì)胞量、外消旋乙拉西坦酸酯的量和緩沖溶液的量按鞘氨醇桿菌SIT102細(xì)胞濕重外消旋乙拉西坦酸酯緩沖溶液體積為5 150g 5 IOOmmol IL計算； 上述的外消旋乙拉西坦酸酯的結(jié)構(gòu)式如下
4.如權(quán)利要求3所述的利用鞘氨醇桿菌SIT102作為生物催化劑催化外消旋乙拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于步驟(I)中所述的緩沖溶液為磷酸鉀緩沖溶液，其PH值為6. 5 7. 5。
5.如權(quán)利要求3或4所述的利用鞘氨醇桿菌SIT102作為生物催化劑催化外消旋乙拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左乙拉西坦酸的方法，其特征在于步驟(2)中所述的外消旋乙拉西坦酸酯是通過外消旋的乙拉西坦酸與無水甲醇或無水乙醇在三甲基氯硅烷催化作用下合成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)SIT102，CGMCC NO.6158，以及利用該鞘氨醇桿菌SIT102作為生物催化劑催化外消旋乙拉西坦酸酯進(jìn)行對映選擇性水解產(chǎn)生左乙拉西坦酸的制備方法。所述左乙拉西坦酸的制備方法即將鞘氨醇桿菌SIT102細(xì)胞置于緩沖溶液中后向其中加入外消旋乙拉西坦酸酯，經(jīng)催化進(jìn)行對映選擇性水解反應(yīng)得到左乙拉西坦酸。本發(fā)明的利用該鞘氨醇桿菌SIT102作為生物催化劑制備左乙拉西坦酸的方法，所用的生物催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和，左乙拉西坦酸的產(chǎn)率能夠達(dá)到48%，對映體過量值達(dá)96%，生產(chǎn)成本低，具有相當(dāng)?shù)墓I(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號C12N1/20GK102851238SQ201210283040
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者徐毅, 陳晨, 陳建波 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院