一種黃豆苷元半抗原和完全抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一種黃豆巧元半抗原和完全抗原 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃豆巧元又名大豆巧元，是大豆異黃酬的一種，由豆科植物葛根中提取得到，具有 類似雌激素的生物活性;具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、股動(dòng)脈、腦動(dòng)脈，增加腦血流量，加強(qiáng)四肢血流 循環(huán)，降低血液黏度，減弱血管阻力，減少屯、肌耗氧量，改善屯、功能，增強(qiáng)微循環(huán)，加強(qiáng)末梢 血流量，使血液流變學(xué)改變，降壓、改善屯、率作用。黃豆巧元可用于高血壓、癥狀性高血壓、 冠屯、病、眩暈癥、腦血栓、屯、絞痛、屯、肌梗死、屯、律失常、突發(fā)性耳聾、婦女更年期綜合征等的 治療。黃豆巧元分子式為Cl出10化，分子量:254.24，其結(jié)構(gòu)式如下式所示：
[0003]
[0004] 目前，檢測(cè)黃豆巧元的方法有高效液相色譜法化PLC)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS-MS)和毛細(xì)管電泳法化PCE)等儀器方法，但運(yùn)些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較 貴等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，而免疫分析方法具有靈敏度高，檢測(cè)速度快，特 異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，具有顯著優(yōu)勢(shì)。而得到高親和力和高特異性的抗體是免疫檢測(cè)的前提，其 中，人工抗原的合成更是其中非常重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有黃豆巧元檢測(cè)方法的缺陷和技術(shù)不足，提供 一種黃豆巧元半抗原和完全抗原的制備方法。本發(fā)明制備方法合成步驟安全有效，純度較 高，可得到滿足制備完全抗原純度要求的黃豆巧元半抗原衍生物。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種黃豆巧元半抗原。
[0007] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供上述黃豆巧元半抗原的制備方法。
[000引本發(fā)明的再一目的是提供利用上述黃豆巧元半抗原制備完全抗原的方法，W及制 備得到的黃豆巧元完全抗原。
[0009] 本發(fā)明上述目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] -種黃豆巧元半抗原，其分子結(jié)構(gòu)如下式(I)或式（n)所示：
[0011]
[0012] 上述黃豆巧元半抗原的制備方法中，所述式（I)的制備方法是利用黃豆巧元與漠 乙酸乙醋、艦化鐘和氨氧化鐘溶液反應(yīng)生成醋類物質(zhì)，再與氨氧化鐘溶液反應(yīng)得到。
[0013] 具體地，所述式(I)的制備方法包括如下步驟：
[0014] SI.將黃豆巧元溶于丙酬中，依次加入氨氧化鐘溶液、艦化鐘和漠乙酸乙醋，室溫 下攬拌反應(yīng)；
[0015] S2.向步驟Sl的反應(yīng)液中加入鹽酸溶液進(jìn)行中和，再加入蒸饋水，然后萃取后合并 有機(jī)層，干燥過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙醋，得到粗品醋；
[0016] S3.所得粗品醋用丙酬復(fù)溶，W氯仿和甲醇作展開(kāi)劑，室溫下進(jìn)行薄層層析，得到 目標(biāo)產(chǎn)物醋；
[0017] S4.將目標(biāo)產(chǎn)物醋溶于甲醇中，加入氨氧化鐘溶液進(jìn)行反應(yīng);再用鹽酸溶液中和， 再加入蒸饋水，然后萃取后合并有機(jī)層，干燥過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙醋，得到目標(biāo)產(chǎn)物。 [00 1引在式（I)的制備方法中，，優(yōu)選地，步驟Sl所述黃豆巧元與丙酬的比例為20~30mg/ mLo
[0019] 更優(yōu)選地，步驟SI所述黃豆巧元與丙酬的比例為25mg/mL。
[0020] 優(yōu)選地，步驟SI所述氨氧化鐘溶液與丙酬的體積比為0.05~0.2:1。
[0021] 更優(yōu)選地，步驟Sl所述氨氧化鐘溶液與丙酬的體積比為0.1075:1。
[0022] 優(yōu)選地，步驟Sl所述艦化鐘與黃豆巧元的質(zhì)量比為0.05~1:1。
[0023] 更優(yōu)選地，步驟Sl所述艦化鐘與黃豆巧元的質(zhì)量比為0.064:1。
[0024] 優(yōu)選地，步驟Sl所述漠乙酸乙醋與丙酬的體積比為0.005~0.02:1。
[00巧]更優(yōu)選地，步驟Sl所述漠乙酸乙醋與丙酬的體積比為0.01625:1。
[00%]優(yōu)選地，步驟Sl所述氨氧化鐘溶液的濃度為Imol/L。
[0027] 優(yōu)選地，步驟S1所述室溫是指15°C~30°C。
[0028] 另外，所述式（E)的制備方法是利用黃豆巧元與叔下醇鐘和漠乙酸乙醋反應(yīng)生成 醋類物質(zhì)，再與氨氧化鐘溶液反應(yīng)得到。
[0029] 具體地，所述式（n)的制備方法包括如下步驟：
[0030] SI.將黃豆巧元溶于N，N-二甲基甲酯胺中，依次加入叔下醇鐘和漠乙酸乙醋，低溫 下攬拌反應(yīng)；
[0031] S2.向步驟Sl的反應(yīng)液中加入鹽酸溶液進(jìn)行中和，再加入蒸饋水，然后萃取后合并 有機(jī)層，干燥過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙醋，得到粗品醋；
[0032] S3.所得粗品醋用丙酬復(fù)溶，W氯仿和甲醇作展開(kāi)劑，室溫下進(jìn)行薄層層析，再經(jīng) 液相色譜純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物醋；
[0033] S4.將目標(biāo)產(chǎn)物醋溶于甲醇中，加入氨氧化鐘溶液進(jìn)行反應(yīng);再用鹽酸溶液中和， 再加入蒸饋水，然后萃取后合并有機(jī)層，干燥過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙醋，得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0034] 在式（n )的制備方法中，優(yōu)選地，步驟SI所述黃豆巧元與N，N-二甲基甲酯胺的比 例為 20 ~30mg/mL。
[0035] 更優(yōu)選地，步驟SI所述黃豆巧元與N，N-二甲基甲酯胺的比例為25mg/mL。
[0036] 優(yōu)選地，步驟SI所述叔下醇鐘與黃豆巧元的質(zhì)量比為0.5~2:1，
[0037] 更優(yōu)選地，步驟Sl所述叔下醇鐘與黃豆巧元的質(zhì)量比為1.1:1。
[0038] 優(yōu)選地，步驟Sl所述漠乙酸乙醋與N，N-二甲基甲酯胺的體積比為0.005~0.02:1。
[0039] 更優(yōu)選地，步驟Sl所述漠乙酸乙醋與N，N-二甲基甲酯胺的體積比為0.01625:1。
[0040] 優(yōu)選地，步驟Sl所述低溫是指-40°C~-70°C。
[0041] 另外，在上述式（I)和式（n)的制備方法中，優(yōu)選地，步驟S3所述氯仿和甲醇的體 積比為15~25:1。
[0042] 更優(yōu)選地，步驟S3所述氯仿和甲醇的體積比為20:1。
[0043] 優(yōu)選地，步驟S4所述目標(biāo)產(chǎn)物醋與甲醇的比例為5~lOmg/mL。
[0044] 更優(yōu)選地，步驟S4所述目標(biāo)產(chǎn)物醋與甲醇的比例為6.8mg/mL。
[0045] 優(yōu)選地，步驟S2或S4所述萃取是用乙酸乙醋和飽和氯化鋼溶液分別萃取。
[0046] 優(yōu)選地，步驟S2或S4所述干燥過(guò)濾是用無(wú)水硫酸鋼進(jìn)行干燥過(guò)濾。
[0047] 優(yōu)選地，步驟S2或S4所述鹽酸溶液的濃度為Imol/L。
[004引優(yōu)選地，步驟S4所述氨氧化鐘溶液的濃度為Imol/L。
[0049] 優(yōu)選地，步驟S2所述蒸饋水的用量是丙酬的5倍。
[0050] 優(yōu)選地，步驟S4所述蒸饋水的用量是甲醇的5倍。
[0051] 優(yōu)選地，步驟S2或S4所述萃取為分別萃取兩次。
[0052] 另外，上述黃豆巧元半抗原在制備黃豆巧元完全抗原或在制備黃豆巧元抗體中的 應(yīng)用，W及W上述黃豆巧元半抗原合成得到的黃豆巧元完全抗原，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0053] 作為一種優(yōu)選的實(shí)施方案，上述黃豆巧元完全抗原的制備方法包括W下步驟：
[0054] Sl.將黃豆巧元半抗原、EDC和NHS溶于200化的DMF中，室溫?cái)埌璺磻?yīng)過(guò)夜，即得活 化好的黃豆巧元衍生物；
[0055] S2.將載體蛋白溶于0.9%的氯化鋼溶液中，再邊攬拌邊逐滴加入上述活化好的黃 豆巧元衍生物，室溫下反應(yīng)1~化，反應(yīng)結(jié)束后，用0.9%的氯化鋼溶液透析，即得到黃豆巧 元完全抗原，分裝后冷凍保存于-20°C。
[0056] 其中，優(yōu)選地，步驟S1中的黃豆巧元半抗原、EDC和NHS的質(zhì)量比為1:0.6~1.2:0.4 ~1。
[0化7] 優(yōu)選地，步驟Sl中的黃豆巧元半抗原:DMF = 5mg/mL。
[0化引優(yōu)選地，步驟S2中的載體蛋白：氯化鋼溶液=6~10mg:1.8~2.5mL。
[0059] 優(yōu)選地，步驟S2所述載體蛋白是BSA或OVA。
[0060] 本發(fā)明還提供了一種鑒定或應(yīng)用上述完全抗原黃豆巧元7-BSA或黃豆巧元4'-BSA 的方法，是按照5化g/只的劑量，分別皮下注射免疫5只雌性Ba化/c小鼠。初次免疫將免疫原 與完全弗氏佐劑按照1:1混合乳化。之后將免疫原與不完全弗氏佐劑按照1:1混合每間隔兩 周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。S免后尾部取血間接化ISA法測(cè)定效價(jià)。
[0061] 另外，上述黃豆巧元半抗原在制備黃豆巧元完全抗原化合物，或在制備黃豆巧元 抗體中的應(yīng)用，W及上述黃豆巧元半抗原在檢測(cè)黃豆巧元或其結(jié)構(gòu)類似物中的應(yīng)用，均在 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0062] 同時(shí)，所述黃豆巧元完全抗原和黃豆巧元抗體在檢測(cè)黃豆巧元或其結(jié)構(gòu)類似物中 的應(yīng)用，W及在黃豆巧元免疫檢測(cè)中的應(yīng)用或制備檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，也應(yīng)在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
[0063] 由于黃豆巧元屬于小分子物質(zhì)，無(wú)法直接誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，其本身 沒(méi)有可供偶聯(lián)的活性官能團(tuán)（如氨基、簇基等），因此無(wú)法與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生特 異性抗體的抗原。若對(duì)黃豆巧元分子進(jìn)行修飾衍生化，接上活性官能團(tuán)使其能與載體蛋白 偶聯(lián)則有可能形成抗原，運(yùn)種經(jīng)過(guò)人工修飾后的抗原稱為人工抗原，而該衍生化產(chǎn)物則稱 為半抗原。因此，要實(shí)現(xiàn)黃豆巧元和載體蛋白的偶聯(lián)，得到特異性抗體，首先要進(jìn)行黃豆巧 元的設(shè)計(jì)和合成。為保證半抗原和大分子載體蛋白偶聯(lián)后能被識(shí)別，半抗原的設(shè)計(jì)關(guān)鍵之 處在于盡可能保留其母環(huán)結(jié)構(gòu)，在其適當(dāng)?shù)奈恢靡牒线m的連接臂和能與載體蛋白偶聯(lián)的 活性基團(tuán)。而針對(duì)黃豆巧元化學(xué)結(jié)構(gòu)，其本身在7位和4 '位具有兩個(gè)徑基，基于此，本發(fā)明設(shè) 計(jì)了黃豆巧元半抗原合成方法，從7位和4'位分別衍生，并W此制備適合于動(dòng)物免疫的完全 抗原，為建立黃豆巧元的免疫分析方法提供了有利的條件，滿足了國(guó)內(nèi)對(duì)該研究的需要，具 有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。
[0064] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0065] 本發(fā)明提供了一種新型的黃豆巧元半抗原衍生物的合成方法，為黃豆巧元完全抗 原的合成及黃豆巧元抗體的制備提供可能，方法合成步驟安全有效，產(chǎn)物純度較高。
[0066