專(zhuān)利名稱(chēng)：一種口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人體共生菌群和公共衛(wèi)生領(lǐng)域，具體的講是通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)，得到人體口腔系統(tǒng)以唾液微生物群落為代表的口腔共生菌群相關(guān)的物種和基因組信 息，針對(duì)不同健康狀態(tài)人群建立的一種口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)及其在疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)測(cè) 和診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為人類(lèi)健康的一個(gè)重要組成部分的口腔健康，在很大程度上影響生活質(zhì)量，因 此口腔疾病的預(yù)防非常重要?？谇患膊?，如齲齒、牙周病、口腔黏膜病、口腔癌、HIV的口腔 表現(xiàn)、走馬疳和口腔頌面外傷，均為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由于疼痛難忍、功能損害和生活 質(zhì)量下降，口腔疾病對(duì)個(gè)體和社區(qū)的影響不容忽視。世界衛(wèi)生組織一直致力于在全世界范 圍喚起人們對(duì)口腔健康的廣泛重視，呼吁和指導(dǎo)各國(guó)政府、社會(huì)各界和個(gè)人采取切實(shí)有效 的措施預(yù)防口腔疾病的發(fā)生，旨在提高全人類(lèi)口腔健康水平。如何提高口腔健康水平，不僅僅是在疾病發(fā)生之后給予補(bǔ)救性治療措施，更重要 的是尋找疾病的病因所在，開(kāi)展疾病的預(yù)防和防控工作，篩選疾病敏感人群，開(kāi)展有效的早 期預(yù)防、早期診斷及早期治療。越來(lái)越多的研究使人們逐步認(rèn)識(shí)到人體疾病與健康狀態(tài) 的相互轉(zhuǎn)化不僅取決于人類(lèi)自身染色體所攜帶的遺傳基因，還取決于人體內(nèi)大量共生菌群 間以及與人體自身的相互作用。Peterson等學(xué)者研究認(rèn)為(Peterson，J.，S. Garges, et al. (2009). “ The NIH Human Microbiome Project. “ Genome Res 19(12) :2317_2323)， 人個(gè)體所攜帶的共生菌群數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)構(gòu)成人體本身細(xì)胞的十倍之多，共生菌群基因組理 論的誕生將“人”的含義加以延伸至人類(lèi)個(gè)體所攜帶的微生物群落，正是這些共生菌群賦予 人類(lèi)不依賴(lài)于自身進(jìn)化而獲得的復(fù)雜個(gè)體特征。如此“人”可被定義為人體細(xì)胞和微生物 細(xì)胞的共生組合體，攜帶兩套基因組，一套是從垂直關(guān)系遺傳自父母的人類(lèi)基因組，其編碼 大約2. 5萬(wàn)個(gè)基因；另一套則是出生后才寄生于人體的大量共生菌群，作為人體的第二基 因組，是后天稟賦的主要承載者，其遺傳信息的總和被稱(chēng)為“微生物組”，也可稱(chēng)為“元基因 組”，它所編碼的基因數(shù)量在100萬(wàn)個(gè)左右。兩套基因組相互協(xié)調(diào)、和諧一致，維系了人體的 健康。為全面分析人體微生物群系，揭示人體健康疾病狀態(tài)與人體微生物群系的關(guān)系，美 國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)于2007年12月19日宣布正式啟動(dòng)一項(xiàng)新的基因工程-人體共 生菌群基因組計(jì)劃(HMP)，對(duì)人體內(nèi)5種已知為微生物群落寄生的區(qū)域，包括消化道、口腔、 皮膚、鼻腔和女性泌尿生殖道系統(tǒng)的微生物進(jìn)行表征分析，確定個(gè)體之間是否有共同的核 心人微生物群系的存在，從而加深對(duì)人體微生物群系的變化是否與人體健康狀況相關(guān)的理 解，并構(gòu)建微生物在人體特定區(qū)域的存在及變化情況與特定的疾病之間的聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，率先對(duì)口腔系統(tǒng)微生物菌群 進(jìn)行分析。本數(shù)據(jù)庫(kù)是采用454和Solexa新一代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同人群、不同健康狀態(tài)來(lái)源的口腔唾液微生物進(jìn)行16S rRNA和全基因組測(cè)序，通過(guò)超級(jí)計(jì)算機(jī)運(yùn)算，構(gòu)建的可 以用于人體疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和診斷的口腔微生物菌群數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了生物系統(tǒng)進(jìn)化 樹(shù)上從細(xì)菌、真菌和病毒門(mén)到屬等不同層面的物種信息，且?guī)缀醺采w所有菌種全基因組的、 具有詳細(xì)注釋的功能基因，計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)量高達(dá)105G以上。該結(jié)果使人們對(duì)口腔細(xì)菌種 類(lèi)的認(rèn)識(shí)達(dá)到了前所未有的深度，提供了更多疾病研究、預(yù)測(cè)和診斷的候選基因和切入點(diǎn)。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，是以不同健康狀況人群口腔唾 液為數(shù)據(jù)庫(kù)樣品來(lái)源，通過(guò)DNA的提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和高通量測(cè)序，得到樣品唾液 微生物群落及其基因組信息，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新和維護(hù)。所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，人群包括成人、兒童、老齡人群以及特殊疾 病來(lái)源人群；人群健康狀態(tài)包括完全健康、齲病、牙周病、牙髓病、口臭、難治性根尖炎、糖 尿病、腫瘤放療化療后病人、艾滋病、結(jié)核病和病毒性肝炎。所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，唾液微生物群落特征包括口腔細(xì)菌、真菌和病毒。所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，口腔微生物基因組信息采用454和Solexa 高通量測(cè)序儀得到。所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，基因組信息涵蓋針對(duì)每一種口腔微生物核 糖體的16S、18SrDNA序列和所有微生物的宏基因組序列。本發(fā)明所構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)可以應(yīng)用在臨床口腔疾病、艾滋病、結(jié)核、病毒性肝炎、肥 胖和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)測(cè)和輔助診斷中。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，是通過(guò)收集各種不同疾病來(lái)源(如齲病、 牙周病、難治性根尖炎等)、不同健康狀態(tài)人群的唾液樣品，通過(guò)構(gòu)建16S rDNA、18S rDNA標(biāo) 簽序列文庫(kù)和全基因組文庫(kù)，借助高通量測(cè)序手段，構(gòu)建針對(duì)各樣品的唾液微生物群落數(shù) 據(jù)庫(kù)信息，主要包括以下步驟(以下以齲敏感人群為對(duì)象示例)1)收集不同人群唾液，然后利用裂解緩沖液(50mM Tris，pH8. 0, 50mMEDTA, 50mM sucrose, lOOmM NaCl,l%SDS)裂解細(xì)胞，采用目前已經(jīng)公知的高鹽法提取唾液中微生物的 全基因組DNA(gDNA)。2)對(duì)于16S rDNA標(biāo)簽序列文庫(kù)，通過(guò)合成帶有6個(gè)堿基的樣品特異標(biāo)記的PCR探 針，采用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增樣品DNA的16S高變區(qū)片段，然后將PCR產(chǎn) 物提純后建庫(kù)，利用454上機(jī)測(cè)序。3)通過(guò)對(duì)比 RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)(The Ribosomal Database Project, http://rdp. cme. msu. edu/，其內(nèi)包含有不斷更新的涵蓋細(xì)菌和古菌域的核糖體相關(guān)數(shù)據(jù)，含有大約 1358，426條序列信息截止2010年1月)，同時(shí)利用相對(duì)成熟的聯(lián)合分析流程(主要包括 商業(yè)軟件MOTHUR、ULUST、CD-HIT、RDP-CLASSIFIER等)，借助超級(jí)計(jì)算機(jī)(主要有曙光天潮 TC2600刀片服務(wù)器、天闊A950r-F機(jī)架服務(wù)器和天闊A620r_FX機(jī)架服務(wù)器組成，總計(jì)算能 力達(dá)每秒3. 6萬(wàn)億次)獲得樣品的物種多樣性和豐度信息。4)對(duì)于全基因組(或宏基因組)數(shù)據(jù)庫(kù)，直接將PCR產(chǎn)物提純后建庫(kù)，通過(guò)特異性 標(biāo)i己，禾IJ用 Solexa上機(jī)IlJ序。通過(guò)比對(duì)KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,http://www.genome.jp/kegg/)， CAZyme(Carbohydrate-Active enZYmes Database, http://www. cazy. org/)等大型的全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行相關(guān)代謝途徑的重建 以及功能基因的注釋和分析。5)在上述研究基礎(chǔ)上構(gòu)建唾液微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)含有不同人群口腔樣 品所有微生物菌群(包括各菌群的多樣性及豐度)及其對(duì)應(yīng)的16S rDNA和全基因組信息。按照以上步驟，是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。本發(fā)明基于對(duì)口腔菌群深入了解的基礎(chǔ)上構(gòu)建的針對(duì)特異性疾病及健康人群的 唾液菌群數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)可用于疾病微生物病因?qū)W因素的探討，探尋疾病可能的生物篩 選標(biāo)志以及預(yù)后判斷指標(biāo)，利于發(fā)現(xiàn)疾病內(nèi)部與局部菌群之間的隱秘關(guān)系。以下舉實(shí)施例作進(jìn)--步的描述。
實(shí)施例1
1、高鹽法提取唾液DNA
1)加30iU的蛋白酶K和150 ill的10% SDS到唾液-緩沖液中，53°C水浴中過(guò)夜培養(yǎng)。
2)加入400 ill的5M NaCl并冰上培養(yǎng)lOmin, 13，OOOrpm高速離心lOmin,取上清液。
3)加入800 u 1異丙醇，室溫下培養(yǎng)lOmin, 13，OOOrpm高速離心15min。
4)棄上清液，采用500 u 1 70%乙醇洗沉淀三次，溶于30 ill的EB溶液。
2、16S rDNA標(biāo)簽序列文庫(kù)的構(gòu)建
1)采用帶有獨(dú)特標(biāo)記的引物擴(kuò)增V4-V5高變區(qū)
50 u 1PCR體系包括
lOxbuffer5u 1
dNTP4u 1
DNA polymerase0. 25u 1
H2036. 75 u 1
Primer pair1 u 1*2
template 2 y 1
PCR反應(yīng)條件
94°C，5min
<formula>formula see original document page 5</formula>72°C, lOmin2)切膠回收提純PCR產(chǎn)物，不同樣品以等摩爾數(shù)混合3)按照454FLX Titanium測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)流程建庫(kù)(包括末端補(bǔ)平，接頭連接，小片端去 除，DNA庫(kù)固定，填充空缺以及單鏈DNA庫(kù)的分離)4)按照454FLX Titanium測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)操作上機(jī)測(cè)序(包括乳化PCR擴(kuò)增，珠子的回收和富集以及測(cè)序引物的鏈接后上機(jī)測(cè)序)3、對(duì)于全基因組(或宏基因組)數(shù)據(jù)庫(kù)，樣品DNA經(jīng)提純后直接按照Solexa GA II 標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)流程建庫(kù)(包括氮?dú)獯驍?，末端補(bǔ)平，兩端添加接頭，切膠回收300-400bp片段后 PCR擴(kuò)增)，將構(gòu)建的DNA文庫(kù)在ClusterStation上種植于Flow cell后，經(jīng)橋式PCR擴(kuò)增 并雜交測(cè)序引物后，SolexaGA II上機(jī)測(cè)序。4、數(shù)據(jù)分析16S rDNA 序列1)將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩選(依據(jù)測(cè)序得出的質(zhì)量評(píng)估值，長(zhǎng)度，模糊堿基，可能 的嵌合體的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步篩選)2)對(duì)篩選后的序列進(jìn)行0TU分析(Operational Taxonomy Unit)，統(tǒng)計(jì)菌種多樣
性f曰息。3)對(duì)篩選后的序列進(jìn)行物種鑒定，研究各個(gè)分類(lèi)水平細(xì)菌的種類(lèi)及豐度，尋找在 疾病樣品和健康樣品中從細(xì)菌門(mén)到細(xì)菌屬等不同分類(lèi)水平上菌種豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)于 疾病和健康來(lái)源的樣品，基于整個(gè)微生物群落的種系發(fā)育信息進(jìn)行Unifrac(http://bmf2. Colorado, edu/unifrac/index. psp)分析，比較群落結(jié)構(gòu)差異，基于上述基礎(chǔ)對(duì)疾病的監(jiān)測(cè) 和篩查指標(biāo)進(jìn)行歸類(lèi)。全基因組(或宏基因組)數(shù)據(jù)1)宏基因組數(shù)據(jù)的初步篩選(去除含有模糊堿基的序列)，通過(guò)與人的參考基因 組比較去除人基因組來(lái)源序列2)與代謝數(shù)據(jù)庫(kù)包括KEGG，CAZyme等代謝數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行序列的注釋?zhuān)亟ㄏ?應(yīng)的代謝途徑以及功能基因差異的比較。5、由于口腔微生物涵蓋的細(xì)菌種群復(fù)雜，基因組信息也很龐大。目前該數(shù)據(jù)庫(kù)已 經(jīng)通過(guò)超級(jí)計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新、維護(hù)和后臺(tái)管理。該數(shù)據(jù)庫(kù)信息的訪問(wèn)采用基于付費(fèi) 制度的用戶(hù)名和密碼方式登錄。登錄網(wǎng)站為www. microbialdb. org。以上是結(jié)合具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明所做的進(jìn)一步描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了 解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理， 在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都 落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。
權(quán)利要求
一種口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，是以不同健康狀況人群口腔唾液為數(shù)據(jù)庫(kù)樣品來(lái)源，通過(guò)DNA的提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和高通量測(cè)序，得到樣品唾液微生物群落及其基因組信息，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新和維護(hù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，人群包括成人、兒童、老齡人 群以及特殊疾病來(lái)源人群；人群健康狀態(tài)包括完全健康、齲病、牙周病、牙髓病、口臭、難 治性根尖炎、糖尿病、腫瘤放療化療后病人、艾滋病、結(jié)核病和病毒性肝炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中，唾液微生物群落特征包括口 腔細(xì)菌、真菌和病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中的口腔微生物基因組信息采用 454和Solexa高通量測(cè)序儀得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，其中的基因組信息涵蓋針對(duì)每一種 口腔微生物核糖體的16S、18SrDNA序列和所有微生物的宏基因組序列。
6.權(quán)利要求1所構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)在臨床口腔疾病、艾滋病、結(jié)核、病毒性肝炎、肥胖和糖 尿病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)測(cè)和輔助診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
一種口腔微生物群落數(shù)據(jù)庫(kù)，是以不同健康狀況人群口腔唾液為數(shù)據(jù)庫(kù)樣品來(lái)源，通過(guò)DNA的提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和高通量測(cè)序，得到樣品唾液微生物群落及其基因組信息，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新和維護(hù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)可用于深入分析各類(lèi)人群口腔微生物群落結(jié)構(gòu)組成；用于疾病微生物病因?qū)W因素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)測(cè)和人體健康狀況評(píng)價(jià)。也可以用于篩選疾病診斷的生物標(biāo)志以及預(yù)后判斷指標(biāo)。
文檔編號(hào)G06F19/00GK101833613SQ20101019822
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者凌均棨, 宋厚輝, 徐健, 曾曉維, 楊芳, 王瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所