鞘氨醇單胞菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物菌種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鞘氨醇單胞菌株xp，其分類命名為Sphingomonassp.，該菌株xp在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為：CCTCCNo：M2011453。本發(fā)明將該鞘氨醇單胞菌菌株xp用于降解煙草薄片中的多酚類化合物，降解效果好。<i />
【專利說明】鞘氨醇單胞菌株XP在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鞘氨醇單胞菌株XP及其在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草薄片又稱再生煙葉或均質(zhì)煙葉，它是煙草工業(yè)生產(chǎn)中的綜合利用和精細加工的產(chǎn)品，主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠黏劑和其他添加劑等組成。實際上所有的煙草物質(zhì)都可以用于煙草薄片的生產(chǎn)制造，將整個卷煙生產(chǎn)過程中廢棄的煙梗、梗簽、碎片和部分低次煙葉、短梗經(jīng)過不同的加工方法，制成性狀接近甚至優(yōu)于天然煙葉的煙草薄片，并且制成的煙草薄片具有成本低、填充性能好并能減少煙氣中焦油含量等優(yōu)點。根據(jù)生產(chǎn)加工工藝的不同，主要有造紙法、稠漿法和輥壓法三種生產(chǎn)工藝。其中造紙法是指煙草原料先用水萃取，不溶性物質(zhì)或添加天然纖維制成漿后進入造紙機形成薄片片基，水溶性萃取物經(jīng)濃縮后和添加劑一并涂布與片基，干燥后即為成品。加工制造時，可從水溶性物質(zhì)中提取或除去某些煙草成分，抑或添加一些新的成分改善薄片的物理化學與燃燒性能。薄片的主要成分還是煙葉和煙梗，所以這些原材料如果沒有經(jīng)過完全的發(fā)酵和降解，內(nèi)部含有對煙草燃吸有副作用的淀粉，大大降低煙草薄片的品質(zhì)。
[0003]鞘氨醇單胞菌在環(huán)境中分布極廣泛，而且對惡劣環(huán)境有很強的忍耐性(如極地、強輻射等極端環(huán)境中都曾發(fā)現(xiàn)了鞘氨醇單胞菌的存在)。鞘氨醇單胞菌的降解底物范圍廣，如對二噁英類、酚類、偶氮染料等芳香化合物以及異型生物質(zhì)聚合體等的降解都有相關(guān)報道。由于鞘氨醇單胞菌對芳香化合物有極為廣泛的代謝能力，并且該菌屬某些菌種能夠合成有價值的胞外生物高聚物，因此，近年來鞘氨醇單胞菌成為被關(guān)注和研究的熱點。
[0004]煙草多酚是在煙株葉和莖兩個主要部位合成的帶有一個或多個羥基的芳香環(huán)化合物，其在煙草中的含量較高，約為干葉重量的0.5 — 2.5%。在煙草中發(fā)現(xiàn)的多酚類化合物包括單寧類(綠原酸的異構(gòu)體、咖啡酸和奎尼酸)、香豆素類(莨菪亭和莨菪亭的糖苷衍生物)、黃酮類(芳香苷、黃酮、鼠李糖、黃酮醇)和花色素類(花色素-3-蕓香糖苷、花葵素-3-蕓香苷、堪非醇)四大類共約135種。其中綠原酸和蕓香苷是煙草中最主要的多酚類物質(zhì)，綠原酸占多酚類物質(zhì)總量的75— 95%。多酚是煙葉中的重要香氣前體物，多酚含量與烘烤后的煙葉顏色和卷煙香氣密切相關(guān)。在吸煙過程中，多酚及其熱解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到煙氣中，對煙氣香味有直接影響。在合理的調(diào)制、陳化條件下，植物多酚類化合物經(jīng)一系列反應降解生成多種物質(zhì)，這些降解產(chǎn)物能賦予煙草制品優(yōu)雅的香氣，增加煙草制品的香氣量，對改善煙草制品的品質(zhì)有極其重要的作用。
[0005]煙草中的多酚化合物含量對煙草品質(zhì)有著重大影響。在一定范圍內(nèi)，多酚化合物含量與煙葉品質(zhì)呈正相關(guān)。這是因為在調(diào)制、醇化和燃燒過程中，多酚類化合物可氧化分解生成一些能賦予煙草制品優(yōu)雅清香氣味和增加煙草制品香氣量的化合物，因此它們對改善煙草制品的品質(zhì)有重要作用。然而，多酚類化合物含量超出一定范圍時，煙葉不同程度帶有多種品質(zhì)缺陷，如:有青雜氣和刺激性、香氣質(zhì)單調(diào)、香氣量不足等，不能直接用來生產(chǎn)卷煙。更為重要的是，過量的多酚化合物對人體有毒性，會影響吸煙者的健康。因此，如何降低煙草中多酚類化合物的含量是煙草工業(yè)中的重要環(huán)節(jié)。現(xiàn)有研究表明微生物技術(shù)在降解煙草多酚化合物過程中發(fā)揮重要作用。因此，目前極需要開發(fā)出在合適條件下適用于煙草薄片的能較好發(fā)揮多酚類化合物降解效果的微生物菌株。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明目的在于提供一種鞘氨醇單胞菌xp，將其用于降解煙草薄片中的多酚類化合物，降解效果好。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種鞘氨醇單胞菌菌株XP，其分類命名為sp.,該菌株xp在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為=CCTCC No:M 2011453，保藏日期:2011年12月9日，保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(武漢大學)。
[0008]所述鞘氨醇單胞菌菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用。
[0009]所述鞘氨醇單胞菌菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，具體為:將鞘氨醇單胞菌株xp用LB培養(yǎng)基復蘇(30°C培養(yǎng)24h)，然后接種到含有綠原酸或煙草浸提液的無機鹽培養(yǎng)基中，28 - 32°C培養(yǎng)2 — 24 h后離心收集菌體，無機鹽培養(yǎng)基清洗I 一5次后，用無機鹽培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整至OD6tltl值為2.0 — 5.0，所得懸浮液即為種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液在28 - 32°C、濕度55 - 65%條件下均勻噴灑于煙草薄片表面或施加于造紙法薄片的水溶性浸提液中。
[0010]具體的，所述含有綠原酸或煙草浸提液的無機鹽培養(yǎng)基中，綠原酸濃度為0.2 -1.0g/L，煙草浸提液濃度為0.05 — 0.2 ml/L。綠原酸或煙草浸提液用以作為鞘氨醇單胞菌菌株xp生長的唯一碳源。本發(fā)明所述鞘氨醇單胞菌xp在綠原酸添加量為0.2 — 1.0g/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)時生長情況良好，更高濃度的綠原酸能抑制鞘氨醇單胞菌xp的生長。`
[0011]所述煙草浸提液可經(jīng)下述方法獲得:取Ig煙末和煙梗，粉碎后加入55 - 65%乙醇于45 — 55°C水浴萃取30 - 60min (每10 min搖勻一次)，萃取結(jié)束后過濾，濾液即為煙草
浸提液。
[0012]較好的，所述無機鹽培養(yǎng)基的配方為:每1000ml去離子水中含2.44g Na2HPO4,
1.52g ΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4^0.2g MgSO4.7Η20、0.05g CaCl2.2Η20和 IOml 微量金屬鹽溶液SL-4 ;其中，所述微量金屬鹽溶液SL-4組成為:1000ml去離子水中含有0.50g EDTA、0.20gFeSO4.7Η20和100ml微量金屬鹽溶液SL_6 ;所述微量金屬鹽溶液SL-6組成為:1000ml去離子水中含有 0.1Og ZnSO4.7Η20、0.03g MnCl2.4Η20、0.30g Η3Β03、0.20g CoCl2.6Η20、0.01gCuCl2.2Η20、0.02g NiCl2.6Η20 和 0.03g Na2MoO4.2H20。
[0013]本發(fā)明所提供的菌株鞘氨醇單胞菌株xp (Sphingomonas sp.)在無機鹽培養(yǎng)基中利用綠原酸或煙草浸提液為唯一碳源生長后，能夠降解煙草薄片中的多酚類化合物。在利用鞘氨醇單胞菌XP (Sphingomonas sp.)噴灑于煙草薄片表面,一周后烤煙葉片中的多酹類化合物含量降解率超過25% ；以及將菌株xp施加于造紙法薄片的水溶性浸提液中，4小時后浸提液中的多酚化合物含量降解超過30%。目前所利用的醇化方法中，所需的醇化時間較長，往往會影響產(chǎn)品的周期。本發(fā)明與現(xiàn)有的醇化方法相比，具有快速降解的優(yōu)點，這對于煙草薄片生產(chǎn)醇化過程中的實際應用更具優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是基于微生物菌株xp 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖2是鞘氨醇單胞菌菌株xp在含綠原酸的無機鹽培養(yǎng)基中48h的生長情況；
圖3是菌濃度為0D3.0時，鞘氨醇單胞菌菌株xp在含不同綠原酸的無機鹽培養(yǎng)基中對綠原酸的降解情況。
【具體實施方式】
[0015](一)鞘氨醇單胞菌{Sphingomonassp.)菌株xp的篩選:
由于綠原酸是煙草中最具代表性的多酚類物質(zhì)，本申請以綠原酸作為底物，制作成瓊脂平板。在30°C、24hr的條件下使用煙田土壤水溶液進行涂板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)物經(jīng)過4°C的低溫處理24 - 72hr后，通過熒光倒置顯微觀察細菌對綠原酸的分解效果。由于綠原酸在紫外光(365nm)下顯藍色熒光，具有綠原酸分解能力的菌落周圍的培養(yǎng)基比背景中的熒光變淡變?nèi)酢Ｔ诰G原酸的藍色熒光背景中，能直接分離不受雜菌污染的菌株。根據(jù)綠原酸酶的活性和透明圈直徑的關(guān)系測定不同菌株產(chǎn)生的綠原酸酶活力。在pH值4.0 — 6.0的瓊脂平板上進行篩選培養(yǎng)，即可得到耐酸性菌株xp。
[0016](二)鞘氨醇單胞菌{Sphingomonas sp.)菌株xp的鑒定:
篩選得到的菌株X P為革蘭氏陰性菌，無孢子，以單側(cè)生極性鞭毛運動，呈黃色。委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心對其進行生理生化特性鑒定，結(jié)果見表1和表2，其16S rRNA基因序列比對結(jié)果見表3，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹數(shù)據(jù)見附圖1。
【權(quán)利要求】
1.鞘氨醇單胞菌株XP在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，其特征在于，所述鞘氨醇單胞菌株XP分類命名為Sphingomonas sp.,該菌株xp在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為:CCTCC No:M 2011453。
2.如權(quán)利要求1所述鞘氨醇單胞菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，其特征在于，將鞘氨醇單胞菌株xp用LB培養(yǎng)基復蘇，然后接種到含有綠原酸或煙草浸提液的無機鹽培養(yǎng)基中，28 - 32°C培養(yǎng)2 — 24 h后離心收集菌體，無機鹽培養(yǎng)基清洗I 一 5次后，用無機鹽培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整至OD_值為2.0 — 5.0，所得懸浮液即為種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液在28 - 32°C、濕度55 - 65%條件下均勻噴灑于煙草薄片表面或施加于造紙法薄片的水溶性浸提液中。
3.如權(quán)利要求2所述鞘氨醇單胞菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，其特征在于，所述含有綠原酸或煙草浸提液的無機鹽培養(yǎng)基中，綠原酸濃度為0.2 — 1.0g/L，煙草浸提液濃度為0.05 - 0.2 ml/L。
4.如權(quán)利要求2或3所述鞘氨醇單胞菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，其特征在于，所述煙草浸提液經(jīng)下述方法獲得:取Ig煙末和煙梗，粉碎后加入55 -65%乙醇10 - 30ml于45 — 55°C水浴萃取30 — 60min，萃取結(jié)束后過濾，濾液即為煙草浸提液。
5.如權(quán)利要求2或3所述鞘氨醇單胞菌株xp在降解煙草薄片中多酚類化合物方面的應用，其特征在于，所述無機鹽培養(yǎng)基的配方為:每1000ml去離子水中含2.44g Na2HPO4,·1.52g ΚΗ2Ρ04、0.5g (NH4)2SO4^0.2g MgSO4.7Η20、0.05g CaCl2.2Η20和 IOml 微量金屬鹽溶液SL-4 ;其中，所述微量金屬鹽溶液SL-4組成為:1000ml去離子水中含有0.50g EDTA、0.20gFeSO4.7Η20和100ml微量金屬鹽溶液SL-6 ;所述微量金屬鹽溶液SL-6組成為:1000ml去離子水中含有 0.1Og ZnSO4.7Η20、0.03g MnCl2.4Η20、0.30g Η3Β03、0.20g CoCl2.6Η20、0.01gCuCl2.2Η20、0.02g N iCl2.6Η20 和 0.03g Na2MoO4.2H20。
【文檔編號】C12R1/01GK103773728SQ201410047528
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】馬宇平, 周浩, 王墨染, 李國政, 許平, 唐鴻志 申請人:河南中煙工業(yè)有限責任公司