一種Vimentin-Fc融合蛋白及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的重組Vimentin-Fc融合蛋白 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)，我國又稱乙腦病毒，屬于黃 病毒科黃病毒屬。JEV引起的流行性乙型腦炎（乙腦)，是一種嚴重的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳 染病，主要流行于東亞、東南亞和南亞，臨床以高熱、驚厥、意識障礙及腦膜刺激征為主。JEV 每年引起大約3~5萬人感染，1~1. 5萬人死亡，幸存者中高達50%伴有嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺 癥。乙腦是2004年我國衛(wèi)生部公布的病死率最高的十大傳染病之一，2006年山西等地再次 出現(xiàn)疫情。近年來在一些乙腦非流行地區(qū)，如塞班島、巴基斯坦和澳洲北部也有病例報道， 表明乙腦已經(jīng)擴大流行，并且有繼續(xù)擴大流行的趨勢。JEV更可作為生物戰(zhàn)劑使用，其重要 性不應忽視。
[0003] 目前對JEV的病原學研宄已較深入，病毒基因組和蛋白的結(jié)構(gòu)與功能已基本清 楚。但JEV宿主細胞上受體分子尚未完全明確，JEV的致病機制尚未闡明，正在使用的疫 苗尚不理想，滅活疫苗免疫力不持久、伴隨一些副作用，減毒活疫苗有潛在的毒力變異危險 性。JEV的發(fā)病機理和抗病毒研宄成為當前研宄的重點和難點。
[0004] Vimentin是目前發(fā)現(xiàn)的JEV的重要潛在受體之一，研宄證實，波形蛋白是一個能 夠與JEV病毒粒子相互作用的細胞表面分子，并且體外原核表達出的重組波形蛋白競爭性 抑制JEV病毒的感染。因此對于JEV的感染起著關(guān)鍵作用。
[0005] "病毒受體陷阱（virus rec印tor trap)療法"是指利用人工合成的可溶性病毒受 體來結(jié)合病毒，進而阻斷病毒與靶細胞膜上的受體結(jié)合及隨后的病毒內(nèi)吞。病毒受體陷阱 已被成功應用于實驗性小鼠 CVB3心肌炎的治療，且表現(xiàn)出良好的抗病毒效果。目前國內(nèi)外 基于病毒受體融合蛋白的"病毒受體陷阱"研宄在其它病毒的研宄中則非常有限。
[0006] 該融合蛋白將JEV受體基因的cDNA融合入人IgGl的Fc區(qū)即構(gòu)建成重組二聚體 蛋白（Vimentin-Fc)，Vimentin-Fc 的 Vimentin 段相當于 IgG 的 Fab 區(qū)，因此 Vimentin-Fc 有可能作為JEV感染神經(jīng)細胞的抑制劑。此融合蛋白的成功研制將為新型抗病毒藥物開發(fā) 提供思路，并對提高乙型腦炎的防控和治療效果具有重要意義和實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種Vimentin-Fc融合蛋白， 融合蛋白的氨基端是中間絲的波形蛋白，羧基端是人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc 片段之間直接融合或通過連接序列融合；所述Vimentin-Fc融合蛋白為P1-L-P2或P1-P2 形式，其中Pl為Vimentin蛋白全長，P2為人IgG Fc區(qū)段，L為連接肽。
[0008] 所述波形蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述人免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 所述的連接肽序列為GlySerGly4。
[0011] 本發(fā)明另一目的在于提供編碼上述Vimentin-Fc融合蛋白的基因序列； 本發(fā)明還提供了編碼Vimentin全長區(qū)段、Linker與Fc融合蛋白的編碼基因在融合后 的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0012] 本發(fā)明另一目的在于提供上述Vimentin-Fc融合蛋白在制備用于抗乙型腦炎病 毒感染藥物中的應用。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過下述具體方法和步驟來實現(xiàn)： a) 根據(jù)Vimentin和人IgG Fc基因序列分別設(shè)計引物，并分別在人IgG Fc和Vimentin 基因的正向和反向引物中引入Linker蛋白對應的基因序列GGATCAGGCGGGGGTGGG，以便在 隨后的融合PCR中在Vimentin和人IgG Fc的融合基因間引入Linker序列； b) 將步驟a)中的設(shè)計并合成的引物分別對成神經(jīng)瘤細胞和人淋巴細胞的cDNA進行 擴增，分別獲得Vimentin和人IgG Fc基因片段后，再以兩個基因片段為模板，以Vimentin 正向引物和人IgG Fc基因反向引物為上下游引物，進行融合PCR擴增，獲得Vimentin-Fc 融合基因； c) 利用融合基因兩端引入的和I酶切位點，將融合基因片段引入表達載體 中，獲得Vimentin-Fc融合蛋白的重組表達載體； d) 將步驟c)中的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，篩選獲得表達Vimentin-Fc融合蛋白 的工程菌； e) 培養(yǎng)步驟d)獲得的工程菌； f) 從步驟e)中的培養(yǎng)產(chǎn)物中以親和純化的方式分離Vimentin-Fc融合蛋白，以PBS 溶液進行蛋白復性。
[0014] 所述步驟c)中的表達載體可以選用各種已知的載體，優(yōu)選為載體pET32a或載體 pPIC9K〇
[0015] 所述步驟d)中的宿主細胞優(yōu)先為與載體pET32a對應的Rosetta菌或與載體 PPIC9K對應的畢赤酵母菌。
[0016] 本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，上述Vimentin-Fc融合蛋白的制備方法為：將篩 選得到并測序正確的工程菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件為37°C，0. 5mM IPTG條件下誘導表 達4小時，9000rpm離心后，收集菌體，超聲破碎，用8M尿素裂解過夜，再用Ni-NTA分離 Vimentin-Fc融合蛋白。
[0017] 本發(fā)明通過基因克隆和基因重組技術(shù)合成一種Vimentin-Fc融合蛋白，該融合 蛋白中的Vimentin部分是Vimentin蛋白全長，通過其乙型腦炎病毒受體的功能來結(jié)合 并達到捕獲病毒的目的；而Fc部分則起效應功能，如抗體依賴的細胞毒作用和補體依 賴的細胞毒作用，從而達到使捕獲的病毒易于機體免疫系統(tǒng)識別和清除的作用。通過將 Vimentin-Fc融合蛋白的基因克隆到一個表達載體中，轉(zhuǎn)化受體細胞得到工程菌，擴大培養(yǎng) 制備Vimentin-Fc融合蛋白。通過蛋白復性，使得Vimentin-Fc融合蛋白具有較高的生物 活性。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明中重組質(zhì)粒的電泳結(jié)果示意圖；其中泳道M為DNA相對分子質(zhì)量標 記；泳道1為Vimentin-Fc融合基因菌液PCR結(jié)果； 圖2是本發(fā)明中重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果示意圖；其中泳道M為DNA相對分子質(zhì)量標 記；泳道1為雙酶切鑒定重組質(zhì)粒； 圖3是本發(fā)明中蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果示意圖；其中泳道M為蛋白相對分子質(zhì)量標 準；泳道1為未誘導菌液樣品；泳道2為已誘導菌液樣品； 圖4是本發(fā)明中純化后的蛋白的SDS-PAGE檢測示意圖；其中泳道M為蛋白相對分子質(zhì) 量標準；泳道1為未誘導菌液樣品；泳道2為已誘導菌液樣品；泳道3-7為純化條帶； 圖5是本發(fā)明不同濃度Vimentin-Fc重組蛋白對JEV復制的影響結(jié)果。
【具體實施方式】
[0019] 下面用實施例對本發(fā)明做進一步闡述，應當理解為，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而非對本發(fā)明有任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所做的 任何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0020] 實施例1 :融合蛋白Vimentin-Fc的載體構(gòu)建和蛋白表達 Vimentin-Fc融合蛋白的表達過程包括以下步驟：克隆基因；把基因插入表達載體， 將表達載體轉(zhuǎn)化進入Rosetta菌；利用表達載體的Kana抗性篩選出正確轉(zhuǎn)入載體的 Rosetta菌株，培養(yǎng)該菌株，利用IPTG作為誘導劑，誘導蛋白表達，最后從包涵體中分離純 化Vimentin-Fc蛋白，具體包括： 1、基因克隆 在基因合成的專業(yè)公司（上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司）合成引物，利用引物通 過融合PCR技術(shù)從人淋巴細胞和成神經(jīng)瘤細胞中克隆SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。其 中1-6是及I的酶切位點；7-1404是編碼中間絲的波形蛋白的核苷酸序列，1405-1422 是插入的linker序列，1423-2091是編碼IgG Fc片段的核苷酸序列；2091-2099是I 的酶切位點。
[0021] I. I Vimentin 基因的獲得 1. 1. 1病毒培養(yǎng) 將培養(yǎng)瓶內(nèi)中匯合率長至90%的成神經(jīng)瘤細胞，以PBS溶液洗1遍，再以Iml Trizol 裂解液加入裂解細胞。
[0022] I. I. 2 RNA 提取 將Trizol裂解的細胞靜置5min，加200 μ 1氯仿，劇烈震蕩5s。室溫靜置5min，然后 4°C，12000r/min離心15min。取上層水相移至另一個Ep管中。加入500 μ1異丙醇輕柔 顛倒混勾，室溫靜置5min，13000r/min離心5min棄上清。加入1ml 75%乙醇洗絳沉淀，溫 和震蕩離心管，使沉淀懸浮。13000r/min離心15min棄上清，室溫晾干15min。加入30 μ 1 DEPC 水溶解 RNA，用 spectro photometer 檢測 RNA 濃度。
[0023] I. 1. 3 反轉(zhuǎn)錄 使用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit，按照使用說明操作，反應體系：
【主權(quán)項】
1. 一種Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：融合蛋白包括中間絲的波形蛋白和人免 疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc片段之間直接融合或通過連接序列融合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述波形蛋白氨基酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Vimentin-Fc融合蛋白，其特征在于：所述人免疫球蛋 白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 編碼權(quán)利要求1-3中任一項所述Vimentin-Fc融合蛋白的核酸分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
6. 權(quán)利要求1所述的Vimentin-Fc融合蛋白在制備抗乙型腦炎病毒感染藥物中的應 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Vimentin-Fc融合蛋白及其應用，本發(fā)明利用分子生物學和細胞生物學技術(shù)，構(gòu)建波形蛋白Vimentin與人IgG的Fc片段的融合蛋白，所述的融合蛋白包括中間絲的波形蛋白和人免疫球蛋白的Fc片段，波形蛋白與Fc片段之間直接融合或通過連接序列融合；本發(fā)明提供的融合蛋白可用于乙型腦炎病毒感染的預防或治療或作為生物制劑用于Vimentin和Fc蛋白功能的相關(guān)科學研究。
【IPC分類】A61K38-17, A61K47-48, A61P31-14, C07K19-00, C12N15-62
【公開號】CN104877029
【申請?zhí)枴緾N201510197134
【發(fā)明人】張金陽, 靳子安, 宋玉竹, 韓芹芹, 陳強, 夏雪山
【申請人】昆明理工大學
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月24日