抗凝融合蛋白ea及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抗凝融合蛋白EA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通過(guò)連接肽與AnnexinA5蛋白的N端連接得到。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，Echistatin C端通過(guò)Linker(GGGG)串聯(lián)AnnexinA5得到融合蛋白，該融合蛋白能夠靶向定位結(jié)合活化血小板外翻的PS上，同時(shí)結(jié)合血小板膜上受體GPIIbIIIa,發(fā)揮抗血小板聚集和抗凝血的雙重效果，協(xié)同作用達(dá)到較高的抗栓水平；且該融合蛋白在血栓形成過(guò)程中影響初級(jí)和次級(jí)凝血功能，可發(fā)揮抗栓功效，可廣泛用于抗血栓性疾病的防治，為新藥物開(kāi)發(fā)提供參考。
【專利說(shuō)明】
抗凝融合蛋白E A及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗凝融合蛋白EA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在血管內(nèi)面剝落處或修補(bǔ)處，血流變化，血小板沉積、白細(xì)胞聚集和凝血因子增多 等血液性質(zhì)改變，導(dǎo)致血栓形成。血栓形成受遺傳、環(huán)境多因素共同作用影響，一旦形成，往 往會(huì)引發(fā)血栓性疾病等不可逆后果。血栓性疾病有高發(fā)病率、致殘率和致死率等特點(diǎn)，嚴(yán)重 危害人類生命健康。血栓的預(yù)防和治療備受關(guān)注，抗栓藥物的開(kāi)發(fā)和使用仍是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研 究熱點(diǎn)。
[0003] 目前抗血栓藥物(主)要有抗血小板藥物、抗凝藥物和溶栓藥物三類，高效抗栓、減 少副作用是抗栓藥物的發(fā)展目標(biāo)。臨床上雙聯(lián)或三聯(lián)抗栓治療有效結(jié)合抗血小板和抗凝雙 重功效，實(shí)施個(gè)性化治療、檢測(cè)和評(píng)估，是當(dāng)今研究和治療的熱門方向。AnnexinA5以鈣離子 依賴方式結(jié)合PS，PS在凝血系統(tǒng)中是多種因子活化的必需因素;去整合素有抗血栓形成、抑 制腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理功能。如何特異性發(fā)揮抗栓作用，合理設(shè)計(jì)融合蛋白是開(kāi)發(fā)抗栓藥 物的重要研究方向。
[0004] 血栓形成機(jī)制復(fù)雜，其中血小板和凝血系統(tǒng)是較重要的影響因素。初級(jí)止血形成 止血栓，血小板發(fā)揮主導(dǎo)作用;次級(jí)凝血中需要激活一系列的凝血因子和相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形 成穩(wěn)固的血凝塊，凝血系統(tǒng)為主導(dǎo)?？顾ㄋ幬锸欠窦绒卓寡“寰奂?，又干擾凝血系統(tǒng)，需 要一系列實(shí)驗(yàn)證明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抗凝融合蛋白EA。
[0006] 本發(fā)明提供的融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。
[0007] 上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通過(guò)連接肽與AnnexinA5 蛋白的N端連接得到。
[0008] 上述融合蛋白中，所述連接肽為4個(gè)甘氨酸。
[0009] 上述融合蛋白為如下1)或2):
[0010] 1)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0011] 2)將1)所示蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。
[0012] 為了使（1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0013] 表1標(biāo)簽的序列

[0015] 上述(2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(2)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端 連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 編碼上述融合蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 上述DNA分子是如下1)_3)中任一種的DNA分子：
[0018] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[0019] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0020] 3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0021] 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC、0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、 0 · 1 % SDS和 1 X SSC、0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0022]含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍。
[0023] 上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌 在抗血栓中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0024] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌在抗血小板聚集中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0025] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌在抗凝血中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0026] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌在制備抗血栓產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0027] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌在制備抗血小板聚集產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0028] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌在制備抗凝血產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種具有如下1)-3)中至少一種功能的產(chǎn)品。
[0030] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達(dá) 盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；
[0031] 1)抗血栓；
[0032] 2)抗血小板聚集；
[0033] 3)抗凝血。
[0034]上述方法中，所述產(chǎn)品為藥物。
[0035 ]上述抗凝血體現(xiàn)在融合蛋白EA延長(zhǎng)血衆(zhòng)凝血時(shí)間，具體通過(guò)EA結(jié)合PS延長(zhǎng)凝血時(shí)間；
[0036] 上述抗血小板聚集體現(xiàn)在抑制血小板聚集或者結(jié)合GPIIb/II la受體。
[0037] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，Echistatin C端通過(guò)Linker(GGGG)串聯(lián)AnnexinA5得到融合 蛋白，該融合蛋白能夠靶向定位結(jié)合活化血小板外翻的PS上，同時(shí)結(jié)合血小板膜上受體 GPIIbllla，發(fā)揮抗血小板聚集和抗凝血的雙重效果，協(xié)同作用達(dá)到較高的抗栓水平;且該 融合蛋白在血栓形成過(guò)程中影響初級(jí)和次級(jí)凝血功能，可發(fā)揮抗栓功效，可廣泛用于抗血 栓性疾病的防治，為新藥物開(kāi)發(fā)提供參考。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為Echistatin基因電泳圖。
[0039] 圖2為EA融合基因電泳圖。
[0040] 圖3為陽(yáng)性克隆菌落PCR電泳檢測(cè)。
[0041 ] 圖4為不同IPTG濃度誘導(dǎo)GST-EA表達(dá)檢測(cè)。
[0042] 圖5為12 % SDS-PAGE鑒定GST-EA蛋白不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)。
[0043] 圖6為GST-EA蛋白不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)。
[0044] 圖7為親和層析純化GST-EA。
[0045] 圖8為12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)PSP酶剪切目的蛋白的效率。
[0046] 圖9為12%SDS-PAGE電泳鑒定得到的EA。
[0047] 圖 10為EA蛋白western blot鑒定。
[0048] 圖 11 為EA蛋白的 HPLC鑒定，其中，VWD:信號(hào)A，280nm，EA · dat。
[0049] 圖12為EA蛋白與磷脂結(jié)合分析。
[0050]圖13為EA蛋白與不同劑量PS結(jié)合活性分析。
[00511圖14為Ca2+對(duì)EA蛋白與PS結(jié)合影響分析。
[0052] 圖15為EA對(duì)血漿凝血時(shí)間的作用。
[0053] 圖16為EA抑制血小板聚集率活性。
[0054] 圖17為不同蛋白對(duì)血小板平均熒光強(qiáng)度的作用。
[0055] 圖18為EA小鼠體內(nèi)出血時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0057]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058] pJETl. 2載體購(gòu)自Thermo公司；小鼠抗AnnexinA5多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保 存;R⑶多肽由北京金盛生物公司合成;KM小鼠（罕）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公 司；pJET1.2/blunt載體購(gòu)自Thermo(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；pGEX-6P-l載體、 Sephacryl S200HR凝膠、GST親和介質(zhì)購(gòu)自GE Healthcare公司；Phosphatidylcholine購(gòu)自 北京利維寧生物技術(shù)有限公司；Coomassie Brilliant Blue G-250、R-250、Goldview、 Glycine、TEMED、Amp、IPTG、TMB、DAB、脫脂奶粉、HRP-山羊抗小鼠 IgG二抗、ADP·Na2等購(gòu)自 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；凝血酶、牛血纖維蛋白原購(gòu)自北京中生泰瑞科技有限公 司; FITC-羊抗人纖維蛋白原購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司。
[0059]下述實(shí)施例中部分試劑如下：
[0060] TM 表達(dá)培養(yǎng)基（800mL): Iryptofte 9.6：g Yeast Extract 19.2g
[0061 ] NaCl 8. Og 50%甘油 9. 6mL 11 Tris 溶液 7. 44mL
[0062] 用蒸餾水溶解定容至80〇111匕121°(：高壓滅菌20min，冷卻。
[0063] 1\卩85緩沖液（1〇: NaCl 8. Og K(； 1 0.?
[0064] KH,P04 0.24g Na,HP04 · 12Ε? 2. 9g
[0065] 用900mL蒸餾水溶解，濃HC1調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至11^，真空抽濾除雜。
[0066] 10mM GSH(lOOmL):0.3g的還原性谷胱甘肽溶于100mL的1 XPBS緩沖液，小量分 裝，-20 °C保存。
[0067] PSP酶儲(chǔ)存液（100mL): NaCl 0.88g EDTA 0,03g
[0068] DTt 0.08g 甘妯 50mL
[0069] 用25mM的Tris-HCl(pH8.0)溶解，定容至100mL，小量分裝，-20°C保存。
[0070] 50mg/mL氨芐青霉素（30mL):稱取1.5g氨芐青霉素溶解于30mL的無(wú)菌蒸餾水，用 0.22μΜ的濾膜過(guò)濾除雜，小量分裝-20°C保存。
[0071] 0.1M IPTG(30mL):稱取0.715g IPIG溶解于30mL的無(wú)菌蒸餾水，用0.22μΜ的濾膜 過(guò)濾除雜，小量分裝-20 °C保存。
[0072] R250染色液（1L):
[0073] R250 l.Og
[0074] 無(wú)水乙醇 420mL
[0075] 冰乙酸 100mL
[0076] 蒸餾水溶解定容至1L，棕色瓶室溫避光保存。
[0077] G250染色液（500mL):50mg的Brilliant Blue G-250溶于25mL的95%乙醇，加50mL 磷酸溶液，用蒸餾水充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00mL，避光過(guò)濾。
[0078]脫色液（1L):
[0079] 冰乙酸 50mL
[0080] 無(wú)水乙醇 450mL [0081 ]蒸餾水 500mL
[0082] 轉(zhuǎn)膜緩沖液（500mL): 甘氨酸 L 45g Tris： 2 .9? g
[0083] $：DS 0,185g 甲醇 iOOffiL
[0084] 用蒸餾水定容至500mL，冰浴放置，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0085]洗膜緩沖液/TBST( 1L):
[0086] NaCl 5.84g
[0087] Tris 1.21g
[0088] 用800mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值為7 · 5，加0 · 5mL的Tween-20，定容至1L。
[0089] TBS(IL)：
[0090] Tris 2.42g
[0091] NaCl 8.8g
[0092] 用900mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.4，定容至1匕
[0093] Binding Buffer:含2%脫脂奶粉，5mMCaCl2的TBS溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0094] Washing buffer:含0.05 % Tween-20，2mMCaCl2 的 TBS 溶液。
[0095] ELISA 顯色液：
[0096] A:乙酸鈉2.72g，檸檬酸鈉0.32g，30%H202 60yL，蒸餾水定容至100mL。
[0097] 8:檸檬酸鈉0.198 40了六.他2 0.048，了]\?0.038，甘油1011^，蒸餾水溶解定容至 100mL；
[0098] 顯色前將A液和B液等體積混合。
[0099] 纖維蛋白原溶液：用20mL的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(PH7.4)溶解100mg纖維蛋 白原，配置成〇. 5 %纖維蛋白原溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用）。
[0100] 凝血酶:用質(zhì)量百分含量0.9%生理鹽水配置成40U/mL凝血酶溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用）。 [0101] 肝素鈉溶液:生理鹽水配置成200U/mL肝素鈉注射液。
[0102] ADP誘導(dǎo)劑：用生理鹽水配置成300ymol/L ADP · Na2溶液。
[0103] RGD多肽:GA-10，序列：GCGRGDWPCA，分子量：1019 · 20Da。
[0104] 實(shí)施例1、EA融合蛋白的獲得
[0105] EA融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通過(guò)Linker(GGGG)與AnnexinA5蛋白的N端連 接，得到融合蛋白。
[0106] EA融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2,其編碼基因的核苷酸序列為序列表 中序列1。
[0107] 序列2第1-77位氨基酸為Echistatin蛋白，序列2第82-400位氨基酸為AnnexinA5 蛋白。
[0108] 序列1第1-231位核苷酸為Echistatin蛋白編碼基因，序列1第244-1200位核苷酸 為AnnexinA5蛋白編碼基因。
[0109] -、表達(dá)EA融合蛋白基因的載體的構(gòu)建 [0110] 1、自行構(gòu)建獲得Echistatin基因
[0111] 以如下表2中的E1F和E1R作為模板，E2F和E2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物。
[0112] 將上述PCR產(chǎn)物電泳，結(jié)果如圖1所示，M.DNA marker; l_3.Echistatin基因，可以 看出，得到231bpPCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物為序列表中序列1第1-243位 所示的Echistatin基因。
[0113] 表2引物序列
[0116] 2、EA融合蛋白基因的構(gòu)建
[0117] 表3
[0119] 單下劃線的分別是BamHI和Xhol的識(shí)別位點(diǎn)，雙下滑線為互補(bǔ)片段4個(gè)甘氨酸序 列。
[0120] 分別以上述Echistatin基因和pGEX-6P-l_AnnexinA5質(zhì)粒為模板，用表4所示的引 物或體系分別進(jìn)行PCR。
[0121] 表4
[0123] PCR 反應(yīng)程序:95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 lmin，56°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min(循 環(huán)30次）；72°C延伸10min;4°C保存。
[0124] 體系1和2分別得到Echistatin-L(經(jīng)過(guò)測(cè)序，其核苷酸序列為序列1第1-243位，其 中232-243為連接肽的編碼DNA分子)和L-AnnexinA5基因（經(jīng)過(guò)測(cè)序，其核苷酸序列為序列1 第232-1203位，其中232-243為連接肽的編碼DNA分子）。
[0125] 以Echistatin-L和L-AnnexinA5基因?yàn)槟０澹訣3F、LAA-3分別為上、下游引物，進(jìn) 行PCR，得到 1226bp的PCR產(chǎn)物（圖 2，M. DNAmarker; 1 -4為EA基因）。
[0126] 將1226bp的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序，其核苷酸序列為序列表中序列1，將該P(yáng)CR產(chǎn)物命名 為EA基因。
[0127] 3、表達(dá)EA基因的重組載體的獲得
[0128] 將上述獲得的序列1所示的EA基因替換表達(dá)載體PGEX-6P-1(GE Healthcare公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)Code no. 28-9546-48)的BamHI和Xhol之間的片段，得到表達(dá)EA基因的重組載 體，命名為PGEX-6P-1 -EA，EA基因與載體上的GST標(biāo)簽融合表達(dá)。
[0129] 二、EA融合蛋白的表達(dá)
[0130] 1、表達(dá)EA融合蛋白基因的重組菌的構(gòu)建
[0131] 將上述重組載體pGEX-6P-1-EA轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，得到重組菌BL21(DE3)/pGEX-6P-卜EA〇
[0132] 菌液PCR鑒定，引物為E3F、LAA-3，結(jié)果如圖3所示，M. DNA marker; 1-2，特異性較好 的PCR電泳;得到1226bp為陽(yáng)性菌。
[0133] 對(duì)照:將pGEX-6P-l轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，得到重組菌BL21(DE3)/pGEX-6P-l。
[0134] 2、EA融合蛋白的表達(dá)條件摸索
[0135] 1)最適IPTG濃度的摸索
[0136] 將重組菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA的單菌落至5mL LB液體培養(yǎng)基(Amp濃度為50μ g/mL)，37°C，190rpm培養(yǎng)過(guò)夜，得到菌液。以重組菌BL21 (DE3)/pGEX-6P-l為對(duì)照。
[0137] 將菌液按1:100的比例加入100mL的TM表達(dá)培養(yǎng)基中，37°C擴(kuò)培3.5h左右達(dá)到對(duì)數(shù) 期，0D 6qq為0 · 6-0 · 8之間，加入IPTG(終濃度設(shè)定為:0、25、50、100、150、200、300ymo 1/L)后， 在25°C，190rpm誘導(dǎo)12h。在4°C，6000rpm離心15min收集菌沉。菌沉用20mL 1 XPBS溶解。在 等功率破碎相同的時(shí)間，4°C，12000rpm離心20min，分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測(cè)在 不同溫度下，目的蛋白的表達(dá)情況。
[0138] 結(jié)果如圖4所示，M.Protein marker(上樣量5ul) ;l.BL21(DE3)/pGEX-6P-l未加 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況;2 · BL21 (DE3)/pGEX-6P-l加 100μΜ IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況;3-9 · BL21 (DE3)/ PGEX-6P-1-EA 加 IPTG 終濃度為(^]?、25以]\1、5(^]\1、10(^]\1、15(^]\1、20(^]\1、30(^]\1誘導(dǎo)表達(dá)情況； 可以看出，與BL21 (DE3) /pGEX-6P-1 相比，BL21 (DE3) /pGEX-6P-1 -EA66kD加入IPTG有明顯的 70kD目的蛋白條帶，為EA與載體上GST融合表達(dá)得到的重組蛋白GST-EA。
[0139] 且在IPTG為100μΜ時(shí)，蛋白表達(dá)量較高，且不隨IPTG濃度提高而增多。IPTG濃度過(guò) 高易形成包涵體，并且IPTG對(duì)細(xì)胞有一定的毒性。因此，經(jīng)實(shí)驗(yàn)探索得知IPTG誘導(dǎo)濃度為 100μΜ〇
[0140] 2)最適表達(dá)溫度的摸索
[0141] 將BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA菌液按1:100的比例加入100mL的ΤΜ表達(dá)培養(yǎng)基中，37 °C擴(kuò)培3.5h左右達(dá)到對(duì)數(shù)期，0D6QQ為0.6-0.8之間，加入IPTG(終濃度為100μπιο1/υ后，分別 在37°C、30°C、25°C，190rpm誘導(dǎo) 12h。在4°C，6000rpm離心 15min收集菌沉。菌沉用20mL 1 X PBS溶解。在等功率破碎相同的時(shí)間，4°C，12000rpm離心20min，分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測(cè)在不同溫度下，目的蛋白的表達(dá)情況。
[0142] 結(jié)果如圖5所示，1 -3，37°C誘導(dǎo)的全蛋白、上清、包涵體;4-6，30°C誘導(dǎo)的全蛋白、 上清、包涵體;7-9，25°C誘導(dǎo)的全蛋白、上清、包涵體;可以看出，由圖可見(jiàn)，在37°C、30°C、25 °C溫度下誘導(dǎo)，目的蛋白均能大量表達(dá)，且在上清和包涵體中都存在。為方便誘導(dǎo)和純化， 避免包涵體錯(cuò)誤折疊降低活性，后期大量誘導(dǎo)選擇25°C度誘導(dǎo)，收集上清液進(jìn)行下一步的 純化與性質(zhì)研究。
[0143] (3)最適誘導(dǎo)時(shí)間的摸索
[0144] BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最適的溫度25°C和100μΜ IPTG濃度下，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)定 為Oh、5h、6h、7h、8h、9h、1 Oh、1 lh、12h、20h，其他條件相同，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白隨時(shí)間積累情 況。
[0145] 結(jié)果如圖 6 所示，1-10.加入 IPTG 誘導(dǎo)詘、511、611、711、811、911、1011、1111、1211、2011全蛋 白表達(dá)情況，由圖可見(jiàn)，加入誘導(dǎo)劑后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白逐漸增多，在llh-12h時(shí)蛋白 積累量達(dá)到最大，在誘導(dǎo)20h全蛋白目的蛋白量有部分減少，推測(cè)是由于誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋 白被降解，或是在營(yíng)養(yǎng)物大量消耗后部分蛋白被大腸桿菌消耗。因此，后期大量表達(dá)時(shí)間應(yīng) 在12h左右。
[0146] 3、融合蛋白EA的純化
[0147] 1)破菌
[0148] 收集BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最適的溫度25°C和100μΜ IPTG濃度下誘導(dǎo)12h的 菌液，4°C，6000rpm離心20min，收集菌沉。稱取適量菌沉，按照每克菌沉15mLl XPBS的比例 充分溶解菌沉，冰浴，超聲破碎懸液，功率600W，工作3s，間歇27s，共20min(40次循環(huán)），避免 產(chǎn)生泡沫;4°C，12000rpm離心20min，收集上清液。
[0149] 2)GST親和層析純化
[0150] (1)裝柱和平衡:將親和介質(zhì)加入到層析柱中，自然沉降。用40mL的1 XPBS平衡層 析柱，流速為lmL/min，調(diào)節(jié)紫外檢測(cè)儀示數(shù)至零。
[0151] (2)上樣和洗滌:上述1)得到的上清液，用0.45μπι的針頭過(guò)濾器過(guò)濾。上樣流速為 O.SmL/miruPBS洗滌，流速為lmL/min，直至紫外檢測(cè)儀示數(shù)降至基線。
[0152] (3)洗脫:用10mM的還原性谷胱甘肽溶液洗脫目的蛋白GST-EA，流速為0.5mL/min， 紫外檢測(cè)儀示數(shù)上升出現(xiàn)峰值，收集蛋白。
[0153] (4)蛋白濃縮、除鹽:將蛋白加入到30KD的超濾管，4°C，3000g離心10min，除去部分 還原性谷胱甘肽，PBS稀釋濃縮液，再次超濾。
[0154] (5)柱子再生和保存：用2倍介質(zhì)體積的0.5M NaOH溶液洗柱子，除去非特異性吸附 的雜質(zhì)，用ddH20洗至中性，用4倍介質(zhì)體積的20 %乙醇洗滌，4 °C保存。
[0155] (6)SDS_PAGE 檢測(cè)。
[0156] 結(jié)果如圖7所示，1.25 °C誘導(dǎo)表達(dá)上清液;2.穿透液;3-4.洗脫得到的GST-EA，可以 看出，將破碎后上清液稀釋后上樣到GST親和柱，減緩流速，穿透液中目的蛋白較少，GST親 和柱效高;GSH洗脫出的蛋白純度與產(chǎn)量較好，目的蛋白GST-EA純度為92%。
[0157] 3)PSP酶切除重組蛋白GST-EA的GST標(biāo)簽
[0158] 用GST親和層析純化得到的GST-EA，使用PSP酶（南通表源生物技術(shù)有限公司， 1000Units/mg)分別按照摩爾比例為800:1，400:1，200:1，100:1，50:1，10:1，3:1混勻（裂解 buffer:0.5mol/L Tris-HCl+150mM Nacl+0.1%Triton-100，pH 8·0)，4Γ，酶切 12h〇
[0159] SDS-PAGE檢測(cè)不同比例的酶切效果，結(jié)果如圖8所示，1-8. PSP酶切效果(融合蛋白 與PSP酶的摩爾數(shù)比分別為800、400、300、200、100、50、10、3;9.重組蛋白631^六對(duì)照，可以 看出，在重組蛋白GST-EA與PSP酶的摩爾數(shù)比為800酶切12h，可將重組蛋白GST-EA充分切 開(kāi)，證明PSP酶活性較強(qiáng)。8泳道中出現(xiàn)三個(gè)蛋白條帶，由上至下分別為PSP酶（46kD)、EA (44kD)、GST標(biāo)簽(26kD)。9泳道中較粗條帶為GST-EA(70kD)，該融合蛋白出現(xiàn)一定程度的標(biāo) 簽脫落。
[0160] 將GST-EA與PSP酶按照摩爾比例為800:1酶切得到的溶液樣品過(guò)GST親和層析柱， PBS洗滌，收集穿透峰，濃縮脫鹽，得到洗脫液。
[0161 ] 洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖9所示，M.Protein marker; 1-2·ΕΑ，可以看出， 得到大小為44kD的目的融合蛋白ΕΑ。
[0162 ]融合蛋白ΕΑ的氨基酸序列為序列2。
[0163] 4、融合蛋白ΕΑ的驗(yàn)證
[0164] l)Western blot驗(yàn)證
[0165] 將純化的AnnexinA5蛋白（按照文獻(xiàn)的方法制備AnnexinA5蛋白：梁盼盼，張?chǎng)稳铮?井健.人Annexin A5的表達(dá)及性質(zhì)研究.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009,45(4): 378-380. AnnexinA5蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列1的第231-1203位）、上述3得到的融 合蛋白EA上樣進(jìn)行Western blot檢測(cè)，一抗為AnnexinA5多克隆抗體，二抗為HRP-山羊抗小 鼠抗體。
[0166] 結(jié)果如圖10所示，1.陽(yáng)性對(duì)照AnnexinA5; 2.融合蛋白EA，可以看出，融合蛋白EA條 帶略高于陽(yáng)性對(duì)照條帶，目的蛋白條帶對(duì)比marker位置，與蛋白分子量一致。
[0167] 2)分子篩(SEC-HPLC)鑒定
[0168] (1)準(zhǔn)備：超純水、平衡液（1 X PBS)、200yL上述3得到的融合蛋白EA、10 %甲醇經(jīng) 0.22μΜ的針形濾膜過(guò)濾。
[0169] (2)開(kāi)機(jī)：打開(kāi)四元栗、檢測(cè)器等進(jìn)入自檢，設(shè)定參數(shù)v = 5mL/min，水洗約2個(gè) Sephacry 1 S200凝膠柱體積，排除氣泡。
[0170] (3)平衡:用平衡液1 XPBS平衡體系約2個(gè)柱體積直至基線平穩(wěn)。
[0171] (4)上樣:上樣200yL上述3得到的融合蛋白EA，1個(gè)柱體積的平衡液進(jìn)樣。
[0172] (5)結(jié)束:分別用超純水和10%甲醇清洗管道和柱子，輸出圖譜，分析。
[0173] 結(jié)果如圖11所示，圖譜顯示在保留時(shí)間8. 150-9.093min檢測(cè)到EA蛋白，在 8.513min達(dá)到峰值，與HPLC測(cè)定的蛋白分子量44kD峰值參數(shù)出現(xiàn)時(shí)間一致，峰型對(duì)稱性較 好，目的蛋白EA含量的面積百分比達(dá)到92.852%，蛋白以單體形態(tài)穩(wěn)定存在。
[0174] 實(shí)施例2、融合蛋白EA的功能研究
[0175] -、EA脂質(zhì)結(jié)合活性分析
[0176] 1、EA的磷脂結(jié)合分析
[0?77] (1)分別稱取10mg PS(磷脂酰絲氨酸，phosphatidylserine，購(gòu)自北京華邁科生物 技術(shù)有限公司）和PC(磷脂酰膽堿，phosphatidyl choline，購(gòu)自北京利維寧生物科技有限公 司）溶解于10mL氯仿中，向每個(gè)酶標(biāo)孔中加入2.5yg，放于通風(fēng)櫥中待溶劑揮發(fā)完全，磷脂吸 附到聚苯乙烯表面上。
[0178] (2)封閉：每孔中加入100yL TBS配置5% (w/v)脫脂奶粉的封閉液，封口膜封板，37 °C封閉2h。棄去封閉液，每孔加入200yLwashing buffer，靜置3min棄去，重復(fù)3次。充分除凈 液體。
[0179] (3)Binding buffer將實(shí)施例1的純化的融合蛋白EA和AnnexinA5蛋白稀釋不同濃 度，向每孔加入50yL蛋白樣品，37°C溫育2h，washing buffer洗滌3次，方法同上。
[0180] (4)孵一抗:binding buffer以1:10000比例稀釋一抗（小鼠抗AnnexinA5多克隆抗 體），每孔加 l〇〇yL，37°C孵育lh，washing buffer洗滌3次。
[0181 ] (5)孵二抗:binding buffer以1:5000比例稀釋二抗(HRP-山羊抗鼠 IgG抗體），每 孔加100yL，37°C孵育lh，washing buffer洗滌6次，ddH20洗滌3次，用濾紙吸干水分。
[0182] (6)顯色:將TMB顯色液A、B等體積混合，每孔加入140yL，暗處反應(yīng)10min，此時(shí)呈現(xiàn) 不同程度的藍(lán)色。
[0183] (7)終止反應(yīng):每孔加入40yL 2mol/LH2S〇4,反應(yīng)孔中藍(lán)色變?yōu)辄S色，穩(wěn)定5min。
[0184] (8)用酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔的吸光度。
[0185] 該Elisa過(guò)程是磷脂吸附-AnnexinA5包被-AnnexinA5小鼠源抗體特異結(jié)合-HRP標(biāo) 記山羊抗小鼠抗體孵育-TMB應(yīng)用液顯色生成有色產(chǎn)物，在λ = 450ηπι測(cè)定吸光值，AnnexinA5 與磷脂結(jié)合活性越強(qiáng)，吸光值越高。磷脂(PS或PC)吸附在酶標(biāo)板上，AnnexinA5分子與不同 磷脂結(jié)合能力不同，AnnexinA5包被磷脂程度成劑量依賴關(guān)系。
[0186] 結(jié)果如圖12所示，可以看出，AnnexinA5與PS結(jié)合活性隨著蛋白濃度的升高而增 強(qiáng);AnnexinA5不與PC結(jié)合。與AnnexinA5相比，EA蛋白磷脂結(jié)合性質(zhì)與趨勢(shì)沒(méi)有明顯區(qū)別， 說(shuō)明Echistatin沒(méi)有遮擋AnnexinA5與PS作用位點(diǎn)。AnnexinA5濃度為50yg/mL時(shí)，與2 · 5yg PS結(jié)合已趨向飽和。
[0187] 2、磷脂劑量與磷脂結(jié)合分析
[0188] 各孔中 EA 為 50yL，50yg/mL。將 PS 的劑量設(shè)定為 0yg、0.4yg、0.8yg、1.2yg、1.6yg、 2.(^8、2.448、2.848、3.2以8，其他步驟同上述1。
[0189] 結(jié)果如圖13所示，由圖可見(jiàn)，不同劑量PS固定在酶標(biāo)板上，EA與PS結(jié)合呈現(xiàn)出劑量 依賴關(guān)系，在PS>2.5yg，蛋白與PS結(jié)合逐步達(dá)到飽和。
[0190] 3、鈣離子濃度與磷脂結(jié)合分析
[0191] 各孔中EA為50yL，20yg/mL，PS劑量為2.5yg，binding buffer中Ca2+濃度設(shè)定為 OmM、0 · 0 ImM、0 · 05mM、0 · ImM、0 · 5mM、1 · OmM、3mM、5mM、1 OmM、20mM、50mM、1 OOmM。其他步驟同 上。
[0192] 結(jié)果如圖14所示，AnnexinA5是鈣離子依賴磷脂結(jié)合蛋白，Ca2+存在時(shí)與帶負(fù)電荷 的PS可逆性結(jié)合，在Ca 2+濃度為0.5-10mM之間，EA與PS結(jié)合活性隨Ca2+濃度增高而提升。
[0193] 二、EA對(duì)血漿凝血時(shí)間影響分析
[0194] (1)向每個(gè)酶標(biāo)孔中加入2.5yg PS(氯仿為溶劑），置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)溶劑。
[0195] (2)每孔中加 100yL的5%脫脂奶粉(TBS配制），37°C封閉2h，washing buffer洗滌3 次。
[0196] (3)用binding buffer稀釋EA為不同濃度，每孔加50yL蛋白稀釋液，37°C孵育2h， washing buffer洗滌3次。
[0197] (4)制備50%血漿(？83為溶劑），每孔加入10(^1^，37°(：孵育31^11。每孔加入2541^ 0.08M CaCl2(Ca2+終濃度為16mM)，即時(shí)血漿開(kāi)始凝固，設(shè)定波長(zhǎng)為405nm，平均每5min檢測(cè) 各孔吸光度。
[0198] 本實(shí)驗(yàn)用1:9枸櫞酸鈉抗凝血漿。向去Ca2+的抗凝血漿中重新加入Ca2+(CaCl 2溶 液），血液發(fā)生凝固。從加入Ca2+至血漿凝固這一過(guò)程經(jīng)歷的時(shí)間為血漿凝固時(shí)間，Ca 2+、磷 脂與活化的凝血因子VIII結(jié)合形成復(fù)合物，后者激活凝血因子X(jué)Xa2+、磷脂、凝血因子V存在 時(shí)，活化的凝血因子X(jué)與之共同作用，將凝血酶原激活轉(zhuǎn)化為凝血酶，凝血酶將纖維蛋白原 轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，達(dá)到血漿凝固的效果。
[0199] 結(jié)果如圖15所示，用酶標(biāo)儀檢測(cè)不同血漿樣品的濁度動(dòng)態(tài)變化。隨著EA濃度增加， 血漿凝固時(shí)間出現(xiàn)明顯的延長(zhǎng)，血漿在405nm吸光度在同時(shí)間點(diǎn)明顯降低，血漿濁度較低。 EA與PS結(jié)合，阻止PS參與血漿中的凝血因子X(jué)活化，從而達(dá)到延長(zhǎng)RT、減少纖維蛋白產(chǎn)量、降 低血漿濁度的效果。
[0200] 三、抗血小板聚集活性分析
[0201] EA蛋白是去整合素 Echistatin與AnnexinA5通過(guò)Linker連接的融合蛋白， Echistatin是含有R⑶序列的凝血抑制物，R⑶序列可識(shí)別并特異性結(jié)合血小板GPIIb/IIIa 受體，AnnexinA5能夠結(jié)合血小板活化后外翻的PS。
[0202] (1)準(zhǔn)備工作:將三種具有抗血小板聚集的蛋白（EA蛋白、R⑶序列、AnnexinA5)稀 釋成不同濃度;開(kāi)機(jī)機(jī)器自檢，進(jìn)入ADP聚集實(shí)驗(yàn)界面。
[0203] (2)用藍(lán)色1:9枸櫞酸鈉抗凝管收集人全血，搖勻后800rpm離心8min，黃色上清液 為富血小板血漿(PRP)，取出PRP，管中剩余液體3000rpm離心10min，上清液為貧血小板血漿 (PPP)〇
[0204] ⑶將300μ1的PPP加入測(cè)試杯中，放到測(cè)試通道中按"PPP"鍵調(diào)零。
[0205] (4)將300μ1的PRP加入測(cè)試杯中，加入測(cè)試棒，放置在左側(cè)預(yù)溫面板區(qū)域進(jìn)行預(yù) 溫。放入調(diào)零的同一通道，按下該通道的預(yù)溫鍵，界面顯示時(shí)間開(kāi)始從60s減少，至13-15S， 加入lOylADP(終濃度為10μΜ)同時(shí)按下綠色按鈕，開(kāi)始測(cè)試，3min出現(xiàn)空白組血漿的最大聚 集率。
[0206] (5)以同種方法測(cè)試給藥組血漿，將300ylPRP與30μ1的蛋白樣品在EP管混勻，取 300μ1給藥組血衆(zhòng)加入到測(cè)試杯，步驟同上。蛋白樣品有四種不同濃度的EA、AnneixnA5、RGD 多肽(序列為GCGRGDWPCA，M=1019.20Da)。
[0207] (6)蛋白對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率公式為：
[0209]結(jié)果如圖16所示，圖中可見(jiàn)，隨著三種蛋白藥物濃度增加，ADP誘導(dǎo)血小板聚集的 抑制率增強(qiáng)；EA效果最好，EA的IC50 = 4ymol/L，在ΙΟμ mol/L時(shí)抑制率高達(dá)90%，呈現(xiàn)出 AnnexinA5、RGD序列、去整合素在抑制血小板聚集的協(xié)同效應(yīng)。
[0210]四、凝血四項(xiàng)的測(cè)定
[0211 ]用藍(lán)色1:9枸橡酸鈉抗凝管收集人全血，搖勾，3000rpm離心10min，取上層貧血小 板血漿(PPP)。在每個(gè)測(cè)定杯子中加入300yL的PPP和30yL的蛋白樣品（PBS為對(duì)照）混勻，37 °C孵育1 Omin，全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定結(jié)果。
[0212] 結(jié)果如下表5所示，
[0213] 表5. EA對(duì)血漿凝血四項(xiàng)的作用
[0215] 在凝血四項(xiàng)檢測(cè)中EA隨著蛋白濃度的增高能夠明顯延長(zhǎng)APTT，超過(guò)正常參考值， 而PT變化幅度不大，F(xiàn)IB、TT值沒(méi)有臨床意義的改變。APTT是評(píng)價(jià)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，如凝 血因子X(jué)II、XI、IX、X，以上凝血因子的減少會(huì)引起APTT的延長(zhǎng)。推測(cè)EA能夠結(jié)合Ca 2+、磷脂， 使X因子不能充分活化，影響內(nèi)源凝血途徑，進(jìn)而會(huì)影響共同凝血途徑。
[0216] 五、EA對(duì)GPIIb/IIIa受體親和性分析
[0217] (1)用枸橡酸鈉抗凝管收集人全血lml混勾，取血4h內(nèi)以室溫條件800rpm離心 8min，上清液為富血小板血漿(PRP)。
[0218] (2)按照以下表6依次加樣：
[0219]表6
[0221 ]將管中液體輕輕混勻，終體積為50μ1，室溫下孵育lOmin。其中用來(lái)激活血小板的 ADP終濃度為2ymol/L。
[0222] RGD序列為GCGRGDWPCA，分子量為1019.20Da，含有與GPIIb/IIIa受體特異性識(shí)別 結(jié)合的RGD序列。
[0223] (3)固定:在各管中加入450μ1的4%多聚甲醛，室溫固定45min。
[0224] (4)熒光抗體標(biāo)記:在各管分別加入5μ1 FITC標(biāo)記的羊抗人纖維蛋白原抗體，在37 °C 孵育 30min。
[0225] (5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0226] 本實(shí)驗(yàn)中FITC標(biāo)記的纖維蛋白原可結(jié)合GPIIb/IIIa受體，使血小板標(biāo)記上FITC熒 光。EA含R⑶序列，R⑶可與纖維蛋白原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GPIIb/II la受體，理論上來(lái)說(shuō)，EA蛋白濃度 越高，R⑶序列含量越高，結(jié)合GPIIb/IIIa受體能力越強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到血小板的熒光 強(qiáng)度減弱會(huì)越明顯。
[0227] 結(jié)果如圖 17所示，1-5.加入PBS，10yMRGD多肽，20μΜ ΕΑ，10μΜ ΕΑ，5μΜ EA選定血小 板與熒光信號(hào)圖；6.1-5熒光強(qiáng)度疊加圖；7.1-5熒光強(qiáng)度值;血小板被2ymol/L的ADP激活， GPIIb/IIIa受體能夠結(jié)合纖維蛋白原，在血小板粘附、聚集過(guò)程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，ΙΟμΜ R⑶肽（陽(yáng)性對(duì)照）和EA蛋白在一定程度上能夠減弱血小板的平均熒光強(qiáng)度；隨 著蛋白濃度增高，平均熒光強(qiáng)度有減弱趨勢(shì)。ΕΑ融合蛋白中RGD序列沒(méi)有被蛋白分子結(jié)構(gòu)所 遮擋，可以被相關(guān)受體特異識(shí)別結(jié)合。
[0228] 六、ΕΑ在小鼠體內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
[0229] 運(yùn)用小鼠尾部橫截模型評(píng)價(jià)體內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)。昆明小白鼠，雌性，24_26g，5周齡。腹 腔注射1%戊巴比妥鈉0.1ml進(jìn)行麻醉，眼球后靜脈叢注射給藥。
[0230] EA實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的EA溶液(溶質(zhì)為EA，溶劑為生理鹽水），劑量分別為0.01 μ mol/kg、0·039ymol/kg、0·187ymol/kg;
[0231] 陰性對(duì)照組為同體積的生理鹽水；
[0232] 陽(yáng)性對(duì)照組為肝素鈉溶液(Heparin)，劑量為200U/kg;
[0233] 單獨(dú)A5組為不同濃度的AnnexinA5溶液(溶質(zhì)為EA，溶劑為生理鹽水），劑量分別為 0·038ymol/kg、0·085ymol/kg、0·2ymol/kg。
[0234] 注射給藥20min后，距尾端6mm處橫截，立即將出血尾部放置入37 °C生理鹽水中浸 泡觀察出血狀況，記錄出血至停止出血的時(shí)間。
[0235] 將EA設(shè)置為不同濃度，采用鼠尾橫截模型記錄小鼠體內(nèi)出血時(shí)間，進(jìn)而評(píng)估不同 濃度蛋白的出血風(fēng)險(xiǎn)。
[0236] 結(jié)果如圖18所示，*是與生理鹽水組對(duì)比差異顯著(P〈0.05)，#是與肝素組對(duì)比差 異顯著(P〈0.05)。實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組對(duì)比，EA實(shí)驗(yàn)組出血時(shí)間差異顯著；當(dāng)給藥濃度增 大3.9倍，出血時(shí)間長(zhǎng)于肝素組(20(^111〇1/1^)，且差異顯著。
[0237] 單獨(dú)A5組0.038ymol/kg劑量的出血時(shí)間為193s、0.085ymol/kg劑量的出血時(shí)間為 289s、0.2ymol/kg劑量的出血時(shí)間為1142s。
[0238] 相比較單獨(dú)的Annexin A5，EA的體內(nèi)出血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表明EA的體內(nèi)活性強(qiáng)于 單獨(dú)的Annexin A5。
[0239]當(dāng)提高EA濃度，隨著蛋白濃度的增高，出血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，出血風(fēng)險(xiǎn)增加。為保證 體內(nèi)用藥的安全低風(fēng)險(xiǎn)性，建議低濃度用藥。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C 端通過(guò)連接肽與AnnexinA5蛋白的N端連接得到。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于:所述連接肽為4個(gè)甘氨酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白為如下1)或2): 1) 序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； 2) 將1)所示蛋白的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。5. 編碼權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白的DNA分子。6. 如權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下1)_3)中任一種的DNA 分子： 1) 編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子； 3) 與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99% 同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。7. 含有權(quán)利要求5或6所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。8. 權(quán)利要求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要 求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在抗血栓中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要 求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在抗血小板聚集中的應(yīng)用;或，權(quán)利要 求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要求7所述的重組 載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在抗凝血中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要 求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備抗血栓產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要 求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備抗血小板聚集產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或，權(quán)利要求權(quán)利要求1-4中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要 求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備抗凝血產(chǎn)品中的應(yīng)用。9. 一種具有如下1)_3)中至少一種功能的產(chǎn)品，包括權(quán)利要求權(quán)利要求1 -4中任一所述 融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述DNA分子或權(quán)利要求7所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌； 1) 抗血栓； 2) 抗血小板聚集； 3) 抗凝血。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用或權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥 物。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK105949326SQ201610542954
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】井健
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué)