一種tat-pap融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種TAT-PAP融合蛋白，由人類I型免疫缺陷病毒HIV-I的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成。其制備方法為：選取兩端分別含有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)序列的pTAT-HA表達(dá)載體；合成PUC57-PAP載體；將pTAT-HA表達(dá)載體和pUC57-PAP載體進(jìn)行雙酶切，分別回收■’獲得pTAT-PAP重組表達(dá)質(zhì)粒載體；將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞；誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)即得。本發(fā)明不僅保留了TAT原有的穿透力，且對(duì)外源蛋白PAP的活性幾乎沒(méi)有影響，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白質(zhì)藥物對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性痛的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。
【專利說(shuō)明】-種TAT-PAP融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種TAT-PAP融合蛋白，本發(fā)明還涉及 該TAT-PAP融合蛋白的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病神經(jīng)病理性痛是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是由慢性糖尿病狀態(tài)下 外周感覺(jué)神經(jīng)廣泛變性和炎性脫髓鞘所引起，主要表現(xiàn)為雙側(cè)下肢遠(yuǎn)側(cè)端產(chǎn)生自發(fā)痛 (spontaneous pain),異常疼痛（allodynia)和痛覺(jué)過(guò)敏（hyperalgesia),使肢體功能異 常，因而對(duì)患者身心造成嚴(yán)重危害。目前臨床上對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性痛的治療，除了針 對(duì)病因嚴(yán)格控制血糖，改善微循環(huán)外，一些經(jīng)典的鎮(zhèn)痛藥物，如嗎啡、非留體類抗炎藥等，對(duì) 糖尿病性痛的緩解療效甚微；有證據(jù)顯示三環(huán)類抗抑郁藥和抗驚厥藥，如阿米替林、加巴噴 丁等，對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性痛有一定的鎮(zhèn)痛作用，但其副作用如嗜睡、眩暈、低血壓、心律失 常，幻覺(jué)等，嚴(yán)重制約了藥物的臨床應(yīng)用。因此如何更有效的治療糖尿病神經(jīng)病理性痛成為 目前臨床亟待解決的問(wèn)題，而闡明糖尿病性痛的機(jī)制和研發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物則意義重大。
[0003] 前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP)是一種非特異性外核苷 酸酶，早期曾被稱為氟化物耐受的酸性磷酸酶（fluoride-resistant acid phosphatase, FRAP)或硫胺素單憐酸酶（thiamine monophosphatase，TMPase)。PAP在體內(nèi)有兩種存在 形式，分泌型PAP (S-PAP)和跨膜型PAP (TM-PAP)。S-PAP由前列腺上皮細(xì)胞合成并分泌，正 常狀態(tài)下，在血中含量極低，只有疾病狀態(tài)（如前列腺癌）時(shí)，才大量進(jìn)入血液。長(zhǎng)期以來(lái)， S-PAP -直被當(dāng)作前列腺癌的腫瘤標(biāo)記物用于臨床診斷。而TM-PAP則主要表達(dá)于非前列腺 組織，如神經(jīng)組織、肝臟等的細(xì)胞膜上。在神經(jīng)系統(tǒng)中，TM-PAP主要表達(dá)于脊髓背角（spinal dorsal horn, SDH) II層內(nèi)的初級(jí)傳入終末和背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG)的 小型神經(jīng)元。無(wú)論哪種PAP，在結(jié)構(gòu)上都包含一個(gè)信號(hào)肽和酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)域，只是TM-PAP 在C端多了一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。PAP是通過(guò)產(chǎn)生腺苷而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。Zylka小組的研究 發(fā)現(xiàn)，敲除PAP基因的小鼠，由慢性炎性痛和神經(jīng)病理性痛所誘導(dǎo)的熱痛敏和機(jī)械痛敏都 明顯增強(qiáng)，提示PAP可能在疼痛過(guò)程中起到了一定的作用。疼痛-功能學(xué)相互關(guān)聯(lián)的研究 中發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射PAP蛋白可使野生型和神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)病理性痛模型小鼠出現(xiàn)較強(qiáng) 的鎮(zhèn)痛和抗痛覺(jué)過(guò)敏作用；重要的是PAP的鎮(zhèn)痛效果與嗎啡相比，作用時(shí)間更持久，作用效 果更明顯，可達(dá)嗎啡的8倍，且未觀察到成癮及耐受等不良反應(yīng)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PAP 是通過(guò)將胞外的單磷酸腺苷（AMP)去磷酸化生成腺苷，后者活化脊髓背角的腺苷受體而發(fā) 揮鎮(zhèn)痛作用的。Sowa等研究表明PAP的鎮(zhèn)痛效果具有pH依賴性，在pH為5. 6時(shí)，PAP的酶 活性最高，其鎮(zhèn)痛效果最佳。綜上所述，PAP是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的鎮(zhèn)痛藥物。然而，外源 性的PAP蛋白難以穿過(guò)血脊屏障，使其進(jìn)一步的研究和臨床應(yīng)用受到了極大的限制。
[0004] 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)是近些年來(lái)運(yùn)用比較廣泛的一項(xiàng)技術(shù)，可以使分子量超過(guò)IOOkD的 蛋白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜，甚至穿過(guò)血腦屏障和血脊屏障。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在神 經(jīng)科學(xué)的研究中十分重要，因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞及細(xì)胞間生理反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì) 為多肽及蛋白質(zhì)，但由于肽類或蛋白類大分子藥物難以通過(guò)血腦屏障和血脊屏障，從而影 響了此類藥物的研究與發(fā)展。研究已經(jīng)證實(shí)一種來(lái)源于人類I型免疫缺陷病毒（HIV-I) 的轉(zhuǎn)錄反式激活因子（trans-activator of transcription, TAT)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain, PTD)，能夠?qū)⒎肿恿吭?5?120kD的不同生物大分子（如核酸、多 肽、蛋白質(zhì)等）高效、快速、安全地導(dǎo)入細(xì)胞，且導(dǎo)入后仍具有生物活性，并對(duì)宿主細(xì)胞幾乎 沒(méi)有毒性。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的發(fā)現(xiàn)為蛋白質(zhì)治療帶來(lái)了新的曙光，顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。 目前，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)成功將BDNF、NEP1-40、⑶NF、Bcl-2、JIP等功能蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn) 入腦組織和神經(jīng)元。TAT蛋白結(jié)構(gòu)域修飾的蛋白質(zhì)藥物目前已經(jīng)用于二期臨床的試驗(yàn)。克 里姆比爾神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心的 M. Tymianski 博士將 TAT-NR2B9C(C_terminal 9amino acids of N-methyl-d-aspartate receptors_2B)用于因腦動(dòng)脈瘤而引發(fā)輕微中風(fēng)的患者，結(jié)果顯示 90%以上的患者不會(huì)引起明顯的神經(jīng)性傷殘。92位患者接受TAT-NR2B9C治療，93位接受 安慰劑治療，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TAT-NR2B9C引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)事件，表明TAT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)藥物 是安全的。這是人類首次將TAT修飾的蛋白藥物用于臨床研究，表明TAT作為介導(dǎo)蛋白質(zhì) 藥物在臨床的應(yīng)用成為可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種TAT-PAP融合蛋白，能穿透血脊屏障，并用于治療糖尿 病神經(jīng)病理性痛。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種TAT-PAP融合蛋白的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述TAT-PAP融合蛋白的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種TAT-PAP融合蛋白，該融合蛋白是由人類I型 免疫缺陷病毒HIV- I的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP 形成的融合蛋白TAT-PAP。
[0009] 本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0010] 該融合蛋白具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明所采用的第二個(gè)技術(shù)方案是，TAT-PAP融合蛋白的制備方法，具體步驟如 下：
[0012] 步驟1，選取包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT，且其兩端分別含有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)序列的pTAT-HA表達(dá)載體；pTAT-HA表達(dá)載體中PTD的cDNA序列為SEQ ID NO:2所示的序列；
[0013] 步驟2,從Genebank中獲取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化 PAP基因序列，PAP基因序列為SEQ ID NO: 3所示的序列；
[0014] 步驟3,將步驟2經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化后的PAP基因序列合成為PAP基因片段，序列兩 端分別含有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的序列，并裝載到pUC57載體中，即為pUC57-PAP載 體；
[0015] 步驟4,將pTAT-HA表達(dá)載體和pUC57-PAP載體均用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I 進(jìn)行雙酶切，酶切條件為：37°C反應(yīng)1?16h，65°C滅活20min，分別回收載體pTAT和目的基 因片段PAP ;
[0016] 步驟5,用T4連接酶連接酶切后的載體pTAT和目的基因片段PAP，反應(yīng)條件為：室 溫，lOmin，篩選陽(yáng)性單克隆獲得pTAT-PAP重組質(zhì)粒；
[0017] 步驟6,將pTAT-PAP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞；
[0018] 步驟7,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，即得到TAT-PAP融合蛋白。
[0019] 本發(fā)明所采用的第三個(gè)技術(shù)方案是，上述TAT-PAP融合蛋白在制備治療糖尿病神 經(jīng)病理性痛藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是，
[0021] 1.本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白，將來(lái)源于人類I型免疫缺陷病毒HIV-I的TAT的 PTD與PAP融合，構(gòu)建pTAT-PAP重組表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)表達(dá)、純化獲得具有生物學(xué)活性的 TAT-PAP融合蛋白，且具有低成本，高活性的優(yōu)點(diǎn)。
[0022] 2.本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白具有TAT可進(jìn)行蛋白傳送的特點(diǎn)，突破了蛋白質(zhì)所攜 帶的生物信息通常只能經(jīng)由細(xì)胞膜受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的局限，有效解決了 大分子蛋白質(zhì)不能主動(dòng)穿透血脊屏障的問(wèn)題。本發(fā)明將TAT-PTD基因與外源蛋白PAP基因 連接，表達(dá)融合蛋白TAT-PAP，不僅保留了 TAT原有的穿透力，且對(duì)外源蛋白PAP的活性幾乎 沒(méi)有影響，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白質(zhì)藥物對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性痛的臨床應(yīng) 用中具有廣闊的前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是SDS-PAGE分析的TAT-PAP融合蛋白表達(dá)和純化圖；
[0024] 圖2是TAT-PAP融合蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品的pH值與酶活性的關(guān)系曲線；
[0025] 圖3是TAT-PAP融合蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與酶活性的關(guān)系曲線；
[0026] 圖4是TAT-PAP融合蛋白在脊髓組織表達(dá)的圖；
[0027] 圖5是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠機(jī)械痛行為的 變化；
[0028] 圖6是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠熱痛行為的變 化。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0030] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白，該融合蛋白是由人類I型免疫缺陷病毒HIV- I的轉(zhuǎn)錄 反式激活因子TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成的融合蛋白TAT-PAP。
[0031] 該融合蛋白具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0032] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白，將來(lái)源于人類I型免疫缺陷病毒HIV-I的TAT的PTD與 PAP融合，構(gòu)建pTAT-PAP重組表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)表達(dá)、純化獲得具有生物學(xué)活性的TAT-PAP 融合蛋白，且具有低成本，高活性的優(yōu)點(diǎn)。
[0033] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白具有TAT可進(jìn)行蛋白傳送的特點(diǎn)，突破了蛋白質(zhì)所攜帶 的生物信息通常只能經(jīng)由細(xì)胞膜受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的局限，有效解決了大 分子蛋白質(zhì)不能主動(dòng)穿透血脊屏障的問(wèn)題。本發(fā)明將TAT-PTD基因與外源蛋白PAP基因連 接，表達(dá)融合蛋白TAT-PAP，不僅保留了 TAT原有的穿透力，且對(duì)外源蛋白PAP的活性幾乎沒(méi) 有影響，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白質(zhì)藥物對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性痛的臨床應(yīng)用 中具有廣闊的前景。
[0034] 上述TAT-PAP融合蛋白的制備方法，具體步驟如下：
[0035] 步驟1，選取包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT，且其兩端分別含有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)序列的pTAT-HA表達(dá)載體；pTAT-HA表達(dá)載體中PTD的cDNA序列為SEQ ID NO:2所示的序列；
[0036] 步驟2,從Genebank中獲取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化 PAP基因序列，PAP基因序列為SEQ ID NO: 3所示的序列；
[0037] 步驟3,將步驟2經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化后的PAP基因序列合成為PAP基因片段，序列兩 端分別含有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的序列，并裝載到pUC57載體中，即為pUC57-PAP載 體；
[0038] 步驟4,將pTAT-HA表達(dá)載體和pUC57-PAP載體均用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I 進(jìn)行雙酶切，酶切條件為：37°C反應(yīng)1?16h，65°C滅活20min，分別回收載體pTAT和目的基 因片段PAP ;
[0039] 步驟5,用T4連接酶連接酶切后的載體pTAT和目的基因片段PAP，反應(yīng)條件為：室 溫，lOmin，篩選陽(yáng)性單克隆獲得pTAT-PAP重組質(zhì)粒；
[0040] 步驟6,將pTAT-PAP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞；
[0041] 將20 μ 1的pTAT-PAP重組質(zhì)粒加入到100 μ 1的大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞中，冰 浴5min后均勻涂于預(yù)熱后的氨芐抗性LB平板上，37°C孵育過(guò)夜至有單克隆DE3菌落；
[0042] 其中大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞用CaCl2法制備：
[0043] (1)挑取大腸桿菌DE3單個(gè)菌落涂于無(wú)氨芐抗性的LB平板上，37°C過(guò)夜；
[0044] (2)按照2 %體積比擴(kuò)大培養(yǎng)2. 5h，到細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D值約0. 4);
[0045] (3) 4°C，3000rpm離心IOmin后，倒掉培養(yǎng)液，加入TSS溶液重懸；
[0046] (4)超凈工作臺(tái)內(nèi)，冰上分裝，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0047] 步驟7,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，即得到TAT-PAP融合蛋白；
[0048] (1)挑取單克隆DE3菌株放入5ml含100mg/L氨芐的LB平板中，37°C振蕩過(guò)夜，次 日取出Iml菌液，余下4ml菌液加入IPTG (1 :1000)反應(yīng)4h后再取出其中的Iml菌液；
[0049] (2)煮沸法裂解DE3細(xì)菌，釋放出蛋白；
[0050] (3) SDS-PAGE凝膠電泳鑒定目的蛋白TAT-PAP有無(wú)表達(dá)，以及在IPTG誘導(dǎo)前后表 達(dá)的差異；
[0051] (4)用考馬斯亮蘭R250將表達(dá)后的全菌蛋白染色，確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)的條件和陽(yáng)性克 隆菌落，然后在16?22°C，0. 2mM的IPTG條件下大量表達(dá)蛋白。
[0052] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白的親和純化和鑒定：
[0053] (1)用IOOml洗滌液平衡Ni-NTA柱子后，將用直徑為0. 22 μ m濾膜過(guò)濾后的大腸 桿菌裂解液上清上樣，流速保持在20?30ml/h ;
[0054] (2)用IOOml洗滌緩沖液洗滌TAT-PAP融合蛋白，去除非特異性結(jié)合的蛋白；
[0055] (3)適量的洗脫緩沖液洗脫融合蛋白TAT-PAP ;
[0056] (4)超聲破碎誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的細(xì)菌，釋放出的目的蛋白通過(guò)Ni離子整合的親和層 析柱，純化后超濾濃縮為2mg/ml，置于-80°C冰箱備用，經(jīng)蛋白印跡和蛋白質(zhì)N端測(cè)序驗(yàn)證， 其氨基酸序列同SEQ ID NO: 1。
[0057] 圖1是SDS-PAGE分析的TAT-PAP融合蛋白表達(dá)和純化圖。由圖1可知，純化后的 融合蛋白TAT-PAP蛋白大小約為48kD，條帶單一，表達(dá)量大。
[0058] 本發(fā)明融合蛋白TAT-PAP的活性測(cè)定：
[0059] (1)根據(jù)PAP ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行融合蛋白TAT-PAP活性檢測(cè)，先設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品 濃度梯度4000pg/ml，用稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，最高濃度為4000pg/ml，最低為直接加入 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的〇pg/ml ;同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品pH值梯度，最高pH值為10,最低pH值為2 ;
[0060] (2)將TAT-PAP融合蛋白上清液分3孔加入96孔板內(nèi)（100 μ 1/孔），室溫靜置孵 育2h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔（只加 TMB顯色液和終止液）；
[0061] (3)依次加入PAP抗體工作液、HRP酶結(jié)合物工作液和TMB顯色液各100 μ 1/孔， 室溫避光孵育20min?lh，每步之間均用洗滌液洗板；
[0062] (4)加入終止液（50 μ 1/孔），輕輕混勻后移至酶標(biāo)儀，測(cè)量OD 450值，以O(shè)D值為 縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度或pH值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)品線上查 出其濃度或pH值。
[0063] 圖2是TAT-PAP融合蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品的pH值與酶活性的關(guān)系曲線，可見(jiàn)pH5?6時(shí) 融合蛋白相對(duì)活性最大，但仍低于標(biāo)準(zhǔn)品；圖3是TAT-PAP融合蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與酶活 性的關(guān)系曲線，可見(jiàn)融合蛋白濃度越高酶活性越大，相同濃度時(shí)其活性低于標(biāo)準(zhǔn)品。
[0064] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的鑒定：
[0065] I. TAT-PAP融合蛋白穿過(guò)血脊屏障轉(zhuǎn)導(dǎo)入脊髓組織的鑒定：
[0066] (1)腹腔注射250nmol的TAT-PAP融合蛋白后0h、2h、4h和6h，取出大鼠的腰膨大 節(jié)段脊髓，30 %蔗糖溶液中，4 °C放置48h ;
[0067] (2)按冠狀面對(duì)脊髓進(jìn)行冰凍切片，片厚30 μ m，PBS溶液漂洗后放入抗體板；
[0068] (3)在抗體板中依次加入PAP抗體、生物素標(biāo)記的二抗和ABC復(fù)合物，室溫孵育 8?12h，每步之后均用PBS溶液漂洗；
[0069] (4) DAB顯色,室溫20min后加入雙氧水終止反應(yīng),脫水透明后封片。
[0070] 圖4是TAT-PAP融合蛋白在脊髓組織表達(dá)的DAB染色圖，從圖中可見(jiàn)，4h和61!組 中PAP免疫陽(yáng)性產(chǎn)物明顯增多。標(biāo)尺為50 μ m。
[0071] 本發(fā)明在糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠腹腔注射TAT-PAP融合蛋白0h、2h、4h和 6h后，麻醉處死大鼠取出脊髓，進(jìn)行冰凍切片，DAB染色結(jié)果顯示，注射后4h和6h，觀察到 脊髓背角中PAP免疫陽(yáng)性產(chǎn)物較未給藥的Oh對(duì)照組明顯增多，表明TAT-PAP融合蛋白能穿 透血脊屏障，具有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
[0072] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用的鑒定：
[0073] 1.糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠制備
[0074] 以60mg/kg劑量一次性給予大鼠腹腔注射鏈脲菌素，72h后剪尾靜脈測(cè)血糖 >16. 7mol/L的大鼠為糖尿病模型大鼠。進(jìn)而對(duì)糖尿病模型大鼠在第7d時(shí)的機(jī)械痛閾值 (PWT)和熱痛潛伏期（PWL)進(jìn)行檢測(cè)，取相比正常對(duì)照組痛閾明顯降低（PWT〈8g或PWL〈8s) 的糖尿病模型大鼠作為糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠。
[0075] 2. TAT-PAP融合蛋白對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用
[0076] 在糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大鼠痛敏最強(qiáng)烈的第14d腹腔注射250nmol的 TAT-PAP分別測(cè)定注射后0h、2h、4h和6h的痛閾變化。此外，在制備TAT-PAP融合蛋白的同 時(shí)，PAP氨基酸亂序的TAT-PAPs也同樣被表達(dá)作為對(duì)照。
[0077] 圖5是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后0h、2h、4h和6h糖尿病神經(jīng)病理性痛模型大 鼠機(jī)械痛行為的變化；圖6為熱痛行為變化。由圖5、圖6可見(jiàn)給藥4h后模型大鼠痛行為 有所緩解，直至6h，與同一時(shí)間對(duì)照組TAT-PAPs相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0078] 將本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白腹腔注射到大鼠體內(nèi)，4h后即可明顯緩解模型大鼠的 痛行為。
[0079] 本發(fā)明TAT-PAP融合蛋白具有能穿透血脊屏障，且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的特點(diǎn)，可用于包 括神經(jīng)病理性痛、炎性痛和癌性痛等多種疼痛的治療。
【權(quán)利要求】
1. 一種TAT-PAP融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白是由人類I型免疫缺陷病毒 HIV- I的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成的融合蛋 白 TAT-PAP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的TAT-PAP融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TAT-PAP融合蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟如 下： 步驟1，選取包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD的轉(zhuǎn)錄反式激活因子TAT，且其兩端分別含有Nco I 和Xho I酶切位點(diǎn)序列的pTAT-HA表達(dá)載體；pTAT-HA表達(dá)載體中PTD的cDNA序列為SEQ ID NO:2所示的序列； 步驟2,從Genebank中獲取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化PAP 基因序列，PAP基因序列為SEQ ID NO: 3所不的序列； 步驟3,將步驟2經(jīng)原核表達(dá)優(yōu)化后的PAP基因序列合成為PAP基因片段，序列兩端分 另Ij含有Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的序列，并裝載到pUC57載體中，即為pUC57-PAP載體； 步驟4,將pTAT-HA表達(dá)載體和pUC57-PAP載體均用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I進(jìn)行 雙酶切，酶切條件為：37°C反應(yīng)1?16h，65°C滅活20min，分別回收載體pTAT和目的基因片 段 PAP ; 步驟5,用T4連接酶連接酶切后的載體pTAT和目的基因片段PAP，反應(yīng)條件為：室溫， lOmin，篩選陽(yáng)性單克隆獲得pTAT-PAP重組質(zhì)粒； 步驟6,將pTAT-PAP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞； 步驟7,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，即得到TAT-PAP融合蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TAT-PAP融合蛋白在制備治療糖尿病神經(jīng)病理性痛藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/46GK104211816SQ201410465163
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】崔媛媛, 茍興春, 方科, 徐浩, 張妮, 李妮, 趙湘輝 申請(qǐng)人:西安醫(yī)學(xué)院