一種沙丁胺醇半抗原與抗原及其專用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇半抗原與抗原及其專用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，用于檢測(cè) 動(dòng)物組織和尿液中的沙丁胺醇?xì)埩袅?，屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙丁胺醇（SAL)為選擇性β2受體激動(dòng)劑，臨床醫(yī)學(xué)上主要用于治療喘息型支氣 管炎、支氣管哮喘、肺氣腫所致的支氣管痙攣。同時(shí)，沙丁胺醇還有促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)，減 少脂肪蓄積、提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用，常被不法商家用作飼料添加劑。人食用了含沙丁胺醇 殘留的動(dòng)物性食品，會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、過(guò)敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀。 現(xiàn)在歐美各國(guó)均禁止其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用，美國(guó)規(guī)定只能把它用于科研，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235 公告也明確規(guī)定沙丁胺醇及其鹽、酯為禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出。
[0003]目前檢測(cè)沙丁胺醇的方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS)等，但這些方法都不同程度地存在著樣品前處理繁瑣， 對(duì)儀器設(shè)備以及操作過(guò)程的要求較高等缺點(diǎn)，不適于生產(chǎn)、基層單位及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種沙丁胺醇半抗原與抗原及其專用化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒。
[0005] 本發(fā)明提供的半抗原，為式（I)所示的化合物；
[0006]
[0007] 式（I)所示的化合物具體可為按如下方法制備得到的化合物：（1)取478mg沙 丁胺醇溶于15mL乙醇，加入434mg碳酸鉀，200mg環(huán)氧氯丙烷，混合均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h; ⑵制備薄層色譜純化混合物，展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇，體積比5:1，Rf值0.6處為產(chǎn)物 點(diǎn)；（3)將產(chǎn)物點(diǎn)處硅膠刮下，用甲醇提取2次（每次可采用25mL甲醇），過(guò)濾并收集濾液， 將濾液進(jìn)行真空干燥，得到的干物質(zhì)即為式（I)所示的化合物。
[0008]本發(fā)明還保護(hù)式（I)所示的化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物（該偶聯(lián)物為免疫原或 包被原）。所述載體蛋白具體可為BSA或0VA。
[0009] 本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)沙丁胺醇的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括包被有所述偶聯(lián) 物的化學(xué)發(fā)光微孔板（偶聯(lián)物作為包被原），沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品工作液，濃縮酶結(jié)合物，濃縮 樣品稀釋液，濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光液。
[0010] 所述試劑盒還可包括以所述偶聯(lián)物為免疫原得到的抗體。所述抗體具體可為兔源 多克隆抗體。 toon] 所述"包被有所述偶聯(lián)物的化學(xué)發(fā)光微孔板"的制備方法具體如下：（1)取所述 偶聯(lián)物，用包被緩沖液稀釋（包被緩沖液具體可為pH9. 6、0. 03M的碳酸鹽緩沖液），得到包 被原稀釋液（蛋白濃度具體可為20ng/mL);(2)將包被原稀釋液加入化學(xué)發(fā)光微孔板（具 體可100μL/孔），孵育（具體可40°C孵育16小時(shí)），洗滌，拍干；（3)完成步驟⑵后，進(jìn) 行封閉（每孔可加入100μL封閉液，室溫封閉2h;封閉液的具體配方：將10gBSA、0.lmL proclin300和1000mLpH7. 4、0. 01M的磷酸鹽緩沖液混合，得到封閉液），傾去孔內(nèi)的液 體，干燥。
[0012] 本發(fā)明提供的試劑盒操作簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高，各項(xiàng)性能優(yōu)良，非常適于推 廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
[0015] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0016] 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0017] 以下實(shí)施例中試劑盒的檢測(cè)原理如下：
[0018] 實(shí)施例1中的攪拌都是采用磁力攪拌器進(jìn)行的。二甲基甲酰胺（DMF) :sigma，型 號(hào)：D4551。沙丁胺醇：sigma，型號(hào)：S0100000。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，為分析純。
[0019] 沙丁胺醇的結(jié)構(gòu)式如下：
[0020]
[0021] 實(shí)施例1、免疫原和包被原的制備
[0022] -、半抗原的制備
[0023] 1、取478mg沙丁胺醇，溶于15mL乙醇中，分別加入434mg碳酸鉀和200mg環(huán)氧氯 丙烷，混合均勻，室溫下攪拌，反應(yīng)2h。
[0024] 2、制備薄層色譜，展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇，體積比5:1，取步驟1得到的溶液，低 于色譜板上。Rf值〇. 6處為產(chǎn)物點(diǎn)，將此處硅膠刮下，用甲醇提取2次（每次采用25mL甲 醇），合并有機(jī)相，過(guò)濾并收集濾液，將濾液進(jìn)行真空干燥，得到的干物質(zhì)即為半抗原。
[0025] 半抗原的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)式（I)。
[0026]
[0027] 二、免疫原的制備
[0028] 1、取6.6mg步驟一制備的半抗原，溶于2mLDMF。
[0029] 2、取50mgBSA，溶于5mL0· 1M碳酸鈉緩沖液。
[0030] 3、將步驟1得到的溶液逐滴加至步驟2得到的溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)，然 后裝入透析袋，在4°C條件下，在PBS緩沖液（pH7. 4、0. 01M)中進(jìn)行透析（3天，每天換液2 次），得到的溶液即為免疫原溶液，簡(jiǎn)稱SAL-BSA。
[0031] 免疫原的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)式（II)。
[0032]
[0033] 三、包被原的制備
[0034] 用0VA代替BSA，其它同步驟二，得到包被原溶液，簡(jiǎn)稱SAL-0VA。
[0035] 實(shí)施例2、多克隆抗體的制備
[0036] 取實(shí)施例1制備的SAL-BSA溶液，用ρΗ7· 4、0· 01M的PBS緩沖液稀釋，得到免疫原 稀釋液，用于多克隆抗體的制備。采用雌性新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物。
[0037]免疫過(guò)程如下（免疫劑量以蛋白量計(jì)）：
[0038] 首次免疫：將免疫原稀釋液與等體積的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮 下多點(diǎn)注射，免疫劑量為lmg/kg·b.w.;
[0039] 加強(qiáng)免疫：首次免疫后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，將免疫原稀釋液與等體積的 弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，單次免疫劑量為lmg/kg·b.w.;
[0040] 末次免疫：首次免疫10周后進(jìn)行末次免疫，直接頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫原稀釋 液，免疫劑量為lmg/kg·b.w.。
[0041] 末次免疫1周后,將血清效價(jià)為3.OX104以上的兔子處死，分離血清，用飽和硫酸 銨法純化，分裝凍存，即為免疫原對(duì)應(yīng)的多克隆抗體（簡(jiǎn)稱多克隆抗體甲）。
[0042] 實(shí)施例3、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的組裝
[0043] 化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒包括如下組件：
[0044]1、包被了包被原的化學(xué)發(fā)光微孔板
[0045] 取實(shí)施例1制備的包被原溶液，用包被緩沖液稀釋（包被緩沖液即pH9.6、0. 03M 的碳酸鹽緩沖液），得到蛋白濃度為2ng/mL的包被原稀釋液。將10g牛血清白蛋白、0.lmL proclin300和1000mLpH7.4、0. 01M的磷酸鹽緩沖液混合，得到封閉液。
[0046] (1)將包被原稀釋液加入化學(xué)發(fā)光微孔板（100μL/孔），37°C孵育16小時(shí)。
[0047] (2)完成步驟⑴后，傾去孔內(nèi)的液體，洗滌，拍干。
[0048] (3)完成步驟⑵后，每孔加入200μL封閉液，37°C溫育2h。
[0049] (4)完成步驟（3)后，傾去孔內(nèi)的液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0050] 2、多克隆抗體工作液
[0051] 取10mg牛血清白蛋白，用ρΗ7· 4、0· 02M的PBS緩沖液溶解并定容至1000mL，得到 抗體稀釋液。
[0052] 將實(shí)施例2制備的多克隆抗體甲用抗體稀釋液稀釋至150000倍體積，得到一抗工 作液甲。
[0053] 3、二抗工作液
[0054] 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories Inc.產(chǎn)品目錄號(hào)為115-035-003。
[0055] 將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗用步驟2中的抗體稀釋液稀釋至1000倍體 積，得到二抗工作液。
[0056] 4、標(biāo)準(zhǔn)品溶液
[0057] 將沙丁胺醇溶于pH7. 4、0. 05M的磷酸鹽緩沖液，分別得到濃度為0. 02ng/mL、 0· 06ng/mL、0. 18ng/mL、0. 54ng/mL和 1. 62ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將ρΗ7· 4、0· 05M的磷酸鹽 緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的陰性對(duì)照溶液，稱為〇溶液。
[0058] 5、發(fā)光底物液
[0059] 發(fā)光液由Α液和Β液組成，Α液和Β液各一瓶，4mL/瓶。
[0060]A液的制備方法：取0. 2g魯米諾單鈉鹽、0.lg對(duì)碘苯酚、0. 16g氯化鈉和0. 18g EDTA-Na2，用pH8. 4、0. 1M的Tris-HCl緩沖液溶解并定容至 1000mL。
[0061]B液：含 0· 3mMH202、5mMEDTA-Na2 的ρΗ8· 4、0· 1M的Tris-HCl緩沖液。
[0062] 6、20X濃縮洗滌液
[0063] 將1000mLρΗ7· 4、0· 2M的磷酸鹽緩沖液與lmLproclin300混合，得到20X濃縮 洗滌