專利名稱：一種檢測芳香植物鮮花含油量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芳香植物育種與產(chǎn)品深加工技術(shù)，特別涉及芳香植物含油量的檢測方法。
背景技術(shù)：
芳香植物也稱香料植物、芳香花草或香草，大部分生長在溫暖地區(qū)，具有香味，部分和全部可用在料理、茶飲、花藝、工藝、保健、香料、染色及藥用和造園等方面的多功能植物。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上芳香植物有80多個科3600多種，而迄今為止被有效開發(fā)利用的只有400多種；我國已發(fā)現(xiàn)有開發(fā)利用價值的香料植物種類有60多科400多種，其中 進行批量生產(chǎn)的天然香料品種已達(dá)100多種。薰衣草、代代、桅子、桂花樹和中國水仙等絕大多數(shù)芳香植物的芳香物質(zhì)都存在于它的鮮花中，且這些芳香物質(zhì)的主要成分為油脂，這也是芳香植物中具開發(fā)利用價值的主要生物活性成分，因其含量少而珍貴，故通常稱其為“精油”[陳金秀.福建省芳香植物資源的分布及開發(fā)利用的對策.福建輕紡.2004，177(2) : 7-14]。因此，培育精油含量高的芳香植物新品種、建立高得率的精油提取技術(shù)工藝，是當(dāng)前國內(nèi)外芳香植物鮮花精油領(lǐng)域研發(fā)的熱點之一。但值得指出的是，當(dāng)前測定芳香植物鮮花精油含量仍沿用傳統(tǒng)方法，即將5 10公斤鮮花用水蒸氣蒸餾，餾出液通過油水分離器分離獲得精油餾分并稱量，進而計算測得鮮花中精油的含量[單銀花等，芳香植物鮮花精油提取與純化工藝研究進展.精細(xì)與專用化學(xué)品.2008，16: 15-17]。這種方法因原料用量大、耗時費力，而難以滿足以高產(chǎn)精油的芳香植物新品種選育及高效提取技術(shù)工藝研制的實際需求。因此，迫切需要建立一種快速、微量測定芳香植物鮮花精油含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種快速檢測芳香植物鮮花中精油含量的微量方法。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種檢測芳香植物鮮花精油含量的方法先用液氮和石英沙將芳香植物鮮花充分研細(xì)，加入蒸餾水和二甲基亞砜(DMSO)后進行超聲處理及加熱回流，使芳香植物鮮花中的精油充分抽提至二甲基亞砜水溶液中，再通過蒸餾方式將精油分離出來，獲得精油與蒸餾水的混合液，并加入二甲基亞砜使其與精油互溶；利用尼羅紅能與芳香植物鮮花精油結(jié)合并發(fā)出特異波長熒光的特性，在含精油的二甲基亞砜水溶液中加入足量的尼羅紅，于490 nm光子激發(fā)下檢測450 700 nm的熒光發(fā)射光譜，并獲得被測芳香植物鮮花精油-尼羅紅產(chǎn)物的特征峰(λ J及其熒光發(fā)射光強度(I);將所得結(jié)果與空白樣本進行比較后，再與油脂標(biāo)準(zhǔn)品——三油酸甘油酯的熒光發(fā)射光強度曲線進行比較，通過對應(yīng)的光強度值得到被測芳香植物鮮花樣品中精油含量。本發(fā)明具體包括以下步驟
(1)稱取5 10 g芳香植物鮮花放入陶瓷研缽中，加入石英沙和液氮，并用研杵將芳香植物鮮花研磨成細(xì)泥；(2)將芳香植物鮮花細(xì)泥轉(zhuǎn)至圓底離心管中，加入10 ml蒸餾水和1 ml 二甲基亞砜并混勻；在冰浴條件下以超聲波處理60 s ；(3)將超聲波處理后的樣品轉(zhuǎn)至圓底蒸餾燒瓶中，加入15 ml蒸餾水并搖勻后安裝至冷凝回流器上；置100°c水浴中冷凝回流2 h后，停止加熱繼續(xù)通冷卻水，使系統(tǒng)冷卻至
室溫；(4)卸下帶試樣的圓底蒸餾燒瓶，將其安裝到具冷凝管的蒸餾提取器上，置100°C水浴中蒸餾，冷凝管通冷卻水，用25 ml容量瓶收集餾分，當(dāng)餾分達(dá)20 ml時，停止蒸餾；(5)在制得的餾分中依次加入二甲基亞砜1 ml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，再利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測450-700 nm的熒光發(fā)射光譜，并獲得被測芳香植物鮮花精油-尼羅紅產(chǎn)物的特征峰(λ。)及其熒光發(fā)射光強度(I)；同時，在20 ml蒸餾水中依次加入二甲基亞砜1 ml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液Iml，并用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，進而利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測特征波長λ。處的熒光發(fā)射光強度(IB)，以此為對照；待測芳香植物鮮花中精油的相對熒光強度值Is=1-1b ；(6)分別在5只25 ml容量瓶中加入20 ml蒸餾水和I ml 二甲基亞砜，再分別加入0、2. 5、5、7. 5、10 mg三油酸甘油酯，混勻后各加入25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并分別用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min ;以未加三油酸甘油酯的為對照，利用突光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測584 nm的相對突光發(fā)射光強度值(Ικ)，以三油酸甘油酯加入量m為橫坐標(biāo)、Ik為縱坐標(biāo)，作兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性擬合方程 IE=f (m)；(7)以步驟(5)中測得芳香植物鮮花中精油的相對熒光強度值Is替代步驟(6)線性擬合方程IK=f (m)中的Ik，通過計算即可行知步驟(I)中所秤取的芳香植物鮮花中精油的質(zhì)量m，其單位為mg ;進而可算得待測芳香植物鮮花鮮花中的精油含量CR=(m/M) X0. 001。本發(fā)明中，所指芳香植物鮮花可以是薰衣草、代代、桅子、桂花樹和中國水仙等的鮮花。本發(fā)明中，設(shè)定超聲波發(fā)生儀頻率為20 kHz，發(fā)射功率為150 W，變幅桿伸至樣品液面下2 cm，以2 s開/ I s關(guān)的間歇執(zhí)行超聲波處理。本發(fā)明中，25 Kg/mL的尼羅紅溶液配制方法為,稱取2. 5 mg尼羅紅,用5 ml丙酮溶解，再用蒸餾水定容至100 ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點本方法是用光度法檢測芳香植物鮮花精油含量，與傳統(tǒng)的稱量法相比，原料用量少，具有更高的靈敏度和簡便性，省時省力，且可實現(xiàn)高通量測量，可為芳香植物鮮花育種、栽培、精油提取工藝等研發(fā)提供了必要的技術(shù)方法。
具體實施例方式尼羅紅(9_(diethylamino) benzo [a]phenoxazin_5 (5H) -one)是一類親脂性的A惡嗪類染料，它能與芳香植物鮮花中的油脂結(jié)合并發(fā)出特異波長的熒光，因而在尼羅紅足量的前提下，通過測定熒光強度值即可表征被測樣品的脂質(zhì)含量。本發(fā)明方法先用液氮和石英沙將芳香植物鮮花充分研細(xì)，再加入具“萬能溶劑”之稱的二甲基亞砜后超聲及加熱回流，其目的是讓鮮花中的精油充分抽提至溶劑中，便于蒸餾出來。同時，在尼羅紅染色熒光檢測體系中加入二甲基亞砜是讓精油能充分溶于水劑中，以便精油能與尼羅紅充分結(jié)合生成熒光產(chǎn)物。本方法用光度法的原理與技術(shù)方法檢測芳香植物鮮花精油含量，比傳統(tǒng)的稱量法具更高的靈敏度、重復(fù)性和簡便性，且可實現(xiàn)高通量測量。下面通過具體實施例子，對本發(fā)明的實現(xiàn)方式進行詳細(xì)描述。本發(fā)明的技術(shù)方案可以通過以下步驟實現(xiàn)1、選用樣本材料為公知的代代(Citrus aurantium car. amara)花、薰衣草(lavandula pedunculata)、桅子(Gardenia jasminoides)、桂花樹(Osmanthus fragrans)和中國水仙(Narcissus pseudonarcissus),這些芳香植物品種在我國大部分地區(qū),特別是南方有廣泛栽培，在發(fā)明人所在的浙江大學(xué)芳香植物研發(fā)基地也有大量栽培，可按需提供鮮花樣本。2、試劑和儀器本發(fā)明中所用的尼羅紅(NR)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMS0)、三油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品均為美國Sigma公司產(chǎn)品，丙酮等為國產(chǎn)，均為分析純；JY92-1I型超聲波發(fā)生儀由寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；冷凝回流器、具冷凝管的蒸餾提取器由常熟市德順化工設(shè)備公司生產(chǎn)JE214S型電子天平為北京賽多利斯產(chǎn)品；RF-5301PC型熒光分光光度計為日本島津產(chǎn)品。3、測定芳香植物鮮花精油含量的步驟如下( I)先將采自浙江大學(xué)芳香植物研發(fā)基地的各種待測芳香植物鮮花分別剪成大小不超過5X5 _的碎片，用電子天平分別稱取的代代花5.1 g、薰衣草花8.4 g、桅子花6.7g、桂花5. 3 g和中國水仙花9. 8 g,分別放入100 ml的陶瓷研缽中并加入2 g石英沙；按以下步驟(2) - (7)分別對5種芳香植物鮮花樣品進行操作(2)研缽中分別加入30 ml液氮，并及時用研杵將芳香植物鮮花輕輕敲碎，再加入30 ml液氮并及時用研杵將芳香植物鮮花研磨成細(xì)泥；(3)將芳香植物鮮花細(xì)泥分別轉(zhuǎn)至25 ml的圓底離心管中，加入10 ml蒸餾水I ml二甲基亞砜并混勻，在冰浴條件下，設(shè)定超聲波發(fā)生儀頻率為20 kHz，發(fā)射功率為150 W，變幅桿伸至樣品液面下2 cm，以2 s / I s (開/關(guān))間歇處理樣品60 s；(4)將超聲波處理后的芳香植物鮮花樣品轉(zhuǎn)至100 ml的磨口圓底蒸餾燒瓶中，力口入15 ml蒸餾水并搖勻后安裝至冷凝回流器上；(5)置100°C水浴中冷凝回流2 h后，停止加熱并繼續(xù)通自來水將系統(tǒng)冷卻至室溫;(6)從冷凝回流器上卸下帶試樣的磨口圓底蒸餾燒瓶，將其裝到具冷凝管的蒸餾提取器上，置100°c水浴中蒸餾，冷凝管通自來水冷卻，用25 ml容量瓶收集餾分，當(dāng)餾分達(dá)20 ml時，停止蒸餾；(7)在制得的餾分中依次加入二甲基亞砜I ml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液(稱取2.5 mg尼羅紅并用5 ml丙酮溶解,再用蒸懼水定容至100 ml。)I ml,并用蒸懼水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，再利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測450-700 nm的熒光發(fā)射光譜，并獲得被測芳香植物鮮花精油_尼羅紅產(chǎn)物的特征峰(λ。)及其熒光發(fā)射光強度(I);同時，在20 ml蒸餾水中依次加入二甲基亞砜I ml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10min，進而利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測特征波長λ。處的熒光發(fā)射光強度(ΙΒ)，以此為對照；芳香植物鮮花中精油的相對熒光強度值is=1-1b。(8)分別在5只25 ml容量瓶中加入20 ml蒸餾水和I ml 二甲基亞砜，再分別加入0、2. 5、5、7. 5、10 mg三油酸甘油酯，混勻后各加入25 Pg/mL的尼羅紅溶液(稱取2. 5 mg尼羅紅并用5 ml丙酮溶解,再用蒸懼水定容至100 mL· )1 ml,并用蒸懼水定容至25 ml,充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，進而以未加三油酸甘油酯的為對照，利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測565 nm的相對熒光發(fā)射光強度值(Ικ)，以三油酸甘油酯加入量m為橫坐標(biāo)、Ie為縱坐標(biāo)，作兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性擬合方程IK=f(m)；(9)以步驟(7)中測得5種芳香植物鮮花精油的相對熒光強度值Is替代步驟(8) 線性擬合方程IK=f(m)中的Ik，通過計算即可分別求得步驟(I沖所稱M克芳香植物鮮花中精油的質(zhì)量m (單位為mg);(10)待測芳香植物鮮花中精油含量CR=(m/M) X0. 001。4、結(jié)果與分析根據(jù)實驗結(jié)果，以三油酸甘油酯加入量m為橫坐標(biāo)、Ie為縱坐標(biāo)，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程IK=81. 64m，相關(guān)系數(shù)(R2)為O. 998，實驗測得采自浙江大學(xué)芳香植物研發(fā)基地的5. 3 g代代花、8. 5 g薰衣草花、6. 4 g桅子花、5. 2 g桂花和9. 8 g中國水仙花的精油-尼羅紅產(chǎn)物特征峰入。依次在568、574、578、565和575 nm處，相對熒光強度值Is依次為8744、5486、18597、11249和1604，以它們替代線性擬合方程IK=81. 64m中的Ik，計算得到對應(yīng)的精油質(zhì)量依次為O. 107,0. 067,0. 228,0. 138和O. 020 g，因此它們的精油含量依次為2. 02%,O. 79%,3. 56%,2. 65%和O. 20%。同時，用傳統(tǒng)稱量法測上述代代花、薰衣草花、桅子花、桂花和中國水仙花的精油含量依次為1. 97%,O. 76%,3. 61%,2. 60%和O. 19%?？梢?，新建方法與傳統(tǒng)方法所得的測量結(jié)果相吻合。作為驗證的實例，我們分別選取栽培于杭州植物園公知的兩種芳香植物——白玉蘭(Magnolia denudata)和含笑(Magnoliaceae)的鮮花為試驗材料,利用本發(fā)明方法測得它們的精油含量依次為O. 21%和O. 46%，而用傳統(tǒng)稱量法測得的結(jié)果依次為O. 22%和
O.45%。該例子進一步說明本發(fā)明建立的快速測定芳香植物鮮花精油含量的方法是可行的。
權(quán)利要求
1.一種檢測芳香植物鮮花精油含量的方法，其特征在于，該方法是 先用液氮和石英沙將芳香植物鮮花充分研細(xì)，加入蒸餾水和二甲基亞砜后進行超聲處理及加熱回流，使芳香植物鮮花中的精油充分抽提至二甲基亞砜水溶液中，再通過蒸餾方式將精油分離出來，獲得精油與蒸餾水的混合液，并加入二甲基亞砜使其與精油互溶；利用尼羅紅能與芳香植物鮮花精油結(jié)合并發(fā)出特異波長熒光的特性，在含精油的二甲基亞砜水溶液中加入足量的尼羅紅，于490 nm光子激發(fā)下檢測450 700 nm的熒光發(fā)射光譜，并獲得被測芳香植物鮮花精油-尼羅紅產(chǎn)物的特征峰(λ J及其熒光發(fā)射光強度(I);將所得結(jié)果與空白樣本進行比較后，再與油脂標(biāo)準(zhǔn)品——三油酸甘油酯的熒光發(fā)射光強度曲線進行比較，通過對應(yīng)的光強度值得到被測芳香植物鮮花樣品中精油含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟 (1)稱取5 10g芳香植物鮮花放入陶瓷研缽中，加入石英沙和液氮,并用研杵將芳香植物鮮花研磨成細(xì)泥； (2)將芳香植物鮮花細(xì)泥轉(zhuǎn)至圓底離心管中，加入10ml蒸餾水和I ml 二甲基亞砜并混勻；在冰浴條件下以超聲波處理60 s ； (3)將超聲波處理后的樣品轉(zhuǎn)至圓底蒸餾燒瓶中，加入15ml蒸餾水并搖勻后安裝至冷凝回流器上；置100°C水浴中冷凝回流2 h后，停止加熱繼續(xù)通冷卻水，使系統(tǒng)冷卻至室溫； (4)卸下帶試樣的圓底蒸餾燒瓶，將其安裝到具冷凝管的蒸餾提取器上，置100°C水浴中蒸餾，冷凝管通冷卻水，用25 ml容量瓶收集餾分，當(dāng)餾分達(dá)20 ml時，停止蒸餾； (5)在制得的餾分中依次加入二甲基亞砜Iml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，再利用熒光分光光度計于490nm光子激發(fā)下檢測450 700 nm的熒光發(fā)射光譜，并獲得被測芳香植物鮮花精油-尼羅紅產(chǎn)物的特征峰(λ。)及其熒光發(fā)射光強度(I)； 同時，在20 ml蒸餾水中依次加入二甲基亞砜I ml和25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min，進而利用熒光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測特征波長λ。處的熒光發(fā)射光強度(IB)，以此為對照； 待測芳香植物鮮花中精油的相對熒光強度值Is=1-1b ； (6)分別在5只25ml容量瓶中加入20 ml蒸餾水和I ml 二甲基亞砜，再分別加入0、2. 5、5、7. 5、10 mg三油酸甘油酯，混勻后各加入25 Pg/mL的尼羅紅溶液I ml，并分別用蒸餾水定容至25 ml，充分混勻后于黑暗中40°C染色10 min ;以未加三油酸甘油酯的為對照，利用突光分光光度計于490 nm光子激發(fā)下檢測584 nm的相對突光發(fā)射光強度值(Ik),以三油酸甘油酯加入量m為橫坐標(biāo)、Ik為縱坐標(biāo)，作兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性擬合方程IE=f (m)； (7)以步驟(5)中測得芳香植物鮮花中精油的相對熒光強度值Is替代步驟(6)線性擬合方程IK=f(m)中的Ik，通過計算即可行知步驟(I)中所秤取的芳香植物鮮花中精油的質(zhì)量m，其單位為mg ;進而可算得待測芳香植物鮮花鮮花中的精油含量CR=(m/M) X0. 001。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所指芳香植物鮮花是薰衣草、代代、桅子、桂花樹或中國水仙的鮮花。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，設(shè)定超聲波發(fā)生儀頻率為20kHz，發(fā)射功率為150 W，變幅桿伸至樣品液面下2 cm，以2 s開/ I s關(guān)的間歇執(zhí)行超聲波處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，25 Pg/mL的尼羅紅溶液配制方法為，稱取.2.5 mg尼羅紅,用5 ml丙酮溶解,再用蒸懼水定容至100 ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及芳香植物育種與產(chǎn)品深加工技術(shù)，旨在提供一種檢測芳香植物鮮花含油量的方法。該方法是先充分抽提、蒸餾分離芳香植物鮮花中的精油，加入二甲基亞砜使其與精油互溶；利用尼羅紅能與芳香植物鮮花精油結(jié)合并發(fā)出特異波長熒光的特性，于490 nm光子激發(fā)下檢測450～700 nm的熒光發(fā)射光譜；將所得結(jié)果與空白樣本進行比較后，再與油脂標(biāo)準(zhǔn)品三油酸甘油酯的熒光發(fā)射光強度曲線進行比較，通過對應(yīng)的光強度值得到被測芳香植物鮮花樣品中精油含量。本方法與傳統(tǒng)的稱量法相比，原料用量少，具有更高的靈敏度和簡便性，省時省力，且可實現(xiàn)高通量測量，可為芳香植物鮮花育種、栽培、精油提取工藝等研發(fā)提供了必要的技術(shù)方法。
文檔編號G01N21/64GK103018226SQ20121057094
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者汪志平, 馬麗芳, 于金鑫, 劉新穎 申請人:浙江大學(xué)