專利名稱：一種快速分析濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)分析，尤其是關(guān)于濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)分析的一種免培養(yǎng)生物化學(xué)方法。
背景技術(shù)：
與本發(fā)明相關(guān)的發(fā)明、相關(guān)的技術(shù)有磷脂脂肪酸譜圖技術(shù)，檢索發(fā)現(xiàn)，有如專利申請?zhí)枮?00410062448. 2記載了用磷脂脂肪酸譜圖技術(shù)分析土壤微生物群落的多樣性，報(bào)道了一種用于分析土壤微生物群落多樣性的生物化學(xué)方法，稱取一定量的土壤材料；加入緩沖液和有機(jī)試劑，獲得含有脂質(zhì)的有機(jī)相；有機(jī)相經(jīng)硅酸柱分離，收集含有極性脂的洗脫液；在堿性環(huán)境下進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，得到脂肪酸甲酯；使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀定量分析脂肪酸甲酯，得到的樣品中不同種類磷脂脂肪酸的含量；計(jì)算多樣性指數(shù)，判斷土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性情況。對研究微生物群落多樣性及相關(guān)研究，特別是對準(zhǔn)確評價(jià)農(nóng)田生態(tài)、并對將來的發(fā)展進(jìn)行預(yù)測具有十分重要的實(shí)際意義，提供了準(zhǔn)確快速的手段。有如專利申請?zhí)枮?00810031165. X記載了一種同時(shí)提取堆肥樣品中PLFA和DNA的方法，提供了一種同一堆肥中同時(shí)提取和純化磷脂脂肪酸PLFA和脫氧核糖核酸DNA的方法，該提取方法是以脂質(zhì)提取方法為基礎(chǔ)，在相分離后，脂質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，DNA留在水相及固相，最終實(shí)現(xiàn) PLFA和DNA的同時(shí)提??；本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是簡化了堆肥樣品脂質(zhì)和DNA提取的程序，保證了樣品信息來源的同一性，能較好地減小堆肥取樣對檢測方法造成的誤差，同時(shí)，在樣品量很少的情況下顯得更有意義。有如專利申請?zhí)枮?00610046016. 1記載了多環(huán)芳烴污染土壤中原為降解菌及生物修復(fù)能力鑒定方法，利用磷脂脂肪酸分析(PLFA)技術(shù)和穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜技術(shù)(IRMs)結(jié)合鑒定PAHAs污染土壤中原為高效降解菌的新方法，利用磷脂脂肪酸為生物標(biāo)記物，結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)，根據(jù)土壤中提取磷脂脂肪酸的δ值的差異鑒定原位土壤中PAHs的降解菌或菌群，也可分析出已知菌株是否為污染土壤的土著降解菌。 該方法可有效的將微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能結(jié)合起來，提供一種可真實(shí)反應(yīng)PAHs污染土壤中原位降解菌或菌群的方法，從而可以分析出所選菌株是否為污染土壤中的土著降解菌及其降解能力，方法精確度高，非常適用于PAHs污染土壤原位微生物修復(fù)研究和驗(yàn)證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、全貌分析濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的免培養(yǎng)生物化學(xué)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的稱取一定量的窖泥和糟醅或量取一定體積的黃水，進(jìn)行前處理；加入緩沖液和有機(jī)試劑，提取并得到含有脂質(zhì)的有機(jī)相；經(jīng)硅膠小柱分離和溫和甲酯化后，通過有機(jī)試劑提取脂肪酸甲酯；使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行磷脂脂肪酸的定性與定量分析；分析樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是為準(zhǔn)確、全貌地分析濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)、跟蹤分析微生物群落隨不同生產(chǎn)階段的演替規(guī)律，提供了準(zhǔn)確、快速、全貌的分析手段；為微生物發(fā)酵過程的科學(xué)調(diào)控以及優(yōu)質(zhì)白酒的增產(chǎn)提供有利條件。


說明書附圖中為采集自四川某知名濃香型白酒廠窖池的微生物群落結(jié)構(gòu)組成的載荷圖。
具體實(shí)施例方式(固態(tài)樣品預(yù)處理)準(zhǔn)確稱取5.Og樣品，加入30ml檸檬酸緩沖液(pH 4.0)，提取 30min, 4層紗布過濾，濾液2500r/min，離心15min，取上清液，10000r/min離心lOmin，傾去上清液，30ml檸檬酸緩沖液溶解，重復(fù)洗滌3次，收集菌團(tuán)。(液態(tài)樣品預(yù)處理)準(zhǔn)確吸取20.Oml樣品，10000r/min離心lOmin，傾去上清液， IOml檸檬酸緩沖液溶解，重復(fù)洗滌3次，收集菌團(tuán)。取19ml提取液1(檸檬酸緩沖液甲醇氯仿為0. 8 2 1 ν/ν/ν)加至收集的菌團(tuán)樣品中，避光振蕩萃取2h;再加入IOml提取液2(氯仿檸檬酸緩沖液為1 1 ν/ν)，避光靜置萃取24h，去水相，收集有機(jī)相，40士 1°C恒溫，N2吹干.加入適量氯仿溶解，轉(zhuǎn)入經(jīng)5ml氯仿浸潤的硅膠層析小柱，分別用IOml氯仿、丙酮、甲醇逐次洗脫，收集甲醇相，40士 1°C恒溫，N2吹干.隨后加入Iml甲苯甲醇(1 1 ν/ν)，0. 2mol/l氫氧化鉀_甲醇，37士 1°C水浴中保溫15min后，lmol/1乙酸溶液將pH調(diào)至6. 0，加氯仿和超純水各2ml，漩渦震蕩5min，將有機(jī)相移入潔凈樣品瓶中，加入定量標(biāo)準(zhǔn)品(19 0).經(jīng)配備 TR-5MS (30. OmX 320 μ mX0. 25 μ m)的 Trace GC Ultra DSQ II 檢測 FAME 樣品.操作條件如下所述進(jìn)樣口溫度250°C，進(jìn)樣量:0. 5μ 1，分流比10 1 ；載氣(He)流速:lml/min ； 起始柱溫50°C，保持2min ；再以5°C /min升至220°C，保持15min ；質(zhì)譜(EI)的電子強(qiáng)度 70eV ；離子源溫度200°C ；掃描范圍35 400amu.待測樣品各組分質(zhì)譜圖與NIST 05標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對以及保留時(shí)間與37種FAME標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較確定其PLFA組分；以19 O為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各組分的含量。據(jù)此經(jīng)主成分分析(PCA)得到窖池微生物群落結(jié)構(gòu)組成的載荷圖。
權(quán)利要求
1.一種快速分析濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征包括以下步驟1)稱(量)取適量窖池樣品，經(jīng)前處理后加入9ml檸檬酸緩沖液、IOml甲醇、IOml氯仿，提取樣品中的脂質(zhì)；2)將步驟1)中獲得的有機(jī)相經(jīng)硅膠層析小柱分離，分別用IOml氯仿、IOml丙酮和 IOml甲醇，收集含有極性脂的甲醇相；3)將步驟2)得到的含有極性脂的有機(jī)相加入Iml甲苯甲醇((1 1) v/v), Iml 0. 2mol/l氫氧化鉀-甲醇，37°C水浴15min，進(jìn)行堿性條件下溫和甲酯化；4)將步驟3)得到的脂肪酸甲酯通過2ml氯仿萃??；5)向步驟4)得到的脂肪酸甲酯中加入正十九酸甲酯(19 0)定量標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行GC-MS 分析；6)將步驟5)得到的樣品磷脂脂肪酸分布數(shù)據(jù)，基于主成分分析法進(jìn)行窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中的實(shí)驗(yàn)材料可以為不同窖齡濃香型白酒窖池中不同類型的樣品；該方法尤其適合于對窖泥、糟醅和黃水的分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中前處理方法為(窖泥和糟醅)加入30ml檸檬酸緩沖液(pH 4.0)，提取30min，4層紗布過濾，濾液 2500r/min,離心15min，取上清液，10000r/min離心lOmin，傾去上清液，30ml檸檬酸緩沖液溶解，重復(fù)洗滌3次，收集菌團(tuán)；(黃水)lOOOOr/min離心lOmin，傾去上清液，IOml檸檬酸緩沖液溶解，重復(fù)洗滌3次， 收集菌團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟5)中氣相色譜-質(zhì)譜儀采用的是Thermo Trace G⑶ltra DSQ II氣質(zhì)聯(lián)用儀，檢測中使用的升溫程序如下進(jìn)樣口溫度250°C；進(jìn)樣 fi:0. 5μ1 ；分流比10 1 ；載氣(He)流速:lml/min ；起始柱溫50°C，保持2min ；以5°C / min升至220°C，保持15min。質(zhì)譜條件電子強(qiáng)度70eV ；離子源溫度200°C ；掃描范圍 35 400amu。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速分析白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的免培養(yǎng)生物化學(xué)方法，特別是應(yīng)用于濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。具體方法如下a)稱取一定量的窖泥和糟醅或量取一定體積的黃水，進(jìn)行前處理；b)加入緩沖液和有機(jī)試劑，提取得到脂質(zhì)組分；c)經(jīng)硅膠小柱分離和溫和甲酯化后，通過有機(jī)試劑提取脂肪酸甲酯；d)使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行磷脂脂肪酸的定性與定量分析；e)分析樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)。本發(fā)明對白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究，特別是分析濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物群落隨不同生產(chǎn)階段的演替規(guī)律，提供了準(zhǔn)確、快速、全貌的分析手段，為微生物發(fā)酵過程的科學(xué)調(diào)控以及優(yōu)質(zhì)白酒的增產(chǎn)提供有利條件。
文檔編號G01N30/72GK102455331SQ20101050999
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月18日
發(fā)明者周榮清, 秦臻, 鄭佳, 黃鈞 申請人:四川大學(xué)