專利名稱：基于陣列的生物分子分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子樣品的分析，特別是蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
在最近的文獻中關(guān)于“蛋白質(zhì)芯片”的發(fā)展的討論已經(jīng)很多了。廣意上講，這些是蛋白質(zhì)陣列(一般稱作微陣列)。以目前的想象蛋白質(zhì)微陣列將能夠同時檢測幾千個蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用、小分子間相互作用和酶底物反應(yīng)。
目前多數(shù)研究是開發(fā)一種基于將蛋白質(zhì)固定在基板上的蛋白質(zhì)芯片，典型地是用表面化學(xué)來固定蛋白質(zhì)。芯片的基板可以是硅晶片，但是例如鋁晶片和玻璃等其它材料也已經(jīng)用作或提出用作該基板?；逯苽渲?，需要在芯片上附著蛋白質(zhì)捕獲劑，例如抗體。在由一個加利福尼亞的公司，ZyomyxInc.，提出的一項研究中，用薄的有機膜涂覆基板，將附著用的標記物加在有機層上面，例如抗體片段或多肽等，蛋白質(zhì)捕獲劑則鍵合在標記物的自由末端。
目前的策略是在芯片表面用什么來形成涂層，例如抗體，或者在某些情況下，用親和捕捉分別純化了的已知的表達蛋白，并隨后固定。
還提出了其它涂層抗體的方法。但是，涂層抗體或其它蛋白質(zhì)捕獲劑的任務(wù)還很復(fù)雜。進一步的問題在于蛋白質(zhì)不象DNA那樣牢固，并且易斷裂，如果不小心處理它們，則會變性。蛋白質(zhì)對于特定基板的物理和化學(xué)特性還極其敏感。
現(xiàn)有的“蛋白質(zhì)芯片”的主要缺點如下。首先，蛋白質(zhì)必須鍵合在芯片上陣列的位置中。如上所述，這通常使用排成陣列的抗體，例如，制造緩慢并昂貴的單克隆抗體或使用排成陣列的抗原來實現(xiàn)。但是，鍵合的抗原和鍵合的抗體的特異性不高。
第二個問題是單一抗體的使用不能顯現(xiàn)蛋白質(zhì)具有多種異構(gòu)體的問題?？赡懿皇撬械漠悩?gòu)體都具有生物活性。存在生物活性異構(gòu)體被非活性異構(gòu)體所掩蓋的可能性。
主要問題是在樣品中的大量蛋白質(zhì)由于與陣列的非特定鍵合而產(chǎn)生高背景“噪聲”。
一個解決方案，重組抗原的使用，并不產(chǎn)生可信的修飾，因為重組蛋白質(zhì)將幾乎肯定會對真正的蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同的翻譯后修飾。因此，不能確信在蛋白質(zhì)芯片上的相互作用就類似于在真正的蛋白質(zhì)和，例如，其它蛋白質(zhì)之間發(fā)生的“真正的”相互作用。
本發(fā)明試圖應(yīng)對并緩和上面討論的現(xiàn)有技術(shù)的問題。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一方面包括產(chǎn)生大分子的陣列并隨后將大分子陣列轉(zhuǎn)移到支撐物上的步驟。該步驟產(chǎn)生一個主陣列或宏陣列。該工藝的一個主要優(yōu)點是可以排列和固定真正的大分子，而沒有任何在現(xiàn)有技術(shù)的“蛋白質(zhì)芯片”中所需的固定過程的任何化學(xué)方法。
本發(fā)明工藝的下一個步驟是一般通過使用圖像捕獲來定義坐標，將試劑的第二(或微)陣列“打印”到捕獲的主陣列的每個坐標上。執(zhí)行該功能的設(shè)備在標題為“分子分析(Analysis of Molecules)”的澳大利亞專利No 722578中作了介紹。其中描述了一種設(shè)備用于捕捉在平面支撐物上的點的陣列的圖像，并用該圖像驅(qū)動打印頭到特定的點以便將試劑涂覆到該點。
大分子在此指包括了任何從由蛋白質(zhì)、多肽、糖類、脂類、核酸分子、包括糖蛋白的復(fù)雜生物分子及其混合物構(gòu)成的組中選擇的任何生物分子。
生物分子最好用色譜法分離，以形成樣品陣列。色譜法最好是電泳，更優(yōu)選在聚丙烯酸胺凝膠中進行的電泳。
電泳可以在一維中進行，包括采用等電聚焦電泳、自然聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳?；蛘?，聚丙烯酰胺凝膠電泳可在二維中進行，第一維為等電聚焦電泳，第二維為自然聚丙烯酰胺凝膠電泳或SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
只要可能，最好利用非變性電泳分離工藝，因為這將產(chǎn)生更為可靠的自然陣列，而不是變性的蛋白質(zhì)。
支撐物可以是由聚偏二氟代乙烯、硝化纖維素、尼龍、特氟隆、zitex、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)及其具有一個或多個功能基的衍生物制成。
圖像分析可以確定在微陣列中可以實際打印的點的最大數(shù)量，并且確定在宏陣列中每種分子的各自點-點的分辨率。
識別相互作用是特異的或非特異的工藝為采用公有領(lǐng)域的方法。
但是，可以應(yīng)用打印過程中一個獨特的性質(zhì)非特異性相互作用被沖洗而形成外部暈圈，而特異性相互作用仍集中在沉積的坐標上。因此，特異性相互作用的存在或其它情況可通過是否存在暈圈而揭示出來。
蛋白質(zhì)可以用標記物等直接標記，或用夾層技術(shù)，例如第二抗體熒光標記來檢測。
在該工藝中的下一個步驟，使用檢測裝置檢測是否在蛋白質(zhì)點和由化學(xué)打印機涂覆的一種或多種試劑之間發(fā)生了相互作用。檢測可以由任何合適的方法進行，例如球形捕捉透鏡如CCD、照相機、掃描或激光掃描、顯微鏡方法等。
在可選實施例中，可以直接驅(qū)動檢測裝置到微陣列的每一個坐標。
可以預(yù)見，本發(fā)明的工藝可用于批量方式純化含有親合標記的表達蛋白質(zhì)。例如，一批比如384克隆表達的特定但不同的His-標記可在IMAC(固定金屬親合色譜(immobilished metal affinity chromatography))柱上純化。然后，柱的洗出液(即，所有384克隆)可以用二維電泳排成陣列并轉(zhuǎn)移到基板，從而產(chǎn)生非預(yù)先確定陣列。這直接與現(xiàn)有技術(shù)的依賴于保持預(yù)先確定的陣列并保持位置信息的教義相矛盾。該例子的一個優(yōu)點是表達蛋白質(zhì)的陣列將通過與預(yù)知產(chǎn)品的比較來提供對表達產(chǎn)品的質(zhì)量控制(例如，預(yù)測的Mr和pI與觀察到的Mr和pI相比)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的主要優(yōu)點是產(chǎn)生真正的蛋白質(zhì)陣列而不需要已有的蛋白質(zhì)芯片所需的用于表面的化學(xué)固定。
在一個特征中，包含在主陣列的圖像中的信息可以用于限定打印在主陣列上的微陣列的類型。例如，分析的特定點的尺寸可以用來確定類型，以及分配到點上的試劑的間隔。例如，具有20微滴的試劑的8×8陣列可以打印到具有200微米直徑的點上，試劑點間隔25微米，或者打印道更大的400微米的點，上試劑點間隔50微米。
由于在沉積系統(tǒng)中具有足夠的精度，所以可以在主陣列的各個位置上打印非常高密度的陣列，并且精確的光學(xué)纖維應(yīng)當能夠識別微小相互作用。
在一個特殊的優(yōu)選特性中，將多個蛋白水解酶作為微陣列放在宏陣列的特定的蛋白質(zhì)點上將是有利的。例如，在500微米直徑的蛋白質(zhì)點上，多種蛋白內(nèi)切酶(胰蛋白酶、LysC內(nèi)切酶、GluC內(nèi)切酶和Asp-N內(nèi)切酶，優(yōu)選酶為胰蛋白酶和GluC)的微陣列打印為間隔200微米的200微米大小的點群(中心到中心)。點的尺寸和間隔足夠小，從而通常MALDI-TOF-MS氮激光束(100微米)可以定位，從而只釋放出在宏陣列的點中的一個特定酶反應(yīng)的分析物。該特征的優(yōu)點是在MALDI-TOF-MS對宏陣列蛋白質(zhì)的點進行分析的過程中，多種蛋白酶的微陣列將增加多肽覆蓋范圍。


下面將只通過例子的方式并結(jié)合附圖介紹本發(fā)明的特定實施例，其中圖1示出了已經(jīng)被二維電泳分離并轉(zhuǎn)移到支撐膜上的蛋白質(zhì)陣列；圖2示出了用于在圖1所示的陣列中已識別的蛋白質(zhì)點的上面沉積一系列微陣列小點的化學(xué)打印機；圖3示出了圖1中所示的一個點的放大，在該點上沉積了一個微陣列；
圖4是一個概要的示意圖，示出了通過得到或記錄在陣列中的至少一個組分或樣品位置的圖像以從復(fù)合物或樣品的點陣獲得信息的過程，并利用記錄的圖像以便允許至少一個組分或樣品的原位操作。
圖5是用于成像、操作和分析復(fù)合物或樣品陣列中的至少一個組分或樣品的設(shè)備的概要的圖示。
圖6A到6C示出了用來夾緊硝化纖維膜的設(shè)備；圖7A和7B示出了在38kDa TB抗原上的微噴射(micro-jetting)抗TB陰性或陽性的人血清的結(jié)果；圖8示出了在有或沒有直接藍著色(Direct Blue Staining)的變性的38kDa TB抗原上微噴射抗TB陰性或陽性的人血清的結(jié)果；圖9示出了用雙面膠帶粘附到Axima MALDI目標片上的膜印跡B745；以及圖10是由沉積在其上的矩陣中的胰蛋白酶和GluC內(nèi)切酶消化的蛋白質(zhì)的放大圖。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，分餾蛋白質(zhì)的混合物以去掉大量多余的蛋白質(zhì)并在窄范圍的pH梯度下，以溶解異構(gòu)體(一維電泳)?？梢允褂枚嗍译娊獠?multicompartment electrolyser)進行分餾工藝，正如在國際專利申請NoPCT/AU00/01391中所介紹的，引入其整個內(nèi)容作為參考。代替一維電泳，將去掉多余蛋白質(zhì)的樣品用二維電泳分離，形成如圖1所示的陣列(10)，然后用印跡電泳將陣列轉(zhuǎn)移到例如硝化纖維的膜上?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)陣列被固定并且準備作為“芯片”處理。應(yīng)當注意，陣列不是預(yù)先確定的，并且不需要在當時就確定所產(chǎn)生的陣列中哪種蛋白質(zhì)位于陣列上的哪個位置。
圖1示出了圈出的蛋白質(zhì)點12。該工藝的下一個步驟是在蛋白質(zhì)點上印上試劑陣列。這通過使用在AU 722578中介紹的化學(xué)打印機來實現(xiàn)，下面參考圖4和5來介紹。
圖4示出了打印機系統(tǒng)功能的概要圖示。系統(tǒng)包括陣列100、圖像采集系統(tǒng)200、圖像分析系統(tǒng)300、計算機400、x、y、z可調(diào)平臺500、多化學(xué)藥劑分配控制單元600、多頭分配和貯存器700、分析儀控制單元800、分析儀900和數(shù)據(jù)分析站910。
陣列100定位在x、y、z可調(diào)平臺上面或臂500的下面，得到圖像200并作為數(shù)字圖像傳送到計算機400。該圖像或者由圖像分析系統(tǒng)300將陣列的每個組分的坐標轉(zhuǎn)換為反映真正的x、y、z的值；或者，不進行轉(zhuǎn)換，用存儲在計算機400中的圖像，使在陣列100中的一個特定組分的坐標驅(qū)動裝載有分配頭(噴射裝置)700的x、y、z可調(diào)平臺或臂500。由計算機控制的化學(xué)分配控制單元600控制分配頭700，在陣列100中選定的樣品上分配試劑。當完成處理時，使用在陣列100中的被處理組分的坐標移動裝載有分析儀900的x、y、z可調(diào)平臺或臂500。分析儀900在分析控制單元800的控制之下，當操作人員通過計算機400選定它時，分析儀900對處理過的選定的樣品100進行分析。數(shù)據(jù)分析和管理系統(tǒng)910校對分析得到的數(shù)據(jù)，該系統(tǒng)與來自圖像分析系統(tǒng)300在陣列中的每個樣品的等同轉(zhuǎn)換坐標相關(guān)聯(lián)。
如圖5所示，x、y、z可調(diào)平臺、化學(xué)藥劑分配控制單元、分配頭和貯存器以及分析儀，都在計算機的控制之下。陣列102固定到平臺502上。通過數(shù)碼相機202得到陣列102的圖像。陣列102由照相機的閃光燈或外部的鎢燈206照明。圖像從照相機202傳送到計算機402。圖像處理并輸入到“click-on-a-spot”軟件。該處理將圖像像素坐標翻譯成自控裝置坐標。然后用“click-on-a-spot”軟件通過x、y移動桿504驅(qū)動分配裝置702移動到陣列中被選定的樣品。通過分配裝置支撐單元506在z軸方向移動分配裝置702。直接與分配裝置702連接604的化學(xué)分配控制單元602通過計算機402的控制從試劑貯存器508分配試劑。
圖2示出了分配裝置702以打印機頭14的形式移動到蛋白質(zhì)點12上方，在點12上沉積試劑點。打印機利用壓電打印，在不接觸點的情況下，在點上面留下非常少量的液體(p1數(shù)量級)。
使用在AU 722578中介紹的并在上面重復(fù)的技術(shù)，打印頭14利用之前產(chǎn)生的陣列圖象所提供的陣列中特定點的x、y坐標而直接移動到這些點上。
圖3示出了沉積在蛋白質(zhì)點12上的4×4的試劑陣列的圖像。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片提供真正的蛋白質(zhì)陣列、具有解析異構(gòu)體問題的能力和去除多余蛋白質(zhì)的技術(shù)。一個特定的被正視(envisage)的技術(shù)是使患者產(chǎn)生抗體并將患者的血清打印到蛋白質(zhì)陣列上。
使用本發(fā)明的用途還包括用抗體來篩選新抗原、測定多肽/蛋白質(zhì)的相互作用和蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)的相互作用。
實施例1本實施例的目的是在硝化纖維的基板上用純化的結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))抗原來確定患者對TB的免疫反應(yīng)的研究中開發(fā)一種用來微分配人血清的化學(xué)打印(chemical printing)技術(shù)，該血清對于TB即可能呈血清反應(yīng)陰性也可能為陽性。應(yīng)當理解，該方法可以通過使用適當?shù)目乖瓕⒒颊叩拿庖叻磻?yīng)明確為多種條件和疾病。
材料和方法1.1由兩個患者分離的人類血清，其中一個對TB的血清反應(yīng)陰性，另一個為陽性，分別用pH 7.4，加入0.05％(w/v)疊氮化鈉、0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS緩沖洗液(PBS-WB))稀釋10倍，然后通過0.22μm注射過濾器(Millipore，North Ryde，Australia)過濾。將4μl的370μg/ml的純化的38kDa TB抗原的PBS溶液，pH7.4，涂覆到硝化纖維膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上，然后使其干燥。然后，在硝化纖維上的非特定結(jié)合點用0.5％(w/v)的酪蛋白(Sigma，Castle Hill，Australia)PBS-WB溶液封閉。隨后用AB-55微噴射裝置(MicroFab Technologies，Piano，Texas)在240Hz的頻率下用具有55μm孔的#B0-13-12將每個血清樣品以每點100滴的4×4陣列噴射到分離的TB抗原點上。在分配血清時用浸有PBS-WB的濾紙墊在下面使硝化纖維膜保持濕潤。血清噴射十秒后，用移液管滴幾滴PBS-WB輕輕沖洗硝化纖維膜。隨后在稀釋100倍的0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB中孵育硝化纖維膜1小時，使抗人IgG與FITC(Zymed，San Francisco，CA)結(jié)合，再用PBS-WB沖洗。用Bio-Rad FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)檢測被標記的抗原。
材料和方法1.2重復(fù)上述方法，除了使用圖6A到6D中所示的設(shè)備在硝化纖維下面墊吸收棉紙。將吸收棉紙?zhí)顫M在含有TB抗原的硝化纖維下面。該材料隨后全部夾在圖6A到6C所示的設(shè)備內(nèi)部，將要噴射的區(qū)域暴露在圓孔18上。慮及瞬間或特定反應(yīng)，棉紙襯墊物保證噴射的溶液或者任何涂覆的小體積緩沖液或試劑能馬上透過硝化纖維進入棉紙。該方法既防止免疫球蛋白的非特定干燥和由此發(fā)生的非特定反應(yīng)，還防止分配的特定抗體穿過硝化纖維的表面(參看下面)。與方法1相比，在噴射期間該裝置保持硝化纖維膜干燥。然后用移液管滴一滴PBS-WB處理膜，隨后如上所述將血清噴射到抗原上。
圖7A和7B示出了微噴射抗TB陰性或陽性人類血清到38kDa TB抗原上的效果。TB血清反應(yīng)陰性(-)或血清反應(yīng)陽性(+)的人類血清的4×4陣列20噴射到含有1.48μg的38 kDa TB抗原的4μl點的硝化纖維上。用被PBS-WB浸濕的濾紙(A)或緊緊塞滿的干燥的吸收棉紙(B)墊在硝化纖維膜下面。用標記為FITC的第二抗體檢測標記的抗原，隨后用BIO-RADFLUOR-STM Multi-Imager分析。這清楚的表明填塞棉紙和如圖7B的20所示的干燥的膜導(dǎo)致抗原檢測敏感性和分辨率的提高。
實施例2用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)純化的TB抗原并電轉(zhuǎn)移到硝化纖維上用或不用隨后的直接藍著色(Direct Blue staining)來定義患者對TB的免疫反應(yīng)性的研究中，開發(fā)一種用來微分配人血清的化學(xué)打印技術(shù)，該血清對于結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))即可能呈血清反應(yīng)陰性也可能為陽性。
材料和方法21.48μg的38 kDa TB抗原用x1 SDS-PAGE非減少樣品緩沖液稀釋到200μl。隨后使用4-12％(w/v)Tris-Bis聚丙烯酰胺梯度凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)通過SDS-PAGE分析樣品(每行1.48μg抗原)，隨后電轉(zhuǎn)移到硝化纖維上。使用直接藍著色可以看到兩行印跡(圖3)，同時另外兩行沒有著色。兩種印跡在室溫下干燥，并隨后用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封閉15分鐘。然后用PBS-WB沖洗兩種印跡，并干燥。隨后印跡安放到圖1所示的吸入裝置中，然后TB血清反應(yīng)陰性或血清反應(yīng)陽性的血清以如上所述的1×5陣列噴射到交替的直接藍著色和沒有著色的印跡的38kDa帶上。大約10秒后，用移液管滴兩滴PBS-WB清洗印跡。用移液管滴兩滴PBS-WB之后10秒，5μlFITC標記的第二抗體用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB稀釋10倍，涂覆到印跡上。用BIORAD FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)檢測標記的抗原。
圖8所示為噴射TB陰性或陽性人類血清到用或不用直接藍著色的38kDa TB抗原+/-上的效果。(A)38 kDa TB抗原，每行1.48μg，用4-12％的聚丙烯酰胺梯度凝膠通過SDS-PAGE分離。然后蛋白質(zhì)電傳送到硝化纖維上。隨后其中的兩行被直接藍著色。(B)用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封閉之后，TB血清反應(yīng)陰性(1和3行)或血清反應(yīng)陽性(2和4行)的人類血清的1×5陣列噴射(如上所述)到38 kDa TB抗原帶上。使用如圖6A到6C中所示的設(shè)備進行噴射期間，用緊緊塞滿的干燥的吸收棉紙墊在硝化纖維膜下面。在噴射血清(A)之前只有第3和第4行被直接藍著色。用FITC標記的第二抗體檢測標記的抗原，隨后用BIO-RAD FLUOR-STMMulti-Imager分析。
目前，使用化學(xué)打印機分配納升(nanolitre)體積的人類血清以限定固定在硝化纖維膜上的抗原的方案已經(jīng)證明非常成功，并提供檢測TB-免疫反應(yīng)性IgG極其迅速的方法(少于1分鐘)。沒有觀察到背景或非特定結(jié)合。最初的研究證明在噴射后血清抗體散布到潮濕的硝化纖維膜的表面，而產(chǎn)生低分辨率抗體陣列。在干燥的硝化纖維膜下面的鋪襯吸收棉紙有效的克服了這個問題，并且現(xiàn)在允許高特異的和解析良好的抗體陣列。
實施例3本實施例涉及用矩陣輔助的激光解吸附離子化(MALDI)分析在質(zhì)譜儀中的蛋白質(zhì)片段之前對陣列上應(yīng)用蛋白質(zhì)-酶反應(yīng)。眾所周知，不同的酶在不同的氨基酸位點切開蛋白質(zhì)。一些酶，例如lysC、AspN、ArgC只在一個特定的氨基酸位點切開蛋白質(zhì)。這在MALDI分析中是一個問題，因為它只能產(chǎn)生幾個大的片段，不能產(chǎn)生非常有用的信息光譜。其它酶，例如，胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在許多氨基酸位點切開蛋白質(zhì)。在MALDI分析之前使用這些酶也有問題，因為產(chǎn)生了太多的小片段，他們將在光譜中產(chǎn)生大量非常小的峰，這也非常難以分析。胰蛋白酶和GluC在兩個氨基酸位點切開蛋白質(zhì)，這將產(chǎn)生較好的可用于分析光譜，因此選擇用為在MALDI分析中的酶。
雖然如此，因為這些酶只在特定的氨基酸位點分開蛋白質(zhì)，所以使用單個酶只能產(chǎn)生蛋白質(zhì)的有限數(shù)量的信息和覆蓋的范圍。但是，使用本發(fā)明的方法將兩種不同的酶噴射到陣列中的蛋白質(zhì)點上將增加對蛋白質(zhì)的覆蓋范圍，并且下面的實驗介紹了本發(fā)明的方法的使用，噴射胰蛋白酶和GluC到兩個人前載脂蛋白上以得到改善的覆蓋范圍(匹配的多肽)，并將使用GluC和胰蛋白酶與單獨使用胰蛋白酶或單獨使用GluC相比較。
本實施例的目的是開發(fā)用于微分配多個蛋白內(nèi)切酶到經(jīng)過SDS-PAGE的純化的蛋白質(zhì)上并電印跡到具有直接藍著色的聚二氟代乙烯的膜上以改善蛋白質(zhì)識別的化學(xué)打印技術(shù)。
材料和方法樣品為36μl在7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)Chaps和5mM Tris的全血漿。樣品用X三丁基膦還原，用z碘乙酰胺烷基化。將樣品超聲，然后離心分離，收集上清液。在多室電解槽中進行預(yù)分餾，采用Herbert，B.和Righetti，P.G.所描述的方法一個蛋白質(zhì)代謝分析中的轉(zhuǎn)變點等電位膜通過多室電解槽進行樣品的預(yù)分餾(A turning point in proteome analysissampleprefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectricmembranes)電泳(Electrophoresis)21，3639-3648(2000)。其整個內(nèi)容在此引入作為參考。
干燥的11cm長5-6IPG帶在200μl蛋白質(zhì)樣品中再水化的6小時。再水化的帶在最大為10000V的條件下聚焦120kVhr。聚焦的IPG帶在含有6M尿素、2％(w/v)SDS的平衡緩沖液中平衡20分鐘。
平衡的IPG帶插入到6-15％凝膠粉的裝料管(loading well)中。在每個凝膠50mA的條件下進行電泳1.5小時。蛋白質(zhì)在400mA下經(jīng)過1小時20分鐘電印跡到Immobilon PSQPVDF(聚偏二氟代乙烯)膜上。用直接藍71著色蛋白質(zhì)。
然后膜印跡用3M雙面導(dǎo)電膠帶粘附到Axima-CRF MALDI-TOF MS目標盤上(參考圖9)。特定的蛋白質(zhì)點用5ηl含有1％的聚乙烯吡咯烷酮的50％甲醇封閉，在一個蛋白質(zhì)點上在以間隔1mm的兩個位置上分配直徑300μm的50個的液滴。過多的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)用MilliQ輕輕沖洗。50ηl 200μg/ml的GluC蛋白內(nèi)切酶噴射到在蛋白質(zhì)上的一個PVP點上，一定量的200μg/ml的胰蛋白酶噴射到同一個蛋白質(zhì)上的剩余的PVP點上。然后膜片放入密封的午餐盒中，加入極少量水，以創(chuàng)造一個濕潤的環(huán)境，并在37℃下孵育3小時。消化之后，將100ηl溶于20％異丙醇、20％2-丁醇、30％甲醇以及0.5％甲酸中的10mg/ml的α-氰基-羥基肉桂酸(α-cyano-hydroxycinnamic)噴射到消化的蛋白質(zhì)點上(圖10)。用Axima CRF MALDI-TOF的質(zhì)譜儀分析分解的片段。
目前用微分配多種蛋白內(nèi)切酶來增加氨基酸的覆蓋范圍以識別蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)證明是成功的，其匹配的多肽的聯(lián)合覆蓋范圍達到66.6％，而單獨用gluC和單獨用胰蛋白酶則分別達到的40％和46.09％相。
所用的基體溶液包括20％的2-丁醇、20％的異丙醇、30％的甲醇、30％的水以及0.1％的Tfa(三氟醋酸)。該基體溶液具有適當?shù)恼扯纫员阍谘娱L的時間段內(nèi)分配穩(wěn)定的液滴的優(yōu)點。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當明鑒，對于本發(fā)明可以進行大量的變化和/或改進，如特定實施例中所示，而不脫離如明白介紹的本發(fā)明的精神和范圍。因此，本實施例在所有的方面只作為說明而不是限定。
權(quán)利要求
1.一種大分子混合物的分析方法，包括以下步驟在具有分隔為多個點的大分子的支撐物上產(chǎn)生大分子的陣列；以及將一個或多個試劑的第二陣列打印到在陣列中的一個或多個大分子點上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中至少兩種不同的試劑被打印到該點上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中樣品為從由蛋白質(zhì)、多肽、糖類、脂類、核酸分子、包括糖蛋白的復(fù)雜生物分子和其混合物構(gòu)成的組中選擇的生物分子。
4.根據(jù)上述任何一個權(quán)利要求的方法，其中陣列由色譜法產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中色譜法為電泳。
6.根據(jù)上述任何一個權(quán)利要求的方法，其中電泳是在聚丙烯酰胺凝膠中進行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳在兩維中進行，第一維為等電聚焦電泳，第二維為自然聚丙烯酰胺凝膠電泳或SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在打印第二陣列之前將在凝膠體中產(chǎn)生的陣列轉(zhuǎn)移到支撐膜上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中支撐膜是由聚偏二氟代烯、硝化纖維、尼龍、特氟隆、zitex、聚丙烯、PTFE及其具有一個或多個功能基的衍生物制成。
10.根據(jù)上述任何一個權(quán)利要求的方法，其中進一步包括使用檢測方法，以檢測是否在大分子點和試劑間或涂覆到點的試劑間發(fā)生了相互作用。
11.根據(jù)上述任何一個權(quán)利要求的方法，其中大分子為蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中的方法，其中試劑是從由lysC、GluC、胰蛋白酶、AspN、ArgC、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶構(gòu)成的組中選擇的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中的方法，其中試劑包括胰蛋白酶和GluC。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13中的方法，進一步包括步驟在膜上的宏陣列的一個點中用MALDI-TOF-MS氮激光束原位釋放一個特定酶反應(yīng)的被分析物，以用于在MALDI-TOF質(zhì)譜儀中分析。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任何一個權(quán)利要求的方法，其中大分子陣列包括抗原或抗體，試劑包括來自人類或動物的樣品。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中所要求的方法，其中樣品為來自人類的樣品，并包括血漿、血清或組織樣品。
全文摘要
一個大分子陣列(100)(主陣列)，例如通過二維電泳得到的蛋白質(zhì)，隨后通過電印跡或類似方法轉(zhuǎn)移到支撐膜(102)。捕捉主陣列的圖像(202)，確定在主陣列中的各種大分子點的坐標(402)。該過程的下一個步驟是用皮升(p1)分配器(702)將一種或多種試劑或化學(xué)物質(zhì)的第二(或微)陣列印到主陣列的一個或多個點/坐標上。如果大分子為蛋白質(zhì)，則試劑可以是酶，例如胰蛋白酶或GluC等。使用兩種不同的酶，將它們沉積到同一個點的不同坐標上，這將在不同的氨基酸位點分開蛋白質(zhì)，并且當該點在MALDI－TOF質(zhì)譜儀中分析時，將提供蛋白質(zhì)中多肽的增加的分布或匹配。
文檔編號B01L3/00GK1493001SQ01823049
公開日2004年4月28日 申請日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月16日
發(fā)明者安德魯, 斯隆, 賈尼斯, 達夫, 馬爾科姆, 波拉斯卡, 古利, 古利 , 達夫 , 波拉斯卡 姆, 斯隆 安德魯 申請人:普羅托姆系統(tǒng)有限公司