專利名稱：：前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于臨床血液免疫檢測
技術領域：
，具體地，本發(fā)明提供了一種前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。該試劑盒檢測的靈敏度高，特異性強。
背景技術：
：前列腺癌在歐美國家因腫瘤而死亡的男性中，僅次于肺癌，排第二位。在我國隨著衛(wèi)生檢驗的發(fā)展，前列腺癌普查也提上日程。前列腺酸性磷酸酶是男性血清酸性磷酸酶的主要來源，是只由前列腺上皮細胞溶酶體產(chǎn)生的一種同工酶，是一種糖蛋白，由兩個亞基構成，相對分子量約為100000，主要分布在精液和尿中,血清中含量較低，具有組織特異性，一度被認為是前列腺癌特異性最敏感的腫瘤標志物，廣泛用于前列腺癌診斷和治療監(jiān)控。近來的研究表明，它并不是絕對的組織特異性標志物。在臨床上，前列腺炎在惡性和良性病變之間重疊較大，不宜單獨作為前列腺癌早期診斷的有效篩選指標。用以聯(lián)檢，結(jié)合前列腺特異抗原密度測量、直腸指診和直腸超等手段，能明顯提高前列腺癌篩査的靈敏度。因此該診斷試劑盒對前列腺癌的診斷、治療監(jiān)測和預后判斷仍然具有一定臨床意義近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發(fā)展迅速，己廣泛應用于生物醫(yī)學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，廣泛應用于PAP的定量分析的方法主要是放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用1251等放射性元素標記，檢測設備復雜昂貴，必須用專門的儀器測定，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，測定結(jié)果不穩(wěn)定，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析方法(CLIA)應運而生。化學發(fā)光分析超微量物質(zhì)，尤其是臨床分析微量的活性物質(zhì)始于20世紀70年代，隨后在臨床上的應用進入一個飛速發(fā)展的時期?；瘜W發(fā)光免疫分析方法(CLIA)靈敏度高，可以達到10—18mol/L;快速，發(fā)光信號在幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生；操作簡便，測試過程中不使用有害試劑。本發(fā)明是在酶聯(lián)免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，其靈敏度得到大大提高。本發(fā)明所述方法操作簡便，適用性廣，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易在臨床診斷和科研工作推廣應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒以及該試劑盒的制備方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下方案根據(jù)本發(fā)明的前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒包括前列腺酸性磷酸酶校準品；前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被的固相載體；酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；上述酶所作用的化學發(fā)光底物；以及洗滌液。前列腺酸性磷酸酶系列校準品以小牛血清為基質(zhì)，加入前列腺酸性磷酸酶純品配制而成，前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體，溶于碳酸鹽緩沖液中，然后包被在固相抗體上，另一株前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體和酶偶聯(lián)形成酶標記抗體。固相載體可以為微孔板、塑料珠或塑料管。標記抗體所用標記酶可以為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。其中堿性磷酸酶標記采用改良的戊二醛交聯(lián)法，辣根過氧化物酶標記采用高碘酸鈉氧化法，所得酶標記抗體工作濃度為1:2000-10000。根據(jù)本發(fā)明的前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒制備方法，包括以下步驟配制前列腺酸性磷酸酶校準品；以前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被固相載體；以酶標記前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；上述前列腺酸性磷酸酶校準品、酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物的分裝；以及組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述校準品配制過程包括以下步驟1)基質(zhì)溶液基質(zhì)溶液采用100%小牛血清滅活、離心、過濾，加0.1%Proclin300。2)校準品配制以及濃度校正前列腺酸性磷酸酶純品，加入校準品基質(zhì)溶液，配制一中間濃度校準品濃溶液，然后采用逐點稀釋的方法，配制成O，2，5，10，25，60ng/mL的系列校準品，校準品用國家標準校正。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述包被固相載體的過程包括以下步驟1)包被采用0.05mol/L，pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的前列腺酸性磷酸酶單抗混合制成包被液，并將其負載于固相載體上，固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。2)用生理鹽水洗滌上述固相載體3)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P042H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA和lmLProdin300，所述封閉液的pH值為7.07.4，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。4)干燥去除固相抗體表面的封閉溶液，放置在干燥間自然干燥。5)保存在鋁箔袋中放入干燥劑，密封保存。根據(jù)本發(fā)明方法，所述酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體可采用以下兩種方法I)改良的戊二醛交聯(lián)法標記堿性磷酸酶(ALP)和II)高碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)。所述酶用酶稀釋液稀釋成工作酶溶液，酶標記抗體稀釋比例為l:2000-1:10000。根據(jù)本發(fā)明方法，所述前列腺酸性磷酸酶校準品、酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體和該酶所作用的化學發(fā)光底物的分裝包括(以96孔微孔板固相抗體為例)1)校準品分裝校準后的校準品，用3mL透明玻璃瓶，0.5ml/瓶分裝，貼上標簽，冷凍或者2~8°C保存。2)固相抗體分裝將包被有前列腺酸性磷酸酶單抗的固相放置在板架上，用鋁箔袋，放入干燥劑，密封，貼上標簽，2~8°C保存。3)酶標記抗體工作溶液分裝將濃的酶標記抗體，用酶稀釋液稀釋到工作濃度，用15mL白色塑料瓶按照需要分裝，貼上標簽，2~8°C保存。4)發(fā)光底物分裝根據(jù)不同酶標記物所用酶對應的化學發(fā)光底物，按照需要分裝，貼上標簽，2~8°C保存。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述成品組裝的成品包括前列腺酸性磷酸酶校準品一套，固相抗體一包，酶標記抗體工作溶液一瓶，標記酶對應底物一套，試劑盒使用說明書一張以及其它附件組裝而成。本發(fā)明針對臨床檢驗實驗室提供了一種既可手工操作，又可適用與某些全自動檢測儀器的檢測手段，建立了人血清前列腺酸性磷酸酶的定量檢測方法。本發(fā)明"前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以非常專一地檢測出前列腺癌病人體內(nèi)的前列腺酸性磷酸酶含量，可以根據(jù)前列腺酸性磷酸酶含量的多少判斷治療效果及其病情的變化。它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。該前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的各項指標均達到同類進口試劑盒的分析水平。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標記的抗體與載體上包被的抗體和被測樣品的前列腺酸性磷酸酶形成"包被抗體-抗原-抗體-酶"的夾心復合物結(jié)構，因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心一步法"反應模式，既有效地利用了化學發(fā)光技術原理，又確保了檢測的靈敏度。本發(fā)明所述檢測方法，靈敏度高，檢測范圍寬，操作簡便，無放射性污染；同時試劑盒使用成本低，降低了檢驗費用，更易于前列腺癌臨床篩查的推廣應用。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒一、酶標前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體的制備1、改良的戊二醛交聯(lián)法標記堿性磷酸酶(ALP)1)取ALP0.50mg和單克隆抗體l.Omg，分別溶于生理鹽水中，混合，最終體積控制在0.50ml;2)加入0.50ml1%的戊二醛，室溫磁力攪拌15min后，避光反應4h;3)加入1.0mol/L的乙醇胺0.10ml，室溫溫育2h;4)4'C條件下用PBS加磁力攪拌過夜透析，更換透析液兩次；5)將透析產(chǎn)物移入試劑瓶加入等體積甘油，混勻，加入P/。BSA，密閉冷凍保存?zhèn)溆谩?、高碘酸鈉氧化法標記辣根過氧化物酶(HRP)(1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP5mg，加雙蒸水250^1溶解；b)稱取Nal045mg，加雙蒸水250nl溶解，配制成20mg/ml的濃度；c)往冊P溶液中逐滴加入NaI(V溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4'C，靜置30min;e)取5ml乙二醇溶于25nl雙蒸水中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30min;g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/ml。(2)抗體的準備與標記(避光)a)調(diào)整抗體濃度到約5mg/ml，用0.05mol/LC.B透析去除甘油等雜質(zhì)，4°C過夜透析，期間換透析液3次；b)將抗體與HRP按l:5混合，于0.05mol/LC.B中透析6小時，依次換透析液；c)用新配制的Na朋4溶液終止反應，搖勻，4。C靜置2小時，每30min搖一次，Na朋,溶液加入量要適中；d)用0.02mol/LPBS緩沖液過夜磁力攪拌透析，期間換一次透析液。(3)HRP酶標記抗體純化a)完成標記的抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3;b)4'C靜置一小時，8000rpm離心10min，將上清液移至新管，沉淀用等體積PBS重新懸??；c)重復上述操作3次，收集分離的各個組分，提純的服P-抗體用PBS過夜透析；d)加入等體積甘油，-20'C保存?zhèn)溆?。二、酶標抗體工作溶液配制(1)酶標單抗稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlml雙蒸水1000ml(2)酶標記抗體工作溶液濃度選定試驗證明，采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度范圍為1:200010000。(3)酶標記抗體工作溶液制備用所述(1)稀釋液，按照(2)所述稀釋比例，將濃酶標記抗體稀釋成工作溶液。三、前列腺酸性磷酸酶校準品的制備以小牛血清為基質(zhì)，將提純的人精液漿濃原料以國家標準品為準系列稀釋而成。小牛血清使用前需要56。C滅活30分鐘，加入0.l%Proclin300。分裝濃度范圍為0、2、5、10、25、60ng/ml的校準品共6瓶。四、以前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被固相載體(1)包被釆用0.05mol/LpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的前列腺酸性磷酸酶單抗混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；具體地，所述包被方法可以包括可采用1000mL的0.05mol/LpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液包含1.59g的無水碳酸鈉和2.94g的碳酸氫鈉去離子水溶液，與適當濃度的前列腺酸性磷酸酶單抗混合制成包被液并將其負載于固相載體上;具體地，無水碳酸鈉1.59g碳酸氫鈉2.94g去離子水1000ml溶解混勻后，調(diào)整pH至9.6，加入適量前列腺酸性磷酸酶單抗混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110nL，4'C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉將稱量好的NaH2P042H200.2g，Na2HP0412H202.9g，BSA10g放入潔凈容器中，加雙蒸水定容至1000ml，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時后，真空封袋。貼簽后置28'C保存。五、化學發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(服P)的化學發(fā)光底物液的配制方法所述化學發(fā)光底物A液，包括1O國ol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯(lián)苯、0.05mmol/L4-碘苯硼酸、0.2mol/LpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.010.0;所述化學發(fā)光底物B液，包括3.5mraol/L過氧化脲、0.1%Tween20、0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.07.6。使用方法使用前將A液與B液按1:l比例混合后使用。本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學發(fā)光底物液的配制方法在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.lmol/LpH8.5的Tris-HCl緩沖液。在1000mL此緩沖液中加入NaCl160g，KC14g，AMPPD200ral，加0.1%的Proclin300，混合均勻，分裝后直接使用。六、20倍洗滌液Na2HP0412H2058gNaH2P042H202gNaCl160gTween-20lmlProclin300lml去離子水1000ml調(diào)整pH至7.27.4。七、半成品及成品組成上述步驟所得半成品各組分，以及產(chǎn)品說明書等附件組裝成PAP化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。-本發(fā)明試劑盒中的固相抗體為提前包被好的，不需要現(xiàn)場包被；校準品為液體；標記抗體也是已經(jīng)稀釋到工作濃度的工作溶液，均可以直接使用。利用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測。實施例2~3制備本發(fā)明的前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以分別以塑料珠、塑料管作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備PAP化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出固相抗體、校準品/檢測樣品、標記抗體溶液在室溫放置1530分鐘，使它們平衡到室溫；之后，準備好合適的微量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀以及輔助儀器，如洗板機等，是否正常工作。使用本試劑盒按照實施例1的方法進行實驗的具體操作步驟如下1)將實驗需要的板條(已包被好抗體，96/48孔可拆為12/6*8*1L)放置在板架上；2)反應孔中分別加待測樣品和各濃度校準品，校準品每孔加O、2、5、10、25、60ng/ml各25nl，每次試驗設空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶標記抗體溶液100nl;3)微量振蕩器上振蕩30秒混勻；4)室溫(18-26。C)溫育60分鐘；5)棄去孔中溶液，用PBST洗滌液，自動洗板機或者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；6)每孔加發(fā)光底物100nl，振蕩混勻，室溫(2228°C)反應3090分鐘(ALP體系)/5-30分鐘(HRP體系)；7)用化學發(fā)光儀測相對發(fā)光值(RLU)，測量時間0.1-1秒/孔；8)分別對校準品濃度和對應RLU取對數(shù)，在建立的雙對數(shù)曲線上建立標準曲線(見附圖1)，以各待測血清RLU值在標準曲線上査出該血清的PAP的濃度，計算檢測結(jié)果；9)打印檢測結(jié)果報告。實施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學鑒定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行鑒定，經(jīng)過大量的實驗證明，本發(fā)明的試劑盒在用于PAP濃度水平測定時，該方法學指標如下檢測范圍060ng/ml;靈敏度最小檢出限為0.05ng/ml;精密度分析內(nèi)精密度(高、低兩個質(zhì)量控制范圍)均小于7%(n=10)，分析間精密度(高、低兩個質(zhì)量控制范圍)均小于10%(n=10);準確性加標回收率在90110%之間；特異性和PSA、CEA、AFP等常見腫瘤標志物的交叉反應率小于O.1%。本發(fā)明的試劑盒所用樣品量少，一次檢測只要25^1，體外檢測對測試對象沒有任何毒副作用。同時本發(fā)明采用的化學發(fā)光免疫分析方法，不產(chǎn)生放射性污染，各指標也優(yōu)于目前廣泛應用的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測實驗室。因此本發(fā)明為臨床檢測前列腺酸性磷酸酶(PAP)，輔助診斷前列腺癌以及手術后觀察提供了一種更準確，特異，方便，快捷的方法。實施例7本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對本發(fā)明的試劑和國外權威試劑對1053份臨床血清樣品檢測結(jié)果總符合率達99.1%，數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從所列出兩種試劑檢測結(jié)果數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑檢測結(jié)果陰性中有7份陽性和2份陰性和國外權威試劑檢測結(jié)果不符，這一差異可能由于試劑采用的抗原/抗體材料不同，及抗原/抗體的結(jié)合位點不同而引起的，本發(fā)明試劑盒的靈敏度、特異性、準確性與同類進口試劑盒無明顯差異；便于推廣應用，安全可靠。權利要求1.一種前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括前列腺酸性磷酸酶校準品；前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被的固相載體；酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；上述酶所作用的化學發(fā)光底物；以及洗滌液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。4、一種制備權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟:前列腺酸性磷酸酶校準品的配制；在固相載體上包被前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；在前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體上標記酶；濃縮洗滌液的配制；上述各半成品組分的分裝以及組裝為成品。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體包括以下步驟I)包被可采用0.05mol/LpH值為9.6的碳酸鹽緩沖液與適當濃度的前列腺酸性磷酸酶單抗混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；II)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及III)封閉配制封閉液，基于lOOOmL所述封閉液包含0.2gNaH2P042H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA和lmLProclin300，所述封閉液的pH值為7.07.4，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。6、如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。7、如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙垸類衍生物、魯米諾或異魯米諾。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。9、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述魯米諾或異魯米諾為A液和B液組成。10、如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物A液，包括10mmol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯(lián)苯、0.05mmol/L4-碘苯硼酸、0.2mol/LpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.010.0;所述化學發(fā)光底物B液，包括3.5mmol/L過氧化脲、0.1%Tween20、0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.07.6。全文摘要本發(fā)明提供了一種前列腺酸性磷酸酶化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，屬于臨床血液檢測分析
技術領域：
。本發(fā)明的試劑盒包括1)前列腺酸性磷酸酶校準品；2)前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被的固相載體；3)酶標記的前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；4)上述酶作用的化學發(fā)光底物；5)洗滌液。進一步，本發(fā)明還提供了上述試劑盒的制備方法，具體包括以下步驟配制校準品；以前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體包被固相載體；以酶標記前列腺酸性磷酸酶單克隆抗體；分裝上述校準品、酶標記抗體和化學發(fā)光底物；以及組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，特異性強，安全可靠。文檔編號G01N21/76GK101368962SQ200810103269公開日2009年2月18日申請日期2008年4月2日優(yōu)先權日2008年4月2日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,應希堂,根石,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司