專利名稱：分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物生態(tài)學領域的監(jiān)測方法，具體是一種分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測方法。
背景技術：
長期以來，在利用微生物生態(tài)系統(tǒng)進行生產(chǎn)活動的許多行業(yè)部門，受微生物分離培養(yǎng)技術的限制，無法全面、客觀地認識系統(tǒng)中的群落成員，無法及時動態(tài)跟蹤系統(tǒng)成員種群數(shù)量變化對系統(tǒng)功能的影響，生產(chǎn)效率不僅低，且不穩(wěn)定。而通過分析微生物群落的總基因組DNA的組成，可以比較客觀地認識微生物群落的結(jié)構(gòu)，由于16S rDNA中包含了相應細菌種類的系統(tǒng)分類地位的信息，因此，以16S rDNA為對象可以比較準確地分析微生物群落的種群結(jié)構(gòu)組成。一種常用的技術是構(gòu)建基因文庫。例如，根據(jù)16S rDNA在進化上的保守性特點設計具有不同專一性的通用引物，擴增環(huán)境中所有細菌或某一個類群細菌的16SrDNA，將擴增產(chǎn)物克隆到載體上構(gòu)建成基因文庫，通過分析一定數(shù)量的克隆子的序列以及它們的出現(xiàn)頻率，可以在一定程度上了解環(huán)境樣品中的主要細菌類群及其出現(xiàn)豐度等種群結(jié)構(gòu)信息。這種方法需要進行克隆、測序等分子水平的工作，需要良好的實驗條件和專用設備，耗費人力、財力和時間都較大，難以在醫(yī)院、工廠等實際生產(chǎn)場所應用。另外，由于PCR擴增的偏好性，對生態(tài)系統(tǒng)樣品中的種群結(jié)構(gòu)的測度準確性也不特別高。目前基于16S rDNA擴增用的較多的還有通過溫度梯度凝膠電泳或變性梯度凝膠電泳分析PCR擴增得到16SrDNA可變區(qū)(如V3區(qū))序列的多樣性，從而反映微生物區(qū)系的復雜性。但這種方法也只能對大小為500bp以下的序列進行有效分離，而且當微生物種類過多時，同一個條帶可以包含多個種類的DNA信息，因此，不能做到在較高的分辨率下分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。
對微生物生態(tài)系統(tǒng)進行動態(tài)檢測和平行比較的方法還有基于環(huán)境樣品中微生物總基因組的RAPD指紋圖譜技術。該技術是用短的(8-12bp)隨機的單個引物序列通過PCR擴增技術便可獲得樣本的指紋圖譜，由于每條引物序列均很短，會在整個樣本的基因組DNA上隨機退火，只要2個引物在模板上的結(jié)合位點相近，結(jié)合方向互補，就可以擴增得到DNA片段。1999年Wikstromd等人報道了(Biomonitoring complex microbial communities using random amplifiedpolymorphic DNA and principal component analysis，用RAPD結(jié)合主成分分析技術生物檢測復雜的微生物群落)用6個不同的傳統(tǒng)短引物RAPD分析實驗室的2個模擬裝置“Flask system”和“ Bioreactor system”中微生物群落結(jié)構(gòu)在3周內(nèi)RAPD指紋圖譜的變化情況，結(jié)果顯示RAPD指紋圖譜在檢測時間內(nèi)較為穩(wěn)定。然而，用這種短的隨機引物的RAPD-PCR技術最大的不足在于引物太短(8-12bp)，獲得的指紋紋圖譜條帶多而復雜，不利于同時分析比較大量數(shù)據(jù)，以及PCR反應本身的可重復性較差，即使同一次實驗的不同反應管也會有差異，不同的操作人員、不同的實驗室差異就更大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有短的RAPD-PCR技術中的不足，提供一種分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測方法，即分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)差異的LP-RAPD-PCR(長引物隨機擴增多態(tài)性DNA的聚合酶鏈式反應)分子生態(tài)監(jiān)測方法，使其具有重復性好、靈敏、簡易的特點。本發(fā)明所用引物長約15-24bp，PCR反應中用一對引物擴增而不是單個的引物，PCR的退火溫度在52度。所涉及用LP-RAPD擴增技術同時比較各種生態(tài)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異及同一生態(tài)系統(tǒng)中微生物種群結(jié)構(gòu)的時空動態(tài)變化，具有重復性高、簡便、快速、靈敏的特點。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，方法步驟如下1)選定一對LP-RAPD引物，長度15-24bp，(G+C)含量50％；2)環(huán)境樣品中混合微生物總基因組DNA的提取；3)LP-RAPD循環(huán)反應，退火溫度在52℃；4)待測生態(tài)系統(tǒng)微生物混合DNA的LP-RAPD產(chǎn)物經(jīng)1.2-1.5％瓊脂糖凝膠電泳；5)通過Southern-Blot印跡雜交檢測。
以下對本發(fā)明的進一步限定首先，選擇或設計研究目標微生物生態(tài)系統(tǒng)的LP-RAPD的引物，并確定PCR反應的循環(huán)程序。不同的研究對象，即不同的微生物生態(tài)系統(tǒng)，提取混合微生物基因組DNA沒有通用的方法，要根據(jù)具體情況采用合適的方法。引物設計的原則是1對長度為15-24bases，(G+C)含量50％，并確定PCR反應的循環(huán)程序，LP-RAPD-PCR的25μL PCR反應體系中，含模板80ng，23mN MgCl22.5μL，2.5mM的dNTP mix 2μL，20pmol的引物各1μL；PCR反應的循環(huán)程序為95℃預變性7min，75℃保溫時加入Taq DNA聚合酶；之后進入循環(huán)，94℃變性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，30個循環(huán)；最后65℃延伸16分鐘。PCR產(chǎn)物要進行濃度測定，PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取大約5μgPCR產(chǎn)物，可以使用市售的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，經(jīng)MO BIO UltraCleanPCR Clean-up DNA Purification kit純化，純化后經(jīng)DyNA quant 200進行濃度測定；LP-RAPD的擴增產(chǎn)物是多種不同大小和序列的DNA片段的混合物，使用某種方法可以對這些DNA片段進行標記，例如地高辛標記，探針標記體系含純化后的PCR產(chǎn)物3μg，10×六核苷酸混合物2μL，dCTP、dGTP、dATP各1mM、dTTP0.65mM、DIG-11-dUTP0.35mM的dNTPs mix 2μL，2u/μL的klenow酶1μL，水補足到20μL，37℃標記20h，反應結(jié)束后加4M LiCl2μL，0.2MPH8.0的EDTA2.5μL，75μL冰冷的無水已醇，混勻后-20℃沉淀至少2h，之后14,000rpm/min離心30min，70％的已醇洗滴，14,000rpm/min離心30min，干燥后溶于50μL無菌水中。
待測目標微生物生態(tài)系統(tǒng)混合DNA的LP-RAPD指紋圖譜，經(jīng)1.2％或1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，真空轉(zhuǎn)跡于帶正電荷的尼綸膜上；真空轉(zhuǎn)跡、固定完畢后，將轉(zhuǎn)移膜浸于50ml Blocking solution中，該溶液組成為0.1M馬來酸，0.15MNaCl，1g Blocking reagent，PH7.5，將膜卷于雜交管中，68℃預雜交至少30min，變性DNA探針，沸水中煮10分鐘，大約500ng，立即置于冰鹽混合物中，用含有探針的雜交液20ml更換預雜交液60℃雜交至少10h，回收含有探針的雜交液，貯存于-20℃，每次用之前68℃變性10min，雜交完畢后，先用50ml2×SSC，0.1％SDS室溫洗膜兩次，每次15min；再用50ml0.5×SSC，0.1％SDS68℃洗膜兩次，每次15min，最后進行顯色反應。
真空轉(zhuǎn)跡，其方法如下①真空轉(zhuǎn)跡框保持清潔干燥，與緩沖瓶、真空泵連接；②將帶口的塑料膜置于支持膜上，去離子水預濕的濾紙和轉(zhuǎn)移膜，可以用硝酸纖維素膜或帶正電的尼綸膜，先后傾斜45度角緩緩鋪于塑料膜窗口下并完全覆蓋該窗口，排除任何氣泡；③凝膠傾斜45度角緩緩置于塑料膜窗口上，排除凝膠與轉(zhuǎn)移膜間的氣泡；④安裝頂框，以四個夾子對稱固定，打開真空泵固定凝膠；⑤加足夠的溶液1，配方為去嘌呤液，0.25M HCl，覆蓋凝膠，穩(wěn)定真空泵在50mbar，所有進一步的處理均在50mbar進行；⑥7min后，傾斜轉(zhuǎn)跡框，擁戴手套的手指輕輕去除凝膠表面液體；⑦加足夠的溶液2，配方為變性液，1.5M NaCl，0.5M NaOH，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；⑧加足夠的溶液3，配方為中和液，1.0M Tris，1.5M NaCl，PH7.5，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；⑨加溶液4，配方為轉(zhuǎn)移液，20×SSC，轉(zhuǎn)移液覆蓋凝膠的厚度為凝膠厚度的兩倍，等待30～40min，徹底移走殘留的液體；⑩關閉真空泵，移走凝膠，取出膜，紫外固定5min，室溫干燥。
顯色反應，其方法如下①在Washing Buffer，配方為0.1M馬來酸，0.15M NaCl，0.3％(v/v)Tween 20，PH7.5，中簡短洗膜1～5min，然后在100ml Blocking Solution中輕搖30min；②在20ml Antibody Solution中，輕搖30min，抗體以1∶5000稀釋于Blocking Solution中；③在100ml Washing Buffer洗膜兩次，每次15min；④在20ml Detection Buffer，配方為0.1M Tris，0.1M NaCl，PH9.5，20℃，中平衡2～5min，用10ml新鮮配置的顯色液再暗處顯色，配方為加200μL的NBT/BCIP到10ml Detection Buffer中；⑤顯色完畢后，將膜侵入去離子水中以終止反應，照相或掃描記錄結(jié)果。
本發(fā)明將LP-RAPD技術應用到研究自然界復雜環(huán)境樣品中，不經(jīng)純培養(yǎng)直接提取環(huán)境樣品中混合微生物的總基因組DNA，其中DNA分子的種類及各分子的相對比例反應了環(huán)境樣品中菌群的種類數(shù)量及種群之間的相對比例，生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成信息轉(zhuǎn)化成了提取到的不同DNA分子的組成和相對比例。不同的環(huán)境樣品DNA分子的組成及相對數(shù)量不同，這種差異又間接地反應在LP-RAPD獲得的指紋圖譜中。在多種細菌組成的微生物群落中，各種細菌當其種群數(shù)量超過總數(shù)量的1-10％時，其特征性LP-RAPD主條帶就可以在群落結(jié)構(gòu)DNA指紋圖中表現(xiàn)出來。因此，在得到的LP-RAPD指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同微生物的基因組DNA片段組成，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，每一條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低，這樣，生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的結(jié)構(gòu)信息，就被間接地記錄在LP-RAPD的指紋圖譜中。因此，分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA經(jīng)LP-RAPD獲得的指紋圖譜的差異，就可分析比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的結(jié)構(gòu)的差異，或者同一個群落在不同功能狀態(tài)下、不同的外界環(huán)境條件下種群結(jié)構(gòu)的變化情況。
對于復雜的環(huán)境樣品，電泳分析LP-RAPD擴增得到的不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落指紋圖譜，不同系統(tǒng)中有很多條帶具有相同的電泳特性但其序列組成信息不同，僅從電泳圖上只能分析DNA條帶大小信息，不能看到更深層次的序列信息，結(jié)合混合探針雜交的技術，可以看到不同生態(tài)系統(tǒng)微生物指紋圖譜的條帶大小差異也可以看到各條帶的序列信息的差異，從而可以實現(xiàn)對微生物群落結(jié)構(gòu)的分析和比較。
本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進步，所涉及的LP-RAPD技術應用到研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物種群的結(jié)構(gòu)，具有重復性高、簡便、快速、靈敏的特點，可以快速、有效地同時平行分析不同生態(tài)系統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)差異以及同一生態(tài)系統(tǒng)微生物種群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。為發(fā)現(xiàn)、鑒別和分離生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢功能菌以及為調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)的功能提供監(jiān)測方法。結(jié)合微生物生態(tài)系統(tǒng)宏觀功能的變化與微生物生態(tài)系統(tǒng)DNA指紋圖譜的變化，進行分析比較，尋找規(guī)律。在DNA指紋圖譜中，常?？梢哉业脚c功能變化相關的DNA條帶，可能來源于環(huán)境中某種起重要作用(如苯酚降解)的功能菌。在這個已知序列片斷的引導下從環(huán)境樣品中直接鑒定分離得到降酚菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)制成活菌制劑投放到污水處理廠，可大大提高活性污泥的降酚能力。根據(jù)來源于腸道功能菌基因組的已知序列，可以設計特異性檢測腸道功能菌的探針和引物用來評價益生素等藥物的藥效及篩選藥物等。


圖1不同長引物對2例純菌DNA和2例兒童腸道微生物DNA擴增的指紋圖譜展示。所用引物如圖中所示。樣品編號1，arthrobacter nicotianae P1-7(AN)；2，klebsiella sp P8-14(KS)；3，3歲健康兒童樣品(A)；4，4歲健康兒童樣品(B)。M為分子量Marker。
圖2.(a)用長引物LP1，LP3對2例6歲健康兒童3個月內(nèi)4次取樣的腸道微生物動態(tài)檢測的指紋圖譜展示；(b)相似性分析樹狀圖。M為分子量Marker。
圖3通過長引物LP1，LP2擴增和分子雜交技術比較分析懸浮污泥和生物模樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。(a)指紋圖譜，(b)分子雜交圖譜。M為分子量Marker。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖提供三項實施例。
實施例一比較研究由4對長引物擴增得到的2例個體腸道微生物指紋圖譜的差異情況，同時檢測其對2個不同種的純菌的區(qū)別能力。研究中用到的長引物序列見表1。
表1實施例中用到的長引物PrimerPrimer sequencenameNE15’-AGTAAGTGACTGGGGT-3’NE25’-TATGTAAGCTCCTGGG-3’LP15’-GTTGATCAGTGTCGTTCCTG-3’LP25’-CCTTTCACTCCCTGATCACT-3’LP35’-CGACCTGCATTGATCTGTAG-3’人體腸道內(nèi)定居著十分復雜而又相對穩(wěn)定的微生物群落。據(jù)估計，1g濕重的糞便樣品中有大約1011個微生物細胞，大概400種以上的不同類型。這些腸道內(nèi)固有的微生物對人體健康有著重要的作用幫助消化、生產(chǎn)人體必需的維生素以及幫助人體抵御外來病原微生物的入侵等；據(jù)報道，結(jié)腸癌可能與腸道微生物種群結(jié)構(gòu)的異常有關。因此，研究腸道微生物的種群結(jié)構(gòu)進而研究腸道微生物的功能具有重要的理論與實際意義。
樣品取自1例3歲健康兒童樣品和1例4歲健康兒童樣品。。收集新鮮的糞便樣品，提取總DNA后，得到由長引物對LP1，LP3擴增得到指紋圖譜，計算Sorenson相似性系數(shù)(pairwise similarity coefficient Cs)，比較凝膠電泳DNA指紋圖譜、分子雜交DNA指紋圖譜的相似性。Cs＝2j/(a+b)×100，其中a是一組DNA指紋圖譜的條帶數(shù)目，b是另一組DNA指紋圖譜的條帶數(shù)目，j是在兩個圖譜中共有條帶的數(shù)目，兩個完全不同的指紋圖譜的Cs值是零，而完全相同的2個DNA指紋圖譜的Cs值是100％。用這個相似性系數(shù)分析圖1的結(jié)果是，從凝膠電泳圖上看，2個純菌與2例兒童糞便樣品指紋圖譜之間的相似系數(shù)Cs值見表2。
表2不同長引物對擴增純菌和糞便樣品DNA指紋圖譜間相似性(Cs)分析NE1，NE2LP1，LP2 LP1，LP3 LP2，Lp3AN/KS 37％50％ 0 13％A/B54％44％ 47％ 50％表2數(shù)據(jù)表明首先，4對長引物可以很好的區(qū)別2例純菌；1例3歲健康兒童和1例4歲健康兒童腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的指紋圖譜差異較大，與文獻報道的用TGGE分析腸道菌群16S rDNA的技術得到的結(jié)論是一致的，即，每例健康個體均有各自獨特的腸道菌群結(jié)構(gòu)。
實施例2對2例健康兒童(C and D)腸道微生物菌群進行連續(xù)3個月動態(tài)監(jiān)測，收集新鮮的糞便樣品，提取總DNA后，得到LP-RAPD指紋圖譜，計算Sorenson配對比較相似性系數(shù)(pairwise similarity coefficient Cs)，從凝膠電泳圖上看(圖2)，每例兒童4次取樣的指紋圖譜之間的最低相似性為86％和83％，兩例兒童指紋圖譜之間的相似系數(shù)Cs值為60％。據(jù)文獻報道以及在后來的工作中均發(fā)現(xiàn)，健康個體腸道微生物的特有的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)在至少一年內(nèi)是穩(wěn)定的，與建立的通過PCR/TGGE指紋圖譜分析腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)得到的結(jié)論一致。
實施例3污水生物處理技術是環(huán)境保護中最重要的技術方法之一。其原理主要是通過微生物對各種有機污染物的降解作用使水凈化。生物膜法處理污水是最為常用的一種處理工藝，其主體都是由各種細菌、真菌、藻類和原生動物等構(gòu)成的復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)，其中生物膜系統(tǒng)的微生物也會與懸浮污水中的微生物進行著相互交換，因此在對系統(tǒng)中微生物種群結(jié)構(gòu)的研究中，人們常常從懸浮污水中取樣研究，代替生物膜上的微生物。究竟懸浮污水樣能否準確反應整個生物膜系統(tǒng)中微生物的菌群結(jié)構(gòu)，通過長引物指紋圖譜結(jié)合分子雜交技術對同一時間取到的2分樣品進行分析比較，結(jié)果顯示(圖3)，長引物擴增得到的生物膜樣的微生物DNA指紋圖譜與懸浮污水樣中微生物DNA的指紋圖譜相似性為70％(根據(jù)雜交結(jié)果計算)，生物模樣的指紋圖譜條帶更為豐富，微生物的濃度更高。這可能由于在生物膜上，微生物的停留時間較水樣長，可以通過微生物新陳代謝更為充分的達到群落的平衡狀態(tài)；在好氧環(huán)境下，也可能生物膜中存在一些厭氧的區(qū)域，而厭氧微生物在水樣中就不能存在。用懸浮污水樣替代生物模樣來研究系統(tǒng)中微生物的組成結(jié)構(gòu)低估了生態(tài)系統(tǒng)中微生物的總量和種類，取懸浮污水樣研究整個生物膜系統(tǒng)微生物的結(jié)構(gòu)和功能是不準確、不科學的。應當取生物膜樣來研究生物膜系統(tǒng)的微生物菌群結(jié)構(gòu)。
權利要求
1.一種分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測方法，其特征在于1)選定一對LP-RAPD引物，長度15-24bp，(G+C)含量50％；2)環(huán)境樣品中混合微生物總基因組DNA的提??；3)LP-RAPD-PCR循環(huán)反應，退火溫度在52℃；4)待測生態(tài)系統(tǒng)微生物混合DNA的LP-RAPD產(chǎn)物經(jīng)1.2-1.5％瓊脂糖凝膠電泳；5)通過Southern-Blot印跡雜交檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的這種并行比較微生物群落結(jié)構(gòu)分子生態(tài)的監(jiān)測方法，其特征是以下對監(jiān)測方法進一步限定首先，設計研究目標微生物生態(tài)系統(tǒng)的LP-RAPD的引物，引物設計的原則是1對長度為15-24bases，(G+C)含量50％，并確定PCR反應的循環(huán)程序，LP-PCR的25μL PCR反應體系中，含模板80ng，23mM MgCl22.5μL，2.5mM的dNTP mix 2μL，20pmol的引物各1μL；PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取大約5μg PCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIOUltraClean PCR Clean-up DNA Purification kit純化，純化后經(jīng)DyNA quant200進行濃度測定；探針標記體系含，純化后的PCR產(chǎn)物3μg，10×六核苷酸混合物2μL，dCTP、dGTP、dATP各1mM、dTTP 0.65mM、DIG-11-dUTP 0.35mM的dNTPsmix 2μL，2u/μL的klenow酶1μL，水補足到20μL，37℃標記20h，反應結(jié)束后加4M LiCl 2μL，0.2M PH 8.0的EDTA 2.5μL，75μL冰冷的無水己醇，混勻后-20℃沉淀至少2h，之后14,000rpm/min離心30min，70％的己醇洗滴，14,000rpm/min離心30min，干燥后溶于50μL無菌水中；待測目標微生物生態(tài)系統(tǒng)混合DNA的LP-RAPD指紋圖譜，經(jīng)1.2％或1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，真空轉(zhuǎn)跡于帶正電荷的尼綸膜上；真空轉(zhuǎn)跡、固定完畢后，將轉(zhuǎn)移膜浸于50ml Blocking solution中，該溶液組成為0.1M馬來酸，0.15MNaCl，1g Blocking reagent，PH 7.5，將膜卷于雜交管中，68℃預雜交至少30min，變性DNA探針，沸水中煮10分鐘，大約500ng，立即置于冰鹽混合物中，用含有探針的雜交液20ml更換預雜交液60℃雜交至少10h，回收含有探針的雜交液，貯存于-20℃，每次用之前68℃變性10min，雜交完畢后，先用50ml 2×SSC，0.1％SDS室溫洗膜兩次，每次15min；再用50ml 0.5×SSC，0.1％SDS68℃洗膜兩次，每次15min，最后進行顯色反應。
3.根據(jù)權利要求2所述的這種并行比較微生物群落結(jié)構(gòu)分子生態(tài)的監(jiān)測方法，其特征是，所述的真空轉(zhuǎn)跡，其方法如下①真空轉(zhuǎn)跡框保持清潔干燥，與緩沖瓶、真空泵連接；②將帶口的塑料膜置于支持膜上，去離子水預濕的濾紙和轉(zhuǎn)移膜，可以用硝酸纖維素膜或帶正電的尼綸膜，先后傾斜45度角緩緩鋪于塑料膜窗口下并完全覆蓋該窗口，排除任何氣泡；③凝膠傾斜45度角緩緩置于塑料膜窗口上，排除凝膠與轉(zhuǎn)移膜間的氣泡；④安裝頂框，以四個夾子對稱固定，打開真空泵固定凝膠；⑤加足夠的溶液1，配方為去嘌呤液，0.25M HCl，覆蓋凝膠，穩(wěn)定真空泵在50mbar，所有進一步的處理均在50mbar進行；⑥7min后，傾斜轉(zhuǎn)跡框，擁戴手套的手指輕輕去除凝膠表面液體；⑦加足夠的溶液2，配方為變性液，1.5M NaCl，0.5M NaOH，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；⑧加足夠的溶液3，配方為中和液，1.0M Tris，1.5M NaCl，PH 7.5，覆蓋凝膠，同上，等待7min，徹底移走殘留的液體；⑨加溶液4，配方為轉(zhuǎn)移液，20×SSC，轉(zhuǎn)移液覆蓋凝膠的厚度為凝膠厚度的兩倍，等待30～40min，徹底移走殘留的液體；⑩關閉真空泵，移走凝膠，取出膜，紫外固定5min，室溫干燥。
4.根據(jù)權利要求2所述的這種并行比較微生物群落結(jié)構(gòu)分子生態(tài)的監(jiān)測方法，其特征是，所述的顯色反應，其方法如下①在Washing Buffer，配方為0.1M馬來酸，0.15M NaCl，0.3％(v/v)Tween 20，PH 7.5，中簡短洗膜1～5min，然后在100ml Blocking Solution中輕搖30min；②在20ml Antibody Solution中，輕搖30min，抗體以1∶5000稀釋于Blocking Solution中；③在100ml Washing Buffer洗膜兩次，每次15min；④在20ml Detection Buffer，配方為0.1M Tris，0.1M NaCl，PH 9.5，20℃，中平衡2～5min，用10ml新鮮配置的顯色液再暗處顯色，配方為加200μL的NBT/BCIP到10ml Detection Buffer中；⑤顯色完畢后，將膜侵入去離子水中以終止反應，照相或掃描記錄結(jié)果。
全文摘要
一種微生物生態(tài)學領域的監(jiān)測方法，具體是一種分析比較微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測方法。具體如下選定一對LP－RAPD引物，長度15－24bp，(G+C)含量50％；環(huán)境樣品中混合微生物總基因組DNA的提??；LP－PCR循環(huán)反應，退火溫度在52℃；待測生態(tài)系統(tǒng)微生物混合DNA的LP－RAPD產(chǎn)物經(jīng)1.2－1.5％瓊脂糖凝膠電泳；通過Southern－Blot印跡雜交檢測。本發(fā)明具有重復性高、簡便、快速、靈敏的特點，可以快速、有效地同時平行分析不同生態(tài)系統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)差異以及同一生態(tài)系統(tǒng)微生物種群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。
文檔編號G01N21/78GK1588010SQ200410066588
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權日2004年9月23日
發(fā)明者趙立平, 魏桂芳 申請人:上海交通大學