專利名稱：2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
由于農(nóng)藥使用規(guī)模不斷擴(kuò)大，農(nóng)藥殘留造成環(huán)境影響和對(duì)人類健康的慢性和長(zhǎng)期效應(yīng)日益受到人們關(guān)注和擔(dān)憂，對(duì)農(nóng)藥殘留的限制也因此越來(lái)越嚴(yán)格，對(duì)分析測(cè)定對(duì)象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸方面都提出了新的要求和更高的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)分子量小于1000道爾頓的小分子有毒化學(xué)品如農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物，傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)，液相色譜(HPLC)或質(zhì)譜(MS)等物化分析手段，傳統(tǒng)的理化分析方法通常繁瑣復(fù)雜，樣品前處理過程復(fù)雜、工作量大、儀器昂貴、要求有熟練的技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期，因此人們迫切希望有一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏及價(jià)廉的檢測(cè)技術(shù)能在野外和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大批量的篩選試驗(yàn)。免疫分析法正具備這些優(yōu)點(diǎn)，所以盡管免疫分析應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析的時(shí)間很短，但已很快用于環(huán)境樣品和食品中農(nóng)藥殘留的分析。
1958年Berson S.A和Yallow創(chuàng)立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物醫(yī)學(xué)和臨床藥物定量測(cè)定得到廣泛應(yīng)用。由于農(nóng)藥殘留分析對(duì)象的復(fù)雜性，直到八十年代免疫分析才被逐漸應(yīng)用于這一領(lǐng)域。
第一個(gè)農(nóng)藥免疫分析的報(bào)道是1967年Centen等人制備的農(nóng)藥馬拉硫磷的抗血清，通過抗原抗體沉淀反應(yīng)，證明了抗血清與馬拉硫磷的可反應(yīng)性。從1967年到70年代末的10余年間，由于技術(shù)上的局限，盡管已開發(fā)出了幾個(gè)農(nóng)藥的免疫分析方法，但仍未受到普遍重視，發(fā)展相當(dāng)緩慢。進(jìn)入80年代以來(lái)，由于人們對(duì)分析方法的選擇性和靈敏度的要求越來(lái)越高，同時(shí)對(duì)分析對(duì)象的種類和環(huán)境樣品的數(shù)量要求也在不斷增加，具有高度特異性、靈敏性、快速性的免疫檢測(cè)技術(shù)在農(nóng)藥分析領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。進(jìn)入90年代以來(lái)，農(nóng)藥的免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，到目前為止，已有60多種農(nóng)藥開發(fā)了免疫檢測(cè)技術(shù)，其中除草劑和殺蟲劑較多，殺菌劑較少。國(guó)內(nèi)這方面的研究也漸漸起步，已有關(guān)于對(duì)硫磷、三唑酮、禾大壯、甲胺磷、莠去津均三氮苯類等農(nóng)藥的人工抗原和高親合力的特異性抗體，用RIA法或ELISA法進(jìn)行樣品中痕量農(nóng)藥的分析。但總體來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)這方面的研究尚處于跟蹤國(guó)外的發(fā)展。
2甲4氯(MCPA)是激素型的內(nèi)吸性苯氧羧酸類除草劑。對(duì)植物有較強(qiáng)的生理活性，易為根部和葉部吸收和傳導(dǎo)，在低濃度時(shí)，對(duì)作物有生長(zhǎng)刺激作用，防止落花、落果，形成無(wú)籽果實(shí)，促進(jìn)果實(shí)成熟及插枝生根等。高濃度時(shí)對(duì)雙子葉植物有抑制生長(zhǎng)作用，植物出現(xiàn)畸形，直至死亡。主要用于水稻、麥類、玉米等作物，防除幼嫩的鴨舌草、莧菜、野慈姑等闊葉雜草及莎草科雜草；對(duì)棉花、大豆、瓜類、果樹等闊葉作物很敏感，對(duì)水稻秧苗亦敏感，容易產(chǎn)生藥害。
檢測(cè)2甲4氯殘留量常規(guī)方法有氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。這些方法的靈敏度受樣品的凈化，濃縮等步驟的影響很大，又需要大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所不具備的復(fù)雜儀器，且過程繁瑣，需要衍生化處理，不適合大批量樣品的檢測(cè)與分析。免疫分析為2甲4氯殘留研究提供了一個(gè)新的分析檢測(cè)途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途。
2甲4氯(MCPA)人工半抗原，它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～20；或者分子結(jié)構(gòu)式為 化學(xué)名稱為6-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基己酸(簡(jiǎn)稱為MC)；或者分子結(jié)構(gòu)式為
化學(xué)名稱為4-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基丁酸(簡(jiǎn)稱為MB)。
如權(quán)利要求1所述的2甲4氯(MCPA)人工半抗原制備方法的步驟為1)將氯化亞砜和2甲4氯，回流反應(yīng)1.5h，蒸餾除去剩余的氯化亞砜，即得產(chǎn)物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1～1.5∶1在三口燒瓶中投入6-氨基己酸或γ-氨基丁酸，冰浴下加入3～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，攪拌溶解，再加入2～5ml溶解于10～25ml二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，間隔5～10min，加入2～5ml上述溶液和每1～5mmol原料1～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，加畢，繼續(xù)在0～4℃下反應(yīng)2h。升至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀鹽酸3×25ml洗滌，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0左右，有白色固體析出，用布氏漏斗抽濾，烘干。經(jīng)硅膠柱層析純化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基己酸(MC)或4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。
2甲4氯人工抗原，它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～20，或它的分子結(jié)構(gòu)式為 2甲4氯特異性抗體是能與2甲4氯發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。
它用于檢測(cè)食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品(如土壤與水樣)中2甲4氯的殘留量。
本發(fā)明通過設(shè)計(jì)合成2甲4氯人工半抗原和人工抗原，經(jīng)免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，以抗原抗體特異性免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，并引入標(biāo)記物來(lái)放大顯示這一反應(yīng)，則可用于樣本測(cè)定。其選擇性取決于免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，其靈敏度取決于抗體的親合性和標(biāo)記物的可檢性。因此，可快速準(zhǔn)確地分析檢測(cè)2甲4氯在樣本中的殘留量。這種方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，樣品前處理簡(jiǎn)單，便于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，可以與常規(guī)方法互為補(bǔ)充。
具體實(shí)施例方式
12甲4氯(MCPA)人工半抗原的合成基于2甲4氯苯環(huán)側(cè)鏈上本身就具有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的特征基團(tuán)-COOH，可直接將其與蛋白質(zhì)偶聯(lián)免疫兔子得到抗體，所以本身是一個(gè)半抗原(簡(jiǎn)稱M)。
為了讓半抗原的結(jié)構(gòu)特征充分暴露，可在-COOH位點(diǎn)上接上一個(gè)連接臂，據(jù)此以2甲4氯為起始原料，同時(shí)以氯化亞砜，氨基丁酸或氨基己酸等為原料，經(jīng)過二步反應(yīng)，合成了半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基己酸(MC)和4-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基丁酸(MB)。產(chǎn)物MC和MB純化后分別經(jīng)質(zhì)譜(ESI)和核磁共振氫譜(1H-NMR)鑒定，并與類似已知的化合物數(shù)據(jù)比較確證。
主要半抗原的結(jié)構(gòu)如下 2人工抗原的合成免疫原的合成采用碳二亞胺法。將半抗原M(或MC或MB)溶解N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下反應(yīng)過夜后，離心，取上清加入到10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1～6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
包被抗原的合成利用混合酸酐法。將半抗原M(或MC或MB)溶解N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時(shí)，反應(yīng)液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1～4小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原時(shí)反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)分析。偶聯(lián)物與半抗原M、MB、MC、BSA和OVA的吸收峰相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原M-BSA、M-OVA、MC-BSA、MC-OVA、MB-BSA和MB-OVA的合成是成功的。
經(jīng)計(jì)算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下M-BSA 4～20∶1MC-BSA10～50∶1 MB-BSA10～50∶1M-OVA 2～10∶1MC-OVA3～15∶1MB-OVA3～15∶13抗體的制備及2甲4氯酶聯(lián)免疫分析方法的建立將半抗原M、MC和MB與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備得到的三種免疫原復(fù)合物按常規(guī)方法各免疫了三只兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。待第4次免疫時(shí)，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，抗血清的效價(jià)分別為1∶25600、1∶12800、1∶12800；1∶25600、1∶12800、1∶51200；1∶51200、1∶51200和1∶102400。免疫血清合格后，進(jìn)行采血，分離出抗血清。
利用2甲4氯抗原抗體免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)建立2甲4氯酶聯(lián)免疫分析法。在檢測(cè)分析食品、植物和環(huán)境土壤與水等樣品中2甲4氯殘留時(shí)具有很高的特異性和靈敏度，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.005ppm，準(zhǔn)確度高，回收率可高達(dá)96.5％以上，同時(shí)操作方法簡(jiǎn)單快速，不需要復(fù)雜的前處理過程，一次可同時(shí)檢測(cè)大批樣品，成本低廉，對(duì)操作人員的要求低，便于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，可以與常規(guī)方法互為補(bǔ)充。
實(shí)施例1半抗原MC的合成1)按氯化亞砜過量將SOCl2和2甲4氯裝入三口燒瓶中，在磁力攪拌下，加熱回流反應(yīng)1.5h，蒸餾除去多余的SOCl2，即得產(chǎn)物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1稱取6-氨基己酸放入三口燒瓶中，冰浴下加入3ml 4mol/L的NaOH溶液，磁力攪拌溶解，再加入2mL溶解于10mL二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，間隔5min，加入2ml上述溶液和每1mmol原料1ml 2mol/L的NaOH溶液，加畢，在0～4℃下攪拌反應(yīng)2h。升至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀鹽酸3×25ml洗滌，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0左右，有白色固體析出，抽濾，烘干。經(jīng)硅膠柱層析純化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙酰基)氨基己酸(MC)。
取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI和1H-NMRR測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)。該物質(zhì)的ESI分子離子標(biāo)準(zhǔn)峰為331(M--1)，且該峰旁333有一同位素峰，其峰高為331峰的1/3強(qiáng)，由此可知該物質(zhì)有1個(gè)Cl原子。1H-NMR(C3D6O)為δ10.557(s，H，COOH)，7.371(s，H，NH)，6.880～7.191(q+m，3H，3ArH)，4.492(s，2H，CH2CON)，3.246～3.297(q，2H，CH2COO)，2.269～2.337(t，2H，NCH2)，2.195～2.217(t，3H，CH3)，1.293～1.601(t，6H，3CH2)。
從以上分析綜合可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
實(shí)施例2半抗原MB的合成1)按氯化亞砜過量將SOCl2和2甲4氯裝入三口燒瓶中，在磁力攪拌下，加熱回流反應(yīng)1.5h，蒸餾除去多余的SOCl2，即得產(chǎn)物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。
2)按投料比γ-氨基丁酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.5∶1稱取γ-氨基丁酸放入三口燒瓶中，冰浴下加入5ml 4mol/L的NaOH溶液，磁力攪拌溶解，再加入5mL溶解于25mL二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，間隔10min，加入5ml上述溶液和每5mmol原料5ml 4mol/L的NaOH溶液，加畢，在0～4℃下攪拌反應(yīng)2h。升至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀鹽酸3×25ml洗滌，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0左右，有白色固體析出，抽濾，烘干。經(jīng)硅膠柱層析純化得半抗原4-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基丁酸(MB)。
取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI和1H-NMRR測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)。該物質(zhì)的ESI分子離子標(biāo)準(zhǔn)峰為284(M--1)，且該峰旁286有一同位素峰，其峰高為284峰的1/3強(qiáng)，由此可知該物質(zhì)有1個(gè)Cl原子。該產(chǎn)物1H-NMR(C3D6O)為δ10.578(s，1H，COOH)，7.419(s，1H，NH)，6.858～7.152(q+q，3H，3ArH)，4.473(s，2H，CH2CON)，3.277～3.326(q，2H，CH2COO)，2.21～2.313(t，2H，NCH2)，2.173～2.203(t，3H，CH3)，1.750～1.858(q，2H，CH2)。
從以上分析綜合可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
實(shí)施例3人工抗原的合成3.1免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將50微摩爾半抗原M，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時(shí)，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
3.2包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將50微摩爾半抗原M溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時(shí)，反應(yīng)液100μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1小時(shí)，然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
3.3人工抗原的鑒定按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原時(shí)反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計(jì)算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下M-BSA4～20∶1M-OVA2～10∶1實(shí)施例4人工抗原的合成4.1免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將80微摩爾半抗原MC，溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液800μL緩慢加入到8mL20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，先用蒸餾水透析4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
4.2包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將100微摩爾半抗原MC溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時(shí)，反應(yīng)液800μL加入到10mL20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)4小時(shí)，然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
4.3人工抗原的鑒定按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原時(shí)反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計(jì)算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下MC-BSA 10～50∶1MC-OVA 3～15∶1實(shí)施例5人工抗原的合成5.1免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將60微摩爾半抗原MB，溶解在1.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液500μL緩慢加入到6mL 15mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)5小時(shí)，裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
5.2包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將60微摩爾半抗原MB，溶解在1.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，反應(yīng)液600μL加入到6mL 15mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)2小時(shí)，然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
5.3人工抗原的鑒定按照合成2甲4氯免疫原和包被抗原時(shí)反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計(jì)算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下MB-BSA 10～50∶1MB-OVA 3～15∶1實(shí)施例6抗體的制備6.1免疫動(dòng)物制備抗血清實(shí)驗(yàn)選用半周歲左右，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三只兔子(由浙江省中醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)兔子的飼養(yǎng)工作)，分別編號(hào)為兔子1-6。
實(shí)驗(yàn)免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～4.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg，用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點(diǎn)注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測(cè)定效價(jià)和特異性。待免疫血清效價(jià)合格后，就進(jìn)行采血。
本實(shí)驗(yàn)采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角燒瓶中的血液凝固后，然后用接種針沿三角燒瓶邊緣將血塊與玻璃脫離，放置于37℃溫箱中半小時(shí)，再放到4℃冰箱中3～4小時(shí)，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，以3000rpm離心15分鐘，分離出血清。
6.2抗血清效價(jià)測(cè)定三種免疫原復(fù)合物按常規(guī)方法各免疫了三只兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。待第4次免疫時(shí)，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，抗血清的效價(jià)分別為1∶25600、1∶12800、1∶12800；1∶25600、1∶12800、1∶51200；1∶51200、1∶51200和1∶102400。
6.3抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個(gè)經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來(lái)中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來(lái)源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。
實(shí)施例72甲4氯酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法建立與鑒定7.12甲4氯ELISA測(cè)定方法的原理采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。它是將農(nóng)藥分子與大分子載體(如蛋白質(zhì))偶聯(lián)制得的復(fù)合物作為包被抗原吸附于固相載體(96孔酶標(biāo)板)上，制備成固相抗原，然后加入待測(cè)農(nóng)藥和相應(yīng)抗體，固相抗原中的農(nóng)藥，待測(cè)農(nóng)藥，與抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，待測(cè)農(nóng)藥含量多，被結(jié)合在固相抗原上的抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原的抗體多，反應(yīng)后加入酶標(biāo)二抗(只能與結(jié)合在固相抗原上的抗體相結(jié)合)，最后用底物進(jìn)行顯色加以測(cè)定，當(dāng)抗體量一定時(shí)，加入的待測(cè)農(nóng)藥量越多，與固相抗原結(jié)合的抗體就越少，顯色反應(yīng)就減弱，抑制率增高，反之，則顯色反應(yīng)增強(qiáng)，抑制率減低，因而可根據(jù)已知量農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)線和待檢樣品的抑制率，推算出待測(cè)農(nóng)藥的濃度。
7.2最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定選擇包被抗原M-BSA、抗M-BSA抗體、抗MC-BSA抗體和抗MB-BSA抗體用方陣滴定法，同時(shí)稀釋抗體和固相抗原包被液。
在同一包被液濃度下，隨著抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢(shì)，同樣在同一抗體稀釋濃度下，隨著包被液濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢(shì)。選擇抗體8000倍稀釋作為最適工作濃度，包被抗原濃度0.5μg.mL-1作為最佳包被濃度。
7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)靈敏度7.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，其基本的操作步驟如下7.3.1.1包被1)包被抗原溶液的配制從低溫冰箱中取出M-OVA偶聯(lián)復(fù)合物，使之完全解凍后，稀釋成相應(yīng)工作濃度。
2)微量反應(yīng)板的包被96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板用PBST洗滌后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃溫箱中溫育2h。
7.3.1.2封閉取出包被好的微量反應(yīng)板，甩掉包被液，用PBST洗滌后，每孔加入2.0％的脫脂奶200μL，于37℃溫箱中溫育0.5h。
7.3.1.3點(diǎn)板1)配制2甲4氯的標(biāo)準(zhǔn)溶液取2甲4氯標(biāo)樣配制100ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中取出200μL，待溶劑丙酮揮發(fā)后，加入2mLPBS溶液，使之成10ppm溶液，稀釋成若干(5～8)個(gè)濃度。
2)2甲4氯抗體稀釋液的配制從冰箱中取出已經(jīng)配制成適當(dāng)濃度的抗體(抗M-BSA抗體、抗MC-BSA抗體或抗MB-BSA抗體)，用PBS稀釋成工作濃度。
3)點(diǎn)板取出經(jīng)封閉的板，經(jīng)200ul PBST洗滌3次后，每孔加入系列濃度的2甲4氯標(biāo)準(zhǔn)液50μL，再加入抗體稀釋液50μL，對(duì)照孔加入PBS50μL和抗體稀釋液50μL。放入37℃溫箱中溫育1h，棄去孔內(nèi)液體，用200ul PBST溶液洗滌3次。
7.3.1.4加酶標(biāo)二抗每孔加入經(jīng)1∶1000稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶PBS溶液100μL，放入37℃溫箱中1小時(shí)，用PBST溶液洗滌3次，甩干。
7.3.1.5顯色每孔加入底物OPD-過氧化氫溶液100μL，37℃溫箱中溫育15min，用50μL 2MH2SO4終止反應(yīng)。在酶聯(lián)儀上測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的吸光值。根據(jù)抑制率與農(nóng)藥濃度之間的半對(duì)數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對(duì)數(shù)曲線表示，抑制率以下式計(jì)算 式中ODmax為不加藥時(shí)的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時(shí)的吸光值，ODmin為空白對(duì)照孔的吸光值。
由上述公式計(jì)算得2甲4氯各濃度的抑制率，作圖。用抗M-BSA抗體測(cè)定時(shí)，抑制率為50％時(shí)2甲4氯的濃度為1.0ppm，最低檢測(cè)限(以抑制率為10％的濃度表示)為0.01ppm；用抗MC-BSA抗體測(cè)定時(shí)，抑制率為50％時(shí)2甲4氯的濃度為0.63ppm，最低檢測(cè)限為0.005ppm；用抗MB-BSA抗體測(cè)定時(shí)，抑制率為50％時(shí)2甲4氯的濃度為0.82ppm，最低檢測(cè)限同樣也為0.005ppm。2甲4氯在0.005ppm～10.00ppm范圍內(nèi)，抑制率與2甲4氯濃度的對(duì)數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，抗M-BSA抗體的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9912，抗MC-BSA抗體的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9896，抗MB-BSA抗體的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9862。
7.4抗體的特異性抗血清的特異性就是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該抗原類似物結(jié)合能力的比較。常用交叉反應(yīng)活性作為評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗血清的特異性則越好。
將2甲4氯及其類似物做系列稀釋，分別與同一種抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，按制4.3的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50％的劑量和類似物抑制率50％時(shí)的用量，然后計(jì)算出各類似物的交叉反應(yīng)率。
抗M-BSA抗體對(duì)一些苯氧羧酸類農(nóng)藥交叉反應(yīng)率2，4-D為37.8％，2，4-D丙酸為0.63％，2，4，5-T為2.9％。
抗MC-BSA抗體對(duì)一些苯氧羧酸類農(nóng)藥交叉反應(yīng)率2，4-D為30.8％，2，4-D丙酸為0.5％，2，4，5-T為4.3％。
抗MB-BSA抗體對(duì)一些苯氧羧酸類農(nóng)藥交叉反應(yīng)率2，4-D為24.6％，2，4-D丙酸為0.4％，2，4，5-T為2.3％。
從而可知，所制備的三種抗體的特異性均較強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種2甲4氯(MCPA)人工半抗原，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～20或者分子結(jié)構(gòu)式為 或者分子結(jié)構(gòu)式為
2.一種如權(quán)利要求1所述的2甲4氯(MCPA)人工半抗原制備方法，其特征在于方法的步驟為1)將氯化亞砜和2甲4氯，回流反應(yīng)1.5h，蒸餾除去剩余的氯化亞砜，即得產(chǎn)物2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯。2)按投料比6-氨基己酸∶2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯＝1.2∶1～1.5∶1在三口燒瓶中投入6-氨基己酸或γ-氨基丁酸，冰浴下加入3～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，攪拌溶解，再加入2～5ml溶解于10～25ml二噁烷的2-甲基-4-氯苯氧乙酰氯溶液，間隔5～10min，加入2～5ml上述溶液和每1～5mmol原料1～5ml 2～4mol/L的NaOH溶液，加畢，繼續(xù)在0～4℃下反應(yīng)2h。升至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用0.1mol/l稀鹽酸3×25ml洗滌，再用1mol/l的NaHCO3溶液3×25ml提取，收集提取液置于冰浴中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0左右，有白色固體析出，用布氏漏斗抽濾，烘干。經(jīng)硅膠柱層析純化得半抗原6-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基己酸(MC)或4-(2-甲基-4-氯苯氧乙?；?氨基丁酸(MB)。
3.一種2甲4氯人工抗原，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～20?；蛩姆肿咏Y(jié)構(gòu)式為
4.一種2甲4氯特異性抗體，其特征在于它是能與2甲4氯發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。
5.一種2甲4氯特異性抗體的用途，其特征在于它用于檢測(cè)食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品(如土壤與水樣)中2甲4氯的殘留量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種2甲4氯人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途。2甲4氯(2－甲基－4－氯苯氧羧酸)經(jīng)氯化亞砜?；蠓謩e與氨基丁酸和氨基己酸反應(yīng)，制備了半抗原4－(2－甲基－4－氯苯氧乙?；?氨基丁酸和6－(2－甲基－4－氯苯氧乙酰基)氨基己酸(簡(jiǎn)稱MB和MC)。2甲4氯(2－甲基－4－氯苯氧羧酸)本身也可作為半抗原(簡(jiǎn)稱M)，半抗原M、MB和MC分別通過碳化二亞胺法和混合酸酐法與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。將免疫抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)2甲4氯具有高親合力的特異性抗體。這種抗體與其他化合物不易發(fā)生交叉反應(yīng)。用該抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附分析法可用于快速、靈敏、方便、廉價(jià)地檢測(cè)樣本中痕量的2甲4氯殘留物。
文檔編號(hào)G01N33/02GK1562963SQ200410017270
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者程敬麗, 吳慧明, 施海燕, 魏方林, 朱國(guó)念 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)