一種新型融合蛋白nscr5及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物高分子研宄領(lǐng)域，主要是涉及一種新型融合蛋白NSCR5及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多肽類(或蛋白類)是性能優(yōu)越的新型載體材料，在藥物靶向運(yùn)輸，尤其是抗腫瘤藥物的靶向運(yùn)輸和定點(diǎn)釋放方面取得良好的研宄結(jié)果。由于多肽分子鏈較短，單分子藥物負(fù)載能力較弱，已有多肽載藥均通過(guò)多肽的多級(jí)組裝形成較大的藥物負(fù)載復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)較多肽具有更長(zhǎng)的分子鏈，單分子藥物負(fù)載能力高于多肽，且具有更加豐富多變的組裝形式，其材料學(xué)性能更為優(yōu)越。但長(zhǎng)肽和蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)化學(xué)方法獲得，因此在獲取方法限制的情況下，長(zhǎng)肽和蛋白質(zhì)相關(guān)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研宄報(bào)道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明新型融合蛋白NSCR5由蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果蠅彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉積肽(R5)等4個(gè)主要功能肽段構(gòu)成，各單一肽段的功能均已為研宄所證實(shí)，但將蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果蠅彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉積肽(R5)等4個(gè)肽段順次連接融合形成4嵌段線型蛋白的研宄尚未見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)制備方法亦未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明融合蛋白NSCR5為人為將4個(gè)天然肽段融合形成的非天然4嵌段線型蛋白質(zhì)。該人工4嵌段線型蛋白質(zhì)具有多種優(yōu)良性能，包括優(yōu)異的機(jī)械性能(高彈性)、自組裝形成規(guī)則宏觀結(jié)構(gòu)的性能(自組裝性能)以及沉積Si02介導(dǎo)有機(jī)-無(wú)機(jī)材料復(fù)合的性能(硅沉積性能)。這些性能賦予該融合蛋白優(yōu)良的藥物負(fù)載緩釋性能、易加工性以及優(yōu)良的產(chǎn)品穩(wěn)定性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]本發(fā)明的目的是發(fā)明一種性能優(yōu)異的生物醫(yī)用高分子，具體為新型融合蛋白NSCR5。本發(fā)明的主要發(fā)明創(chuàng)新內(nèi)容為:
[0005](I)本發(fā)明融合蛋白NSCR5為人工設(shè)計(jì)制備的跨物種融合蛋白，不存在天然對(duì)應(yīng)體或類似物。融合蛋白NSCR5的氨基酸序列(SEQ NO: 3)經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTp比對(duì)分析，表明NSCR5中存在3段分別與蜘蛛絲蛋白和果蠅彈性蛋白高度相似的區(qū)域，最高覆蓋率72%時(shí)，相似度為77% ;綜合最高相似度為:覆蓋率為56%時(shí)，相似度95%，未發(fā)現(xiàn)覆蓋率超過(guò)72%的高度相似蛋白。此外，由于蜘蛛和果蠅間存在自然條件下不可能逾越的生殖隔離，因此沒(méi)有理論依據(jù)支持可能存在天然的本發(fā)明所述融合蛋白NSCR5。
[0006](2)本發(fā)明制備融合蛋白NSCR5所用基因序列非天然基因序列，是經(jīng)過(guò)密碼子改造并由人工合成的全新基因序列。由于編碼融合蛋白NSCR5的4個(gè)天然肽段的基因序列存在大量大腸桿菌稀有密碼子，且編碼的肽鏈具有較高的甘氨酸比例，不適合直接在大腸桿菌中表達(dá)。因此，本發(fā)明對(duì)編碼融合蛋白NSCR5的基因密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，移除了所有稀有密碼子，并對(duì)甘氨酸密碼子進(jìn)行了均衡分配，最后通過(guò)全基因合成法獲得新型人造融合蛋白NSCR5的基因(圖2，SEQ NO:2)。融合蛋白NSCR5基因序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTn比對(duì)分析，表明果蠅彈性蛋白肽段最高基因相似度為89%，覆蓋率為53%;蜘蛛絲蛋白肽段最高基因相似度為74%，覆蓋率為40 %，未發(fā)現(xiàn)覆蓋率超過(guò)53 %的高度相似基因。同樣由于生殖隔離的存在，沒(méi)有理論依據(jù)支持可能存在天然的本發(fā)明所述融合蛋白NSCR5基因。本發(fā)明共計(jì)對(duì)編碼NSCR5的1809個(gè)堿基中的307個(gè)造成低豐度密碼子的位點(diǎn)進(jìn)行了改動(dòng)，將編碼精氨酸的稀有密碼子全部改為非稀有密碼子，將編碼甘氨酸的高頻率重復(fù)密碼子替換為高豐度低重復(fù)度密碼子，將豐度較低的絲氨酸的密碼子做了均勻分布處理，改動(dòng)前后全序列相似度為83.03% (改造前后序列差異和密碼子豐度差異見(jiàn)附圖4A和4B)。改動(dòng)后的基因序列(圖2)直接插入質(zhì)粒載體(圖6)并在大腸桿菌DH5 α細(xì)胞內(nèi)合成NSCR5過(guò)程中，精氨酸、甘氨酸和絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)壓力大幅下降，轉(zhuǎn)運(yùn)上述3中氨基酸能力大幅提高，NSCR5獲得高效合成。
[0007](3)本發(fā)明融合蛋白NSCR5同時(shí)具有pH響應(yīng)自組裝性能、高彈性能和硅沉積強(qiáng)度增強(qiáng)性能。上述性能的集成，使得本發(fā)明融合蛋白NSCR5在醫(yī)用縫合、敷附、支架和載藥等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，且目前尚未見(jiàn)到同時(shí)具備上述性能的蛋白質(zhì)材料。
[0008](4)在融合蛋白NSCR5基因上游設(shè)計(jì)了 Lac基因表達(dá)原件，使其能夠在大腸桿菌DH5a菌株中受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。并最終通過(guò)細(xì)胞破碎和鎳離子柱親和層析分離獲得本發(fā)明融合蛋白。其中，所述的大腸桿菌，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，保藏號(hào)為GMl.571 ;質(zhì)粒PUC57為公用質(zhì)粒，由南京金斯瑞生物科技公司免費(fèi)提供。
[0009]一方面，本發(fā)明提供一種一種新型融合蛋白NSCR5，其特征在于:該蛋白的序列為SEQ NO:3 所示。
[0010]優(yōu)選的，其中，該蛋白由6聚組氨酸標(biāo)簽前側(cè)序列、6聚組氨酸標(biāo)簽(6X His)、蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果幡彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和娃藻娃沉積肽(R5)等6段順次連接構(gòu)成，長(zhǎng)度為602個(gè)氨基酸殘基。
[0011]優(yōu)選的，編碼融合蛋白NSCR5的基因序列為SEQ NO:2所示。
[0012]優(yōu)選的，編碼融合蛋白NSCR5基因序列的上游還包括表達(dá)元件:Lac啟動(dòng)子、Lac操縱子和Lac核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)(圖7)。
[0013]優(yōu)選的，融合蛋白NSCR5的表達(dá)載體為TOC57，插入位點(diǎn)為EcoR V限制性酶切位點(diǎn)，表達(dá)宿主菌為大腸桿菌DH5 α菌株(圖5)。
[0014]優(yōu)選的，融合蛋白NSCR5全基因長(zhǎng)度為1809bp，其中6聚組氨酸標(biāo)簽His)前側(cè)為包括起始密碼子在內(nèi)的12bp，6聚組氨酸標(biāo)簽His)密碼子長(zhǎng)度為24bp，蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)密碼子長(zhǎng)度為381bp，果蠅彈性蛋白(Resilin)密碼子長(zhǎng)度為1014bp，蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)密碼子長(zhǎng)度為372bp，硅藻硅沉積肽(R5)密碼子長(zhǎng)度為57bp。
[0015]優(yōu)選的，融合蛋白NSCR5基因上游序列長(zhǎng)度為196bp，其中Lac啟動(dòng)子34bp，Lac操縱子25bp，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS) 8bp?
[0016]優(yōu)選的，位于PUC57上EcoR V位點(diǎn)的人工合成序列長(zhǎng)度為2005bp。
[0017]另一方面，本發(fā)明涉及上述融合蛋白NSCR5的制備方法，包括以下步驟:
[0018]第一步，融合蛋白NSCR5表達(dá)載體構(gòu)建JfSEQ NO:2所示的基因序列接插入到PUC57載體上EcoR V位點(diǎn)，獲得NSCR5表達(dá)載體；
[0019]第二步，將融合蛋白NSCR5表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，獲得NSCR5表達(dá)菌株;
[0020]第三步，融合蛋白NSCR5的自誘導(dǎo)表達(dá):將NSCR5表達(dá)菌株接種到自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中，于一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，獲得產(chǎn)物發(fā)酵液；
[0021]其中，自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基配方為:酵母抽提物1.0?5.0g/L，胰蛋白胨5.0?10.0g/L，酪蛋白胨5.0?15.0g/L，葡萄糖0.1?1.5g/L，磷酸氫二鉀4.0?10.0g/L，磷酸二氫鉀3.5?9.0g/L,磷酸銨2.0?6.0g/L,硫酸鎂0.2?1.6g/L，氯化鈣2.0?5.0mg/L，氯化鈷0.5?3.5mg/L，氯化銅0.5?1.5mg/L，硫酸錳1.2?5.0mg/L，鉬酸鈉3.2?8.0mg/L，硼酸 0.1 ?0.5mg/L，氯化鐵 1.0 ?8.0mg/L，氯化鋅 0.5 ?3.0mg/L，甘油 1.0 ?10.0g/L,絲氨酸0.5?2.0g/L,甘氨酸2.0?10.0g/L,酪氨酸0.1?1.0g/L,異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG) 20.0?300.0mg/L ;發(fā)酵溫度為16?40 °C ;發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為12?24h ；
[0022]第四步，融合蛋白NSCR5的分離純化:將第三步獲得的產(chǎn)物發(fā)酵液離心收集菌體，并重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，超聲破碎，然后再次離心收集上清液，最后將上清液過(guò)鎳離子柱并以梯度濃度咪唑洗脫，收集融合蛋白NSCR5洗出液，經(jīng)透析和冷凍干燥獲得本發(fā)明目標(biāo)融合蛋白NSCR5。
[0023]本發(fā)明所有的百分比含量，沒(méi)有特備指明，都屬于質(zhì)量百分比含量。
[0024]有益效果
[0025]本發(fā)明新型融合蛋白集成了蜘蛛絲蛋白的自組裝性能、果蠅彈性蛋白高彈性能和硅藻R5肽的硅沉積性能，綜合性能優(yōu)異，且長(zhǎng)度均一，可完全生物降解，微生物法制備產(chǎn)量高、不存在化工污染。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1編碼NSCR5蛋白的原始基因序列
[0027]圖2為經(jīng)過(guò)優(yōu)化改良過(guò)的編碼NSCR5蛋白的基因序列。
[0028]圖3為圖3為融合蛋白NSCR5基因密碼子優(yōu)化前后序列差異對(duì)比。