專利名稱：：用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種生物芯片，特別是涉及用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片。
背景技術(shù)：
：活性污泥是一種十分復雜的環(huán)境樣品，它是由細菌等微生物和原生動物、后生動物等微型動物組成的生態(tài)系統(tǒng)，因此，活性污泥具有菌群結(jié)構(gòu)多樣、菌群功能復雜等特點，而研究活性污泥群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化對于了解活性污泥菌群分布與功能的關(guān)系、環(huán)境因素改變對其微生物生態(tài)的影響等則具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的微生物分析測定方法，包括顯微鏡微生物形態(tài)觀察、最可能計數(shù)法、選擇性培養(yǎng)基計數(shù)、純種分離和生理生化鑒定等，這些方法在環(huán)境樣品研究中都存在選擇性強，工作量大等缺陷且不是所有微生物都能在培養(yǎng)基上生長，因此，不能全面客觀的反映復雜菌群的種類和數(shù)量，據(jù)調(diào)査，培養(yǎng)法只能分離培養(yǎng)到某復雜菌群0.1%—10%的菌株。近年來，人們開始應用微生物生物化學分類的一些生物標記包括呼吸鏈泛醌、脂肪酸等來進行純種微生物分析，但由于環(huán)境樣品的復雜性，該類技術(shù)仍不適合于由多種細菌組成的環(huán)境樣品菌群分析。目前，環(huán)境樣品微生物菌群研究主要通過DNA指紋圖譜技術(shù)來實現(xiàn)，包括變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)、核糖體擴增DNA限制性片斷分析(AmplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、隨意擴增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、限制性片斷長度多態(tài)性分析(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)等，這些技術(shù)各有優(yōu)缺點，在不同環(huán)境樣品微生物菌群分析中均有不同程度的應用，如SmitE.等利用ARDRA技術(shù)分析了銅污染對土壤菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響；SusanneL.等則利用DGGE技術(shù)研究了脫氮生物反應器中污泥菌群的多樣性；柴麗紅等應用DGGE法對青海相鄰兩鹽湖中細菌多樣性進行了快速檢測，RimaB.Franklin等利用RAPD比較區(qū)分了不同水樣的微生物菌群。DNA指紋圖譜技術(shù)相對培養(yǎng)的方法快速、簡單，通過DNA指紋區(qū)別圖譜分析可反映出環(huán)境樣品菌群微生物的變化及其狀態(tài)，但是該方法仍存在一定問題，主要有不能提供菌群有關(guān)具體組成和變化的具體詳細信息、重復性差等。近年來，也有利用系統(tǒng)寡核苷酸芯片對堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進行了微生物檢測、菌群動力學的報道，如DeSantis等利用含297，851個16SrDNA探針的高密度芯片對三種環(huán)境樣品(水、土壤、氣溶膠)的微生物種類進行了分析，結(jié)果表明該芯片技術(shù)雖然不能鑒定新菌種，但在分析環(huán)境樣品時能比克隆測序方法獲得更多的生物多樣性。該技術(shù)雖在一定程度上克服了DNA指紋圖譜技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)或克隆測序方法的缺陷，但由于有關(guān)研究都是建立在有限的可培養(yǎng)微生物的基礎上，因此提供的菌群種類信息少，不能全面反映環(huán)境樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)，更為關(guān)鍵的是，它不能及時反映菌群的變化。操作分類單元(OTU，operationaltaxonomicunits)屬于一種分類，位于屬和種之間，目前一般的分類標準是將克隆子序列相似性分別大于80%、85%、90%、92%、94%、97%分別歸于同一個門、綱、目、科、屬、0UT。截止目前，尚未見利用16SrRNA文庫構(gòu)建獲得的克隆子設計基因芯片探針并制備用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化分析技術(shù)的不足，提供一種信息量大的能敏感、快速用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片，其特征是在玻片或硅片或尼龍膜等材料上固定檢測細菌的DNA探針，所述探針為序列表SEQIDNO.1-SEQIDNO.66所述的核苷酸序列，所述探針所針對的OTU及其代表克隆子Genbank登錄號、各OTU最近源菌株及其相似性的關(guān)系如表1;表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SEQIDNO.140TU30,FJ3485767ZaueraseJe/a"'s，Y17591990TU31,FJ3485857fewerase7e朋"s，Y17591960TU32,FJ348583版臟asp.DNT-1，AB06626296SEQIDNO.470TU32,FJ3485837S朋erasp.DNT-1，AB06626296SEQIDNO.48OTU22,FJ348595叢毛單胞菌科細菌MWH55,AJ556799990TU34,FJ348586jwfo"iViVar《e^"/7osus菌株0K303，AF48743598SEQIDNO.150TU35,FJ437207脅W,》77.0As"er/歸，TM2，AF14894188SEQIDNO.160TU36'FJ437206未培養(yǎng)的^Ze77oKz力rj'osp.GR2-101，DQ84744589SEQIDNO.17OTU37,FJ3486075ora/^i咖ce〃u7os咖DSM14627，EU240497940TU39,FJ348642辦5^ci/7力a卵on/e/ta，AJ83364795SEQIDNO.180TU37,FJ3486075"ora/wi'wfflce77WosfMDSM14627，EU240497940TU39,FJ348642辦5^o/Aa卵c/7/e"ta,AJ83364795SEQIDNO.490TU38,FJ348640"65^//0朋加/20柳>30^'s咖f朋fsAS03-1，EU29653784SEQIDNO.500TU39,FJ348642^jwo/7力a^acrue/ta,AJ83364795SEQIDNO.51SEQIDNO.19OT,，F(xiàn)J3486325柳/atoasp.M5A，AF11027585SEQIDNO.520TU41,FJ348633Z柳'麼"arfresofe/n'e"w'sW03-356，AM74739395SEQIDNO.530TU42,FJ3486415Ye"otr。/力。/z7o)as鵬7to/7力i7iaG2，EU92714599SEQIDNO.200TU43,FJ348634^SY/"印tococc"5"/zw'"sATCC15914,AY28107699SEQIDNO.540TU44,FJ348630Za"ococcwsraf/7/o7ac"sDSM20443，EF694030990TU45,FJ348637Zsctococci/ssp.Fl16,EF204365930TU46,FJ348612Z:a"oc。c，raf/Y"^"ADSM20443,EF69403094SEQIDNO.210TU44,FJ348630Za"ococ譜raf/i"o/sc"sDSM20443，EF694030990TU46'FJ348612Zs"ococ，ra/yY"o7ac"sDSM20443,EF69403094SEQIDNO.220TU45,FJ348637Zactococc"ssp.F116，EF20436593SEQIDNO.230TU47,FJ348635未培養(yǎng)的fi/力acterAMsp.，AM42221796SEQIDNO.24SEQIDNO.250TU48,FJ348636未培養(yǎng)的5actero/cfessp.LKC3198.17，AY51026294SEQIDNO.26SEQIDNO.550TU49,FJ3486386"e(/////2i6acter/wj!sa7啦"e鵬，EF40787998SEQIDNO.27OT,，F(xiàn)J348629Sec/i/i7/"/力3cter7'咖sa7/B。"e咖，EF40787991SEQIDNO.560TU51,FJ348639未培養(yǎng)的^a"erw'ofe2^s克隆子，CU46672598SEQIDNO.28SEQIDNO.29OTU52'FJ348617未培養(yǎng)的5acteroiofetes克隆子g35，EU97904494SEQIDNO.30OTU53,FJ348616污水處理廠分離的16SrRNA克隆子，CU46673198SEQIDNO.310TU55,FJ348613未培養(yǎng)的細菌克隆子SXUA031,AY86308195SEQIDNO.570TU56,FJ348643未培養(yǎng)的0^0/7力a《asp.，AM26811996SEQIDNO.580TU57,FJ348631鞘脂桿菌屬細菌TP498,EF636197940TU58,FJ348645v^7exife"er郷re《雄IFO15974，AB07803888SEQIDNO.320TU59,FJ348628Runellasp.THWCSN44,AM888195960TU60,FJ348647Runellasp.THWCSN44,AM88819594SEQIDNO.590TU61,FJ348618鞘脂桿菌屬細菌TP524,EF63619993SEQIDNO.33SEQIDNO.600TU62,FJ348621未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU177727960TU65,FJ348615未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU17772793SEQIDNO.340TU62,FJ348621未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33,EU177727960TU65,FJ348615未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr33，EU17772793SEQIDNO.350TU63,FJ348620未培養(yǎng)的腐螺旋菌科克隆子Epr80，EU17773495SEQIDNO.360TU66,FJ348623尸7arafecten'咖cwc'sR2A45-3，EF12699398SEQIDNO.610TU67,FJ348622尸7arate"eW咖sp.THWCSN34，AM88819195SEQIDNO.62SEQIDNO.370TU68,FJ348611C。cc/"/s"》esre/7Z7ico2aIMCC1411,EF10821286SEQIDNO.63SEQIDNO.380TU69,FJ348625#ic_rQ/W7//"a《7yco議/7/ca，ABO1260797OT腦，F(xiàn)J348627未培養(yǎng)的i/3ti-a印or朋^7'aceae克隆子SHBZ911，EU63927799SEQIDNO.390TU69,FJ348625WcrOjRrwi朋^/7COe"/ca,ABO1260797SEQIDNO.64OT腦，F(xiàn)J348627未培養(yǎng)的T/t—ras/or朋《/aceae克隆子SHBZ911，99SEQIDNO.40EU639277SEQIDNO.410TU11,FJ348605尸aracoccwsa7cah'一7usmku-E2，DQ402044910TU71,FJ348648未培養(yǎng)的cy朋o6a"erj'咖屬細菌克隆子GL2-53,DQ84744195SEQIDNO,420TU72,FJ348626未培養(yǎng)的浮霉狀菌屬細菌克隆子DEL04,AJ61626098SEQIDNO.430TU73,FJ348624未培養(yǎng)的酸桿菌屬細菌克隆子1013，AF36818099SEQIDNO.65陽性對照所有真細菌SEQIDNO.66陽性對照_所述為操作分類單元:利用本發(fā)明的群落芯片分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，具有適時、靈敏、快速、準確、高效且獲得菌群變化信息量大等特點。本發(fā)明可以快速分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)，同一張芯片可以同時檢測代表不同分類層次(門、綱、目、科、屬)的57種0TUs。圖1為耙基因16SrDNA的基因結(jié)構(gòu)示意圖；排列示意圖；圖3為各OTU的特異性圖譜；圖4為不同C/N下的本發(fā)明芯片雜交圖譜。具體實施例方式本發(fā)明考慮到死亡細菌RNA的易降解性，因此通過提取RNA進行RT-PCR則更能及時而敏感的反映菌群的動態(tài)變化，并且避免死細菌核酸的干擾。為了更全面的反映活性污泥微生物菌群的組成，本發(fā)明利用活性污泥16SrRNA基因文庫的克隆子設計各操作分類單元(OTU，operationaltaxonomicunits)(屬于一種分類，位于屬和種之間，目前一般的分類標準是將克隆子序列相似性分別大于80%、85%、90%、92%、94%、97%分別歸于同一個門、綱、目、科、屬、OTU)代表克隆子的特異性探針，并且通過將各OTU的特異性DNA探針按照一定陣列固定在玻片或硅片或尼龍膜等材料組成本發(fā)明的群落芯片。本發(fā)明的一種用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片的技術(shù)利用兩對通用引物擴增并標記不同活性污泥樣品中相應細菌的靶基因，擴增產(chǎn)物與正常成熟活性污泥的微生物群落芯片雜交后，可以檢測和分析不同運行條件或功能狀態(tài)污泥樣品中細菌種類的變化。下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步的說明。實施例l活性污泥RNA的提取取一定量預處理后的污泥樣品并加入溶菌酶(20mg/mL)于37'C作用10min后，加入1mLTRIzol(為商品名稱)，漩渦振蕩5min后，10000r/min離心10min;取上清加入200叱氯仿，漩渦振蕩15s后，10000r/min離心10min;取上清并加入等體積異丙醇，-20。C放置20min;10000r/min離心10min，棄上清；加入75%乙醇洗滌沉淀后，10000r/rain離心5min，棄上清并風干沉淀；經(jīng)少量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解核酸沉淀后，加入脫氧核糖核酸酶I(無核糖核酸酶污染)并于37'C作用15min;進一步采用RNA純化試劑盒純化RNA。其中，所有耗材都要經(jīng)過DEPC處理及高壓滅菌。實施例2活性污泥菌群待分析菌株16SrRNA基因片段的獲得(1)利用cDNA試劑盒(Tiangen，中國)獲得活性污泥總cDNA;(2)采用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')直接擴增總cDNA中的細菌16SrDNA片段；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara，中國)回收目的片段；(4)通過TA克隆技術(shù)將擴增的16SrDNA片段轉(zhuǎn)化到E.coliDH5d中，藍白斑篩選挑取450個陽性克隆子，建立16SrDNA克隆文庫；(5)采用RFLP方法對克隆子進行分析，選出酶切帶譜不同的重組子進行測序；(6)根據(jù)測序結(jié)果，用Blast搜索程序從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16SrRNA基因序列。采用DNAMAN軟件進行多序列比對，將克隆子序列相似性大于97%的歸于同一個操作分類單元(OTU)并將不同OTU的代表序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得核酸序列注冊登錄號。(7)選擇各OTU的代表克隆子為研究對象，以pMD18-T載體通用引物(BcaBESTPrimerRV-M:5，-GAGCGGATAATTTCACACAGG-3，與BcaBESTPrimerM13-47:5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3')為上游引物和下游引物，利用PCR獲得活性污泥菌群待分析菌株16SrRNA基因片段。實施例3通用引物的設計以16SrRNA基因為耙基因(圖1)(1)采用DNAMAN軟件，對活性污泥樣品16SrRNA文庫各0TU代表克隆子進行序列比對。得到堿基序列比對(2)根據(jù)堿基序列比對圖，在16SrRNA基因的保守區(qū)設計通用引物；根據(jù)引物設計原則和活性污泥各0TU代表變異區(qū)域存在位點，分別選擇含有V3可變區(qū)的410-600bp區(qū)域(A區(qū)域)和含有V5、V6可變區(qū)的860-1130區(qū)域(B區(qū)域)為PCR擴增區(qū)域。所述引物為2對，分別為<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4探針的設計群落基因芯片技術(shù)是一種反相固相雜交技術(shù)，其菌群分析功能主要依賴芯片上所固定的特定探針，探針的序列和種類是制備基因芯片的關(guān)鍵。1)采用DNAMAN軟件，對活性污泥樣品16SrRNA文庫各OTU代表克隆子進行序列比對。得到堿基序列比對2)根據(jù)堿基序列比對圖，在16SrRNA基因的V3、V5和V6區(qū)域設計探針；設計出各OTU探針后，將候選序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，篩選出特異性較好的探針并在其5'端加入由15個T組成的斷臂分子同時5'末端氨基化修飾。實施例5用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片的制備在玻片或硅片或尼龍膜等材料上固定檢測細菌的DNA探針，所述探針為序列表SEQIDNO.1-SEQIDNO.66所述的核苷酸序列，所述探針所針對的OTU及其代表克隆子Genbank登錄號、各OTU最近源菌株及其相似性的關(guān)系如表1;1.探針排列見圖2，在圖2中1，20TU2;30TU3;4,5OTU5;6OTU7,12;7OTU8,9;8，90TU13;10OTU16;11,44OTU17;120T謂；13OTU22;14OTU30，31,32;15OTU35;160TU36;17，180TU37，39;19OTU40;20OTU43;21OTU44，46;22OTU45;23,24OTU47;25，260TU48;27OTU50;28，560TU51;29OTU52;30OTU53，54;31OTU55;32OTU59，60;33,59OTU61;34,60OTU62,65;35OTU63;36OTU66;37,63OTU68;38,39OTU69;40,64OTU70;41OTUll,71;42OTU72;43OTU73;45OTU20;46OTU23;470TU32;48OTU22,34;49,OTU38;50,51OTU39;520TU41;53OTU42;54OTU44,45,46;55OTU49;57OTU56;58OTU57,58;61,62OTU67;65,66陽性對照；67,陰性對照(50%DMSO).2.基因芯片的制備過程采用50%二甲基亞砜溶解探針，使其終濃度為llag/pL，然后依次轉(zhuǎn)移到384孔板中，將其置于基因芯片點樣儀(Spotarray72)上。啟動Spotarmy的控制軟件，運行程序，按照圖2所示的排布方式將各探針點在醛基化的玻片上的點樣區(qū)內(nèi)，點之間的距離為5mm，每種探針重復點樣3次。將點好樣的芯片室溫下過夜干燥后，在45'C的烘箱內(nèi)干燥2h，用交聯(lián)儀(UVPcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交聯(lián)2次后即可使用。實施例6熒光待測樣品的制備1.cDNA第一條鏈的合成采用隨機引物獲得活性污泥樣品總cDNA。RT反應體系5XAMVbuffer4叱隨機引物(10pmolA4j1叱dNTP(10pmol/PL)2叱AMV(5U/叱)1叱Rnase抑制劑(40U/叱)0.5叱模板(RNA)5叱加入DEPC處理水至反應體系總體積為20叱。反應條件42。C延伸60min后，72。C處理10min。2.樣品的熒光標記方法樣品的熒光標記采用不對稱PCR法。不對稱PCR由兩輪完成。第1輪反應體系如下所示。待第1輪反應完成后，將200^LPCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化并最后定容至50iaL，具體方法按說明書進行。PCR反應體系Al或Bl(10pmol/nL)1pLA2或B2(10pmol/nL)1pLTaqmix25pL模板(總cDNA或各OTU的16SrRNA基因片段)5iiL或lpL加入ddH20至反應體系總體積為50叱。PCR反應條件:94°C，5min;94°C，25s，55°C，25s，72°C，25s,30個循環(huán);72°C，5min。第2輪反應條件同上。PCR反應體系A2或B2(10pmol批)2Taq0.3dNTP(10mmol/L)0.25pLCy3標記的dUTP(25nmo1)0.35XPCRbuffer5pL模板(純化后的一輪PCR產(chǎn)物)40|nL加入ddH20至反應體系總體積為50叱。實施例7芯片雜交和檢測將A、B區(qū)域二輪PCR擴增產(chǎn)物各1pL與8pL雜交液(UnihybTelechem公司)混合后，點到基因芯片上探針陣列區(qū)域(載玻片已放入雜交盒并蓋上蓋片)，注意蓋片與載玻片之間不可留有氣泡，同時向盒內(nèi)加入100^iL水以保持濕度。擰緊雜交盒并放入50。C水浴鍋內(nèi)保溫60min后取出雜交盒，拿出玻片，依次將玻片分別放入WBA(1XSSC，10%SDS)、WBB(0.05XSSC，腦SDS)、WBC(0.05XSSC)洗脫液中各洗滌1min。采用Genepixpersonal4100A生物芯片掃描儀對雜交后的微生物群落芯片進行信號掃描和檢測，結(jié)果分析軟件及版本為GenepixPro6.0，掃描分辨率為10ym，掃描結(jié)果分別保存為.tiff和.jpg格式。各OTU特異的雜交圖譜見圖3。實施例8用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片的應用將用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片與發(fā)生污泥膨脹之前不同階段(通過改變進水水質(zhì)C/N實現(xiàn)污泥膨脹，進水C/N分別為16(I)、41(11)、43(III)、49(IV)、52(V))的污泥PCR產(chǎn)物與同一張芯片上的不同陣列進行雜交，觀察污泥膨脹過程中菌群變化情況。不同C/N下的本發(fā)明芯片雜交圖譜結(jié)果見圖4。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所〈120〉用于分析活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的群落芯片〈160〉66<210〉1〈211〉20<212>腿〈213>人工合成<220>〈221〉gene<222〉(1)…(20)〈400〉1tcctttctcgcaagagacac20<210>2〈211〉18〈212>DNA<213〉人工合成〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(18)〈400>2gtgaccgttccagagatg18〈210>3〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉gene<222〉(1)…(18)<400>3tatcgcggcctcagagat18〈210〉4<211>18<212>DNA<213〉人工合成〈220>〈221〉gene<222〉(1)…(18)<400>4ttagcgaccgactccgaa1813<210>5<211〉20〈212〉DNA<213>人工合成<220>〈221〉gene〈222〉(1)…(20)<400>53g肪atgglCgCg333Ct3gg20〈210>6〈211>16<212〉DNA〈213〉人工合成<220〉〈221〉gene〈222>(1)…(16)〈400〉6tgccacgacgacttcc16〈210>7<211〉15<212〉薩〈213>人工合成〈220>〈221〉gene〈222〉(1)…(15)〈400>7cggtcgcggtttcca15<210〉8〈211〉20<212〉DNA<213〉人工合成〈220〉〈221〉gene<222〉(1)…(20)〈400〉8gcgtgttacccagagagatt20〈210>9〈211〉19<212〉DNA<213>人工合成〈220>〈221〉gene<222>(1)…(19)<400>9atttggggtccacttcggt19<210〉10〈211>23〈212>廳〈213〉人工合成<220>〈221〉gene<222>(1)…(23)〈400>10gtgatcgtaggtttcagaaatgt23<210〉11〈211〉19<212>醒〈213〉人工合成〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(19)<400>11tctaaatcctggtgcgagc19〈210>12<211〉18〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(18)<400〉12ggaatcgtcccagcaatg18〈210>13<211>22<212〉腿〈213〉人工合成〈220〉〈22Dgene<222〉(1)…(22)<400>13tctggaatcctgaagagatttg22<210>14<211>17<212〉腿<213〉人工合成〈220>〈221〉gene〈222〉(1)…(17)〈400〉14tcgttcggagcagcaat17<210〉15<211>22〈212>DNA〈213〉人工合成<220><221>gene<222〉(1)…(22)<400>153taggcaag3aaeigtacgagaa22<210〉16〈211〉21〈212〉讓<213〉人工合成〈220〉<221>gene〈222>(1)…(21)<400〉16cagagatgcctttcttcagtt21<210>17<211〉21<212>腿<213>人工合成〈220〉〈221〉gene<222>(1)…(21)<400〉17ctagaaaatgcaggaacctgg21〈210>18<211>22<212〉DNA<213>人工合成〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)…(22)〈400〉18gtcgaa鄉(xiāng)tcggggtgctctt22〈2駆9〈211〉18<212>腿〈213〉人工合成〈220〉〈221〉gene<222>(1)…(18)<400>19gtatcgacccctgctgtg18〈210〉20〈211〉20〈212〉腿<213>人工合成〈220〉〈221〉gene17〈222〉(1)…(20)<400>20tagaccctttccggggttta20<210〉21<211〉22<212〉腿<213>人工合成〈220〉〈221〉gene<222>(1)…(22)<400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