專利名稱：毒死蜱人工半抗原、抗原、抗體及用途、半抗原合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含毒死蜱原有結(jié)構(gòu)的化合物作為毒死蜱半抗原，以此半抗原制成的抗原、特異性抗體；以及此類半抗原、抗原、特異性抗體的用途，和半抗原的合成方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及有機合成，免疫化學(xué)及生物化學(xué)等，依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和生物技術(shù)手段，設(shè)計、合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和易被檢測識別的標(biāo)記物的放大作用，定量地檢測樣本中超微量小分子目標(biāo)分析物，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價等特點，該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計、合成和人工全抗原及抗體的制備，因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性以及如何通過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性是該領(lǐng)域極為重要的研究內(nèi)容，這一技術(shù)目前已成為農(nóng)藥殘留痕量分析研究的一個嶄新領(lǐng)域，被列為當(dāng)前優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)，世界糧農(nóng)組織(FAO)已向許多國家推薦此項技術(shù)，美國化學(xué)將免疫分析與氣相色譜，液相色譜共同列為農(nóng)藥殘留分析的支柱技術(shù)。
免疫學(xué)基本原理認(rèn)為抗原抗體的免疫反應(yīng)涉及分子間的立體結(jié)構(gòu)，電荷、氫鍵及范德華引力作用等多種因素，具有極高特異性和靈敏性，遵循質(zhì)量作用定律，不僅可在體內(nèi)進(jìn)行，也可體外進(jìn)行，這些特點使其能被利用建立免疫分析方法，可達(dá)到傳統(tǒng)理化分析技術(shù)無法達(dá)到的選擇性和靈敏度。并且，快速、簡便，適于檢測生物大分子，也可以檢測復(fù)雜樣本中小分子如農(nóng)藥等痕量組分，然而，與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點1)分子量小于1000道爾頓的小分子化合物一般不具有免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生特異性抗體。絕大多數(shù)農(nóng)藥等小分子物質(zhì)不具備與大分子載體如蛋白質(zhì)等連接的基團，如-COOH、-NH2、-OH、-SH等官能團，因此，必須合成突出分子立體結(jié)構(gòu)特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構(gòu)成有效的人工結(jié)合物，才能免疫動物產(chǎn)生針對這一目標(biāo)小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結(jié)合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結(jié)合位點、結(jié)合方式、載體種類及半抗原與目標(biāo)分析物質(zhì)任何結(jié)構(gòu)上的差異，諸如分子大小、形狀、成份、構(gòu)型、構(gòu)象、極性、電子云密度等等在內(nèi)的拓?fù)湫哉?，都可能極大地影響著相應(yīng)抗體的性質(zhì)。因此，它是決定產(chǎn)生其特異性抗體質(zhì)量和建立免疫化學(xué)分析方法的關(guān)鍵。
2)雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應(yīng)原性，即具有與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的能力，并可體外定量進(jìn)行，遵循質(zhì)量作用定律。如引入標(biāo)記物放大顯示這一反應(yīng)，則其既具有免疫反應(yīng)的特異性和靈敏性，又具有標(biāo)記物易被識別和檢測的雙重特征，可分析環(huán)境、食品、人體液等復(fù)雜樣本中超微量小分子化合物，具有較好的選擇性，靈敏度。操作簡單快速、成本低廉。
3)基于抗原抗體免疫反應(yīng)檢測小分子化合物的分析技術(shù)目前多采用酶免疫分析(EIA)。EIA利用酶促反應(yīng)顯示抗原抗體的定量結(jié)合，操作簡單，又具有相當(dāng)?shù)撵`敏度，近年來發(fā)展很快。這些技術(shù)使農(nóng)藥殘留分析在方法上獲得更大的生命力，對快速分析缺乏檢測活性或樣本基質(zhì)過于復(fù)雜，因而用普通理化方法難以分析的農(nóng)藥殘留，具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用價值。
影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的選擇性(或特異性)與親和性，這些性質(zhì)又決定于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此，免疫半抗原的分子設(shè)計與合成是建立小分子免疫化學(xué)分析的關(guān)鍵步驟。分子是構(gòu)成物質(zhì)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，化合物內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)特征及分子間的組合方式等結(jié)構(gòu)信息決定了化合物所表現(xiàn)的性質(zhì)，也就是說，化合物的理化性質(zhì)，生物活性及免疫原性等都是以分子為主體來表示和解釋的。拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)直接產(chǎn)生于化合物的分子結(jié)構(gòu)，它是從化合物分子結(jié)構(gòu)的直觀概念出發(fā)采用圖論的方法以數(shù)量來表征分子結(jié)構(gòu)，如Winer指數(shù)，Randic指數(shù)，Hosoya指數(shù)和Balaban指數(shù)等。這些拓?fù)渲笖?shù)可以反應(yīng)分子中鍵的性質(zhì)，原子間的結(jié)合順序，分支的多少及分子的形狀等拓?fù)湫畔?，根?jù)這些信息，就可能推測出分子的某些性質(zhì)、活性。在拓?fù)鋵W(xué)方法中，目前最為常用的是分子連接性指數(shù)法(MCI)，它是由Kier和Hall等人根據(jù)拓?fù)淅碚?，在Randic分支指數(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的拓?fù)浞椒ǎㄟ^對分子中各原子點價(δ)的計算得到MCI指數(shù)。由于該法完全以分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，并且有計算簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點，MCI法已被廣泛地應(yīng)用于有機物理化參數(shù)(如Kow，S)，環(huán)境參數(shù)(如Koc，BCF)以及生物毒性的預(yù)測中。但是，當(dāng)所研究化合物的種類比較復(fù)雜，不僅包括疏水性物質(zhì)還包括有親水性物質(zhì)時，僅用簡單的連接性指數(shù)往往不能得到滿意的結(jié)果。非色散力因子(ΔXV)是由簡單分子連接性指數(shù)演化而來，Bahnick等成功地應(yīng)用ΔXV對大量不同種類有機物質(zhì)的Koc值進(jìn)行了預(yù)測，張育紅等也應(yīng)用ΔXV對部分取代芳烴對綠藻的毒性進(jìn)行了成功的預(yù)測。然而，將MCI法和非色散力因子(ΔXV)應(yīng)用于農(nóng)藥半抗原分子設(shè)計及其免疫識別預(yù)測能力方面的研究還沒有見報道。
目前，尚未有專門關(guān)于半抗原分子設(shè)計及其免疫識別機制研究的論述或?qū)Ｖ?。一般而論，半抗原的分子設(shè)計應(yīng)考慮兩方面的因素第一，能否刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答；第二，產(chǎn)生的抗體能否具有預(yù)期的活性，即其免疫識別能否達(dá)到預(yù)期的效果。“理想的”半抗原首先應(yīng)包括盡可能多的待測分析物的特征化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，如果特征化學(xué)結(jié)構(gòu)稍有變化或缺失，將對人工抗原和相應(yīng)抗體的特異性反應(yīng)產(chǎn)生重大影響；其次，“理想的”半抗原應(yīng)有一個便于抗體對靶結(jié)構(gòu)識別的柄(或間隔臂)，以便分子的特異性結(jié)構(gòu)能夠得到最大限度暴露于載體表面，從而保留特異性，對于間隔臂通常應(yīng)考慮其長度、極性和位置。機體的免疫系統(tǒng)對載體遠(yuǎn)端的半抗原結(jié)構(gòu)部分識別最強，所以在免疫半抗原分子的設(shè)計中間隔臂的位置(或位點)的選擇十分重要；最后，“理想的”半抗原應(yīng)具有與載體蛋白質(zhì)等偶聯(lián)的功能團，如-COOH、-NH2、-OH、-SH等官能團?？傮w上講，不同的農(nóng)藥，半抗原分子設(shè)計是不同的，同一種農(nóng)藥，半抗原的分子設(shè)計也可以從多種“位點”出發(fā)，設(shè)計出不同結(jié)構(gòu)的半抗原，分別制備出相應(yīng)的多克隆抗體，因為半抗原結(jié)構(gòu)不同，制備出的抗體對同一種農(nóng)藥的識別也不同。
就半抗原分子的免疫識別機制而言，一般從以下幾個方面來進(jìn)行評價1)同源分析(Homologous Assays)，即用同一種半抗原制備的人工抗原與相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫分析。針對同一種農(nóng)藥，不同半抗原分子設(shè)計模式所得的抗體與抗原在相同條件下反應(yīng)，抑制該反應(yīng)所需的農(nóng)藥量越少，則此種抗體對待分析的農(nóng)藥親和力越大，它對待分析的農(nóng)藥的特異性越強，即該半抗原分子設(shè)計模式最佳。
2)異源分析(Heterologous Assays)，即用同一種分析物不同的半抗原所得的抗體分別與不同半抗原所制備的人工抗原進(jìn)行免疫分析。1991年，Harrison等指出，在競爭反應(yīng)條件相同時，異源分析有助于提高免疫化學(xué)分析的靈敏度。1995年Marco等研究指出，適當(dāng)?shù)漠愒捶治隹梢詮娜齻€不同的方面來進(jìn)行分析，即半抗原本身、位點及間隔臂長度，來考查它們識別半抗原與待測農(nóng)藥的能力。
3)特異性分析(Specificity Assays)，結(jié)合同源分析，選擇親和力較強的抗體，建立交叉反應(yīng)分析，如果待測農(nóng)藥的抑制中濃度越小，則它的特異性越強。
毒死蜱[chlorpyrifos，O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯]，商品名為毒死蜱，樂斯本等，1965年由Dow Chemical Company推廣使用的一種高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟作物的害蟲防治。它對哺乳動物毒性中等，但對非靶標(biāo)水生生物毒性較高。由于毒死蜱廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，在糧食等作物上引起的殘留問題已有所報道。而且，環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)毒死蜱殘留的情況也日趨嚴(yán)重，對人們的健康構(gòu)成了潛在的威脅。因此，隨著人們對毒死蜱殘留的毒性與環(huán)境風(fēng)險的日益關(guān)注，急需更科學(xué)、快捷和高效的檢測手段。
農(nóng)藥小分子必須與大分子物質(zhì)連接后才能刺激動物產(chǎn)生特異性抗體，這已成為小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成與鑒定試驗是產(chǎn)生特異性抗體和建立農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。理想的半抗原一方面應(yīng)具備待測物的特征結(jié)構(gòu)，特別是立體化學(xué)特征，另一方面半抗原與載體連接后應(yīng)保證待測物的特征結(jié)構(gòu)能最大程度地為免疫活性細(xì)胞識別和結(jié)合，以制備出具有預(yù)期選擇性的抗體。①半抗原通常由待測物衍生化制備，或由原料合成，待測物的代謝或降解產(chǎn)物往往是有用的半抗原；②除待測物特征結(jié)構(gòu)外，在半抗原的未端需有可直接或間接與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的活性基團；③在活性基團與載體之間，必須有一定長度的間隔臂，以便使半抗原突出于載體表面，易為有機免疫系統(tǒng)識別；④間隔臂應(yīng)遠(yuǎn)離待測物的特征結(jié)構(gòu)部分和官能團；⑤半抗原的設(shè)計應(yīng)考慮到農(nóng)藥原藥和有毒理學(xué)意義的代謝物，以及測定對象是單一的農(nóng)藥或某一類農(nóng)藥；⑥機體的免疫應(yīng)答是個十分復(fù)雜的生化過程，半抗原誘導(dǎo)的抗體的選擇性和親合性尚難預(yù)測，多數(shù)情況下宜合成幾種結(jié)構(gòu)的半抗原進(jìn)行研究。
本單位申請的申請?zhí)枮?3114897.2的專利，最低檢測限僅為0.01ppm，靈敏度不是太高，實際使用時，容易造成被檢樣本結(jié)果的假陰性，且抗體的特異性不是很高。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能最大程度保留了毒死蜱的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又具有可調(diào)節(jié)長度的連接臂的半抗原以及這種半抗原的合成方法；以此半抗原制備的抗原、檢測靈敏度高和特異性強的抗體；以及此類半抗原、抗體的用途。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種毒死蜱人工半抗原，它的分子結(jié)構(gòu)式為
其中n＝1～10。
優(yōu)選的毒死蜱人工半抗原分子結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明的半抗原以三氯硫磷為起始原料，先與無水乙醇反應(yīng)生成O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)，再與毒死蜱中間體吡啶酚反應(yīng)生成O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)，最后與氨基酸反應(yīng)生成毒死蜱半抗原(n+1)-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-(n+1)酸(簡稱CH-Hap)。反應(yīng)式如下
本發(fā)明的毒死蜱半抗原化合物(CH-Hap)的合成方法進(jìn)一步描述如下1)、三氯硫磷(PSCl3)與無水乙醇，采用先滴加后反應(yīng)的步驟反應(yīng)1～10小時生成化合物O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)，其中三氯硫磷與無水乙醇的克分子比為1∶1～10，滴加溫度為-30～0℃，反應(yīng)溫度為-20～15℃。反應(yīng)中嚴(yán)格控制滴加速度，使反應(yīng)液溫度不超過0℃。反應(yīng)完畢后用蒸餾水洗滌反應(yīng)液，分出油層用無水硫酸鈉干燥、減壓蒸餾收集65-75℃的餾分，即為CHM-1。
2)、化合物CHM-1與3，5，6-三氯毗啶-2-酚在極性溶劑、縛酸劑存在下反應(yīng)生成化合物O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)，投料比CHM-1∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶0.5～1∶3(克分子比)，反應(yīng)溫度為-20～30℃，反應(yīng)時間為0.5～3.0小時。
3)、(n+1)-氨基酸溶解于堿性溶液中，攪拌下緩慢加入溶解于極性溶劑的CHM-2溶液，滴加NaOH水溶液，反應(yīng)生成化合物毒死蜱半抗原(n+1)-
-(n+1)酸(Ch-Hap)，(n+1)-氨基酸與CHM-2的克分子比為1∶0.5～6，反應(yīng)溫度為-10～40℃，反應(yīng)時間為1～5小時。
上述方法制得的毒死蜱半抗原，具有毒死蜱特征結(jié)構(gòu)同時又具有可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-COOH結(jié)構(gòu)，分子式如下 其中n＝1～10。
作為本發(fā)明的毒死蜱半抗原的合成方法的改進(jìn)步驟2)中所述縛酸劑是吡啶、三乙胺(TEA)、N，N-二甲基苯胺、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、或碳酸鉀所述極性溶劑是低級鏈醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃、丙酮、二氧六環(huán)或吡啶。步驟3)中反應(yīng)完成后，滴加NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為8～12，然后用石油醚洗滌，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH在2～7，用極性溶劑提取，再將所述提取液進(jìn)行濃縮。
作為本發(fā)明的毒死蜱半抗原的合成方法的進(jìn)一步改進(jìn)將步驟3)所得的毒死蜱半抗原(n+1)-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶。
本發(fā)明還提供了一種依靠上述毒死蜱人工半抗原制得的毒死蜱人工抗原，它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～10。
優(yōu)選毒死蜱人工抗原分子結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明還提供了一種毒死蜱特異性抗體，是用分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～10的毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。
本發(fā)明同時提供了上述毒死蜱半抗原的用途，是用作動物免疫的抗原體系的原料。
本發(fā)明同時提供了上述毒死蜱特異性抗體的用途，用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量。
環(huán)境樣品為土壤樣品或水樣品。
基于毒死蜱吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)可能是其活性官能團，以三氯硫磷等為原料，經(jīng)過三步反應(yīng)，分別與2-氨基乙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸和9-氨基壬酸反應(yīng)，引入不同的“連接臂”合成了半抗原2-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-乙酸(簡稱CHAc)、半抗原4-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-丁酸(簡稱CHBu)、半抗原6-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-己酸(簡稱CHHe)和半抗原9-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-壬酸(簡稱CHNe)最大可能保留了原來毒死蜱的分子結(jié)構(gòu)，使毒死蜱分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與電子分布幾乎不受影響，這為獲得對毒死蜱有高度特異性的抗體提供了保證。
本發(fā)明的毒死蜱半抗原的設(shè)計的位點在毒死蜱分子結(jié)構(gòu)中-OC2H5位置，把-OC2H5通過化學(xué)合成改造成-NH(CH2)nCOOH，使其具有一定的可長可短的連接臂(通過控制n的大小)，同時又具有可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-COOH。本發(fā)明中合成的毒死蜱半抗原化合物為國內(nèi)外首創(chuàng)的新化合物，既最大程度地保留了毒死蜱的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又具有可調(diào)節(jié)長度的連接臂，用這一系列半抗原制備的免疫抗原去免疫動物，所得的抗體的效價、特異性、親和力都比較好，尤其是n＝3時，所得的抗體用于ELISA方法檢測毒死蜱，最低檢測限可達(dá)0.4ug/L(0.0004ppm)，與其他有機磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率低。與申請?zhí)枮?3114897.2的專利中最低檢測限為0.01ppm相比，最低檢測限大大降低，靈敏度明顯提高。
具體實施例方式
實施例1一種毒死蜱人工半抗原，分子結(jié)構(gòu)式為(此時n＝3) 是用作動物免疫的抗原體系的原料。
由上述毒死蜱人工半抗原制成的一種毒死蜱人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為
一種毒死蜱特異性抗體，是將上述毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量；環(huán)境樣品為土壤樣品或水樣品。
上述毒死蜱人工半抗原、抗原、抗體制作方法如下1、O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)的合成稱取三氯硫磷(PSCl3)68g(約0.4mol)置于帶有低溫溫度計的三口燒瓶中，以冰鹽水浴將其冷卻至-10～-5℃，在劇烈攪拌下滴加入無水乙醇55g(約1.2mol)，嚴(yán)格控制滴加速度，使反應(yīng)液溫度始終處于-30～0℃。滴加完畢后在-20～10℃繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完，以(0±5)℃蒸餾水洗滌反應(yīng)液(100ml×2)，分出油層并以無水Na2SO4干燥，再經(jīng)水泵減壓蒸餾，收集65～75℃餾分，得到51.8g無色透明油狀液體(收率72.3％，以三氯硫磷計)。
2、O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)的合成稱取CHM-1 0.05mol(約18.8g)置于250ml三口燒瓶中，按照投料比CHM-1∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶1，在攪拌下加入3，5，6-三氯吡啶-2-酚0.05mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml DCM。待固體全部溶解后，用冰水浴將該溶液降溫至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，繼續(xù)反應(yīng)1h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，振蕩后分出水層，油層以冰水洗滌至中性，再經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得少量棕色油狀物，該油狀物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再減壓濃縮，得8.35g黃色液體(收率40.9％，以三氯吡啶酚計)。
3、毒死蜱半抗原4-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-丁酸(簡稱CHBu)的合成(n＝3)稱取1.03g(約10mmol)4-氨基丁酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口燒瓶中，冰水浴冷卻至0-10℃，攪拌下緩慢加入3.41g(約10mmol)溶解于10ml二氧六環(huán)的CHM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)。保溫反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH約為8～10。再用石油醚洗滌上述混合液(40ml×2)，棄石油醚層，以2mol/L HCl調(diào)節(jié)水相pH約為3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗滌后經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，殘余物于4℃密封存放過夜，有無色晶體析出。以乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，過濾，干燥，得1.33g白色固體(收率32.6％，以4-氨基丁酸計)。
產(chǎn)物(CHBu)的鑒定取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ES和1H-NMR測定其分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜(MS，+c ESI)測定結(jié)果m/z為407，相對豐度100％，應(yīng)為CHBu的準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+；右側(cè)m/z為409，相對豐度94％的峰，應(yīng)為CHBu分子的氯原子同位素峰；m/z為429，相對豐度50％，應(yīng)為CHBu分子加Na+形成的離子峰[M+23]+；右測m/z為431，相對豐度45％，應(yīng)為CHBu分子的氯原子加Na+形成的同位素離子峰。
核磁共振(1H-NMR，400MHz，CDCl3)試驗結(jié)果δ7.85(s，1H，ArH)；4.38～4.30(q+q，2H，CH2O)，δ3.54(m，1H，NH)，δ3.25～3.24(m，2H，NCH2)，δ2.53～2.49(t，2H，OOCCH2)，δ1.94～1.87(m，2H，CH2)，δ1.42～1.39(t，3H，CH3)。
4、免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將50～80微摩爾半抗原CHBu，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下反應(yīng)過夜后，離心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，加入時應(yīng)緩慢，然后在伴有磁力攪拌情況下反應(yīng)4～6小時，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原的鑒定按合成毒死蜱免疫抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHBu-BSA在287nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHBu、BSA的最大吸收峰(CHBu、BSA分別為290nm、278nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHBu-BSA的合成是成功的。
經(jīng)計算結(jié)果如下半抗原CHBu與BSA的結(jié)合比為14.6∶1。
5、包被抗原的合成包被抗原的合成利用混合酸酐法。將50～80微摩爾半抗原CHBu，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，讓其在室溫下反應(yīng)1小時后，取500～800μL反應(yīng)液加入到4～8mL15～20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，加入時應(yīng)緩慢，然后在伴有磁力攪拌情況下反應(yīng)2～6小時，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原的鑒定按合成毒死蜱包被抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHBu-OVA在284nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHBu、OVA的最大吸收峰(CHBu、OVA分別為290nm、279nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHBu-OVA的合成是成功的。
經(jīng)計算結(jié)果如下半抗原CHBu與OVA的結(jié)合比為6.2∶1。
6、抗體的制備免疫動物制備抗血清實驗選用半周歲左右，體重為2～3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三只兔子(由浙江省中醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)兔子的飼養(yǎng)工作)，分別編號為兔子1～3。
實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.5～1.0mg/kg，加強免疫劑量為1.0～1.5mg/kg，用生理鹽水稀釋適量CHBu-BSA，加入等體積弗氏完全佐劑(加強免疫時采用弗氏不完全佐劑)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。背部皮下免疫6點，大腿肌肉注射2點，3周后進(jìn)行加強免疫，以后每隔2周再次加強免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后第8天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。
待免疫血清效價上去后，就可進(jìn)行采血。本實驗采用心臟取血法。采血后，將采血瓶放置于37℃溫箱中半小時，待瓶中的血液凝固，然后用接種針沿瓶內(nèi)壁將血塊與玻璃脫離，再放到4℃冰箱中3～4小時，待血塊收縮后，用毛細(xì)吸管將血清吸入試管中，離心，分離出血清。
抗體的純化一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。最后將抗體制成凍干粉，分裝，-20℃保存。
抗血清效價測定免疫原復(fù)合物按常規(guī)方法免疫了三只兔子。從加強免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價。第5次免疫后，兔子獲得了高效價的抗體，抗血清的效價為1∶51200(指OD490nm值等于1.0)。
抗體的特異性用具有多種抗原決定簇的免疫原(蛋白質(zhì)或多肽)制備的抗體，其中含的抗體分子往往是混合體。當(dāng)有甲、乙兩種抗原，其分子結(jié)構(gòu)中具有相同或部分相同的抗原決定簇時，甲抗原可與乙抗原的抗體反應(yīng)，而乙抗原也可與甲抗原抗體反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)?？贵w的特異性就是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該抗原類似物結(jié)合能力的比較。常用交叉反應(yīng)活性作為評價的重要標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越好。
將特異性抗原及其類似物做系列稀釋，分別與同一種CHBu-BSA抗體，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50％的劑量和類似物抑制率50％時的用量。然后計算出各類似物的交叉反應(yīng)率。
抗CHBu-BSA抗體對各類似物的交叉反應(yīng)率三氯吡啶酚為＜0.01％，對硫磷為1.9％，溴硫磷為19％，甲基毒死蜱為121％，殺螟硫磷為1.6％，馬拉硫磷為＜0.01％。由此可知，除甲基毒死蜱以外，所制備的抗體的特異性均較強。
實施例2一種毒死蜱人工半抗原，分子結(jié)構(gòu)式為(此時n＝5)
由上述毒死蜱人工半抗原制成的一種毒死蜱人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為 一種毒死蜱特異性抗體，是將上述毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量；環(huán)境樣品為土壤樣品或水樣品。
上述毒死蜱人工半抗原、抗原、抗體制作方法如下1、O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)的合成稱取三氯硫磷(PSCl3)68g(約0.4mol)置于帶有低溫溫度計的三口燒瓶中，以冰鹽水浴將其冷卻至-10～-5℃，在劇烈攪拌下滴加入無水乙醇92g(約2.0mol)，嚴(yán)格控制滴加速度，使反應(yīng)液溫度始終處于-30～0℃。滴加完畢后在-20～10℃繼續(xù)反應(yīng)5h。反應(yīng)完后，以(0±5)℃蒸餾水洗滌反應(yīng)液(100ml×2)，分出油層并以無水Na2SO4干燥，再經(jīng)水泵減壓蒸餾，收集65～75℃餾分，得到57.0g無色透明油狀液體(收率79.53％，以三氯硫磷計)。
2、O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)的合成稱取CHM-1 0.05mol(約18.8g)置于250ml三口燒瓶中，按照投料比CHM-1∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶2，在攪拌下加入3，5，6-三氯吡啶-2-酚0.1mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml DCM。待固體全部溶解后，用冰水浴將該溶液降溫至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，振蕩后分出水層，油層以冰水洗滌至中性，再經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得少量棕色油狀物，該油狀物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再減壓濃縮，得9.12g黃色液體(收率45％，以三氯吡啶酚計)。
3、毒死蜱半抗原6-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-己酸(簡稱CHHe，n＝5)合成稱取1.31g(約10mmol)6-氨基己酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口燒瓶中，冰水浴冷卻至0-10℃，攪拌下緩慢加入6.82g(約20mmol)溶解于10ml二氧六環(huán)的CHM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)。在5～10℃下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH約為8～10。再用石油醚洗滌上述混合液(40ml×2)，棄石油醚層，以2mol/L HCl調(diào)節(jié)水相pH約為3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗滌后經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，殘余物于4℃密封存放過夜，有無色晶體析出。以乙酸乙酯—石油醚重結(jié)晶，過濾，干燥，得1.38g白色固體(收率31.8％，以6-氨基己酸計)。
半抗原(CHHe)的鑒定質(zhì)譜(MS，+c ESI)測定結(jié)果m/z為435，相對豐度100％，應(yīng)為CHHe的準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+；右側(cè)m/z為437，相對豐度94％的峰，應(yīng)為CHHe分子的氯原子同位素峰。
4、人工免疫抗原的制備同實施例1。
免疫抗原的鑒定按合成毒死蜱免疫抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHHe-BSA在286nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHHe、BSA的最大吸收峰(CHHe、BSA分別為290nm、278nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗CHHe-BSA的合成是成功的。
半抗原CHHe與BSA的結(jié)合比為11∶1。
5、人工包被抗原的制備同實施例1。
包被抗原的鑒定按合成毒死蜱包被抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHHe-OVA在283nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHHe OVA的最大吸收峰(CHHe、OVA分別為290nm、279nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHHe-OVA的合成是成功的。
半抗原CHHe與OVA的結(jié)合比為5.1∶1。
6、抗體的制備方法同實施例1。
所得兔子抗血清的效價為1∶51200(指OD490nm值等于1.0)。
抗CHHe-BSA抗體對各類似物的交叉反應(yīng)率三氯吡啶酚為0.03％，對硫磷為0.87％，溴硫磷為23％，甲基毒死蜱為180％，殺螟硫磷為0.31％，馬拉硫磷為＜0.01％。
由此可知，除甲基毒死蜱以外，所制備的抗體的特異性均較強。
實施例3一種毒死蜱人工半抗原，分子結(jié)構(gòu)式為(此時n＝1) 是用作動物免疫的抗原體系的原料。
由上述毒死蜱人工半抗原制成的一種毒死蜱人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為 一種毒死蜱特異性抗體，是將上述毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量；環(huán)境樣品為土壤樣品或水樣品。
上述毒死蜱人工半抗原、抗原、抗體制作方法如下1、O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)的合成稱取三氯硫磷(PSCl3)68g(約0.4mol)置于帶有低溫溫度計的三口燒瓶中，以冰鹽水浴將其冷卻至-10～-5℃，在劇烈攪拌下滴加入無水乙醇18.4g(約0.4mol)，嚴(yán)格控制滴加速度，使反應(yīng)液溫度始終處于-30～0℃。滴加完畢后在-20～10℃繼續(xù)反應(yīng)1h。反應(yīng)完，以(0±5)℃蒸餾水洗滌反應(yīng)液(100ml×2)，分出油層并以無水Na2SO4干燥，再經(jīng)水泵減壓蒸餾，收集65～75℃餾分，得到28.5g無色透明油狀液體(收率40％，以三氯硫磷計)。
2、O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)的合成稱取CHM-1 0.05mol(約18.8g)置于250ml三口燒瓶中，按照投料比CHM-1∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶0.5，在攪拌下加入3，5，6-三氯吡啶-2-酚0.025mol，再加入15～30mlTEA和80～120ml DCM。待固體全部溶解后，用冰水浴將該溶液降溫至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，繼續(xù)反應(yīng)0.5h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，振蕩后分出水層，油層以冰水洗滌至中性，再經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得少量棕色油狀物，該油狀物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再減壓濃縮，得6.67g黃色液體(收率32.76％，以三氯吡啶酚計)。
3、毒死蜱半抗原2-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-乙酸(簡稱CHAc)的合成(n＝1)稱取0.75g(約10mmol)2-氨基乙酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口燒瓶中，冰水浴冷卻至0-10℃，攪拌下緩慢加入1.705g(約5mmol)溶解于10ml二氧六環(huán)的CHM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)，在10～20℃下反應(yīng)1h。然后加入50ml 5％NaOH冰水溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH約為8～10。再用石油醚洗滌上述混合液(40ml×2)，棄石油醚層，以2mol/L HCl調(diào)節(jié)水相pH約為3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗滌后經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，殘余物于4℃密封存放過夜，有無色晶體析出。以乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，過濾，干燥，得1.30g白色固體(收率34.2％，以2-氨基乙酸計)。
產(chǎn)物(CHAc)的鑒定取上述合成的產(chǎn)物分別經(jīng)ESI測定其分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜(MS，+c ESI)測定結(jié)果m/z為379，相對豐度100％，應(yīng)為CHAc的準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+；右側(cè)m/z為381，相對豐度94％的峰，應(yīng)為CHAc分子的氯原子同位素峰；m/z為401，相對豐度50％，應(yīng)為CHAc分子加Na+形成的離子峰[M+23]+；右測m/z為403，相對豐度45％，應(yīng)為CHAc分子的氯原子加Na+形成的同位素離子峰。
4、免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將50～80微摩爾半抗原CHAc，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，讓其在室溫下反應(yīng)過夜后，離心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，加入時應(yīng)緩慢，然后在伴有磁力攪拌情況下反應(yīng)4～6小時，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原的鑒定按合成毒死蜱免疫抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHAc-BSA在288nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHAc、BSA的最大吸收峰(CHAc、BSA分別為290nm、278nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHAc-BSA的合成是成功的。
經(jīng)計算結(jié)果如下半抗原CHAc與BSA的結(jié)合比為12.1∶1。
5、包被抗原的合成包被抗原的合成利用混合酸酐法。將50～80微摩爾半抗原CHAc，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，讓其在室溫下反應(yīng)1小時后，取500～800μL反應(yīng)液加入到4～8mL 15～20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，加入時應(yīng)緩慢，然后在伴有磁力攪拌情況下反應(yīng)2～6小時，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.8～0.9％生理鹽水透析，分裝保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原的鑒定按合成毒死蜱包被抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHAc-OVA在285nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHAc、OVA的最大吸收峰(CHAc、OVA分別為290nm、279nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHAc-OVA的合成是成功的。
經(jīng)計算結(jié)果如下半抗原CHAc與OVA的結(jié)合比為5.7∶1。
6、抗體的制備免疫動物制備抗血清實驗選用半周歲左右，體重為2～3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三只兔子(由浙江省中醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)兔子的飼養(yǎng)工作)，分別編號為兔子1～3。
實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.5～1.0mg/kg，加強免疫劑量為1.0～1.5mg/kg，用生理鹽水稀釋適量CHBu-BSA，加入等體積弗氏完全佐劑(加強免疫時采用弗氏不完全佐劑)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。背部皮下免疫6點，大腿肌肉注射2點，3周后進(jìn)行加強免疫，以后每隔2周再次加強免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后第8天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。
待免疫血清效價上去后，就可進(jìn)行采血。本實驗采用心臟取血法。采血后，將采血瓶放置于37℃溫箱中半小時，待瓶中的血液凝固，然后用接種針沿瓶內(nèi)壁將血塊與玻璃脫離，再放到4℃冰箱中3～4小時，待血塊收縮后，用毛細(xì)吸管將血清吸入試管中，離心，分離出血清。
抗體的純化一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。最后將抗體制成凍干粉，分裝，-20℃保存。
抗血清效價測定免疫原復(fù)合物按常規(guī)方法免疫了三只兔子。從加強免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價。第5次免疫后，兔子獲得了高效價的抗體，抗血清的效價為1∶12800(指OD490nm值等于1.0)。
抗體的特異性用具有多種抗原決定簇的免疫原(蛋白質(zhì)或多肽)制備的抗體，其中含的抗體分子往往是混合體。當(dāng)有甲、乙兩種抗原，其分子結(jié)構(gòu)中具有相同或部分相同的抗原決定簇時，甲抗原可與乙抗原的抗體反應(yīng)，而乙抗原也可與甲抗原抗體反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)?？贵w的特異性就是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該抗原類似物結(jié)合能力的比較。常用交叉反應(yīng)活性作為評價的重要標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越好。
將特異性抗原及其類似物做系列稀釋，分別與同一種CHAc-BSA抗體，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在曲線上找出抑制率50％的劑量和類似物抑制率50％時的用量。然后計算出各類似物的交叉反應(yīng)率。
抗CHAc-BSA抗體對各類似物的交叉反應(yīng)率三氯吡啶酚為0.06％，對硫磷為3.8％，溴硫磷為27％，甲基毒死蜱為158％，殺螟硫磷為2.3％，馬拉硫磷為＜0.01％。由此可知，除甲基毒死蜱以外，所制備的抗體的特異性均較強。
實施例4一種毒死蜱人工半抗原，分子結(jié)構(gòu)式為(此時n＝8) 由上述毒死蜱人工半抗原制成的一種毒死蜱人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為 一種毒死蜱特異性抗體，是將上述毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量；環(huán)境樣品為土壤樣品或水樣品。
上述毒死蜱人工半抗原、抗原、抗體制作方法如下1、O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)的合成稱取三氯硫磷(PSCl3)68g(約0.4mol)置于帶有低溫溫度計的三口燒瓶中，以冰鹽水浴將其冷卻至-10～-5℃，在劇烈攪拌下滴加入無水乙醇166g(約3.6mol)，嚴(yán)格控制滴加速度，使反應(yīng)液溫度始終處于-30～0℃。滴加完畢后在-20～10℃繼續(xù)反應(yīng)9h。反應(yīng)完，以(0±5)℃蒸餾水洗滌反應(yīng)液(100ml×2)，分出油層并以無水Na2SO4干燥，再經(jīng)水泵減壓蒸餾，收集65～75℃餾分，得到62.16g無色透明油狀液體(收率86.8％，以三氯硫磷計)。
2、O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)的合成稱取CHM-1 0.05mol(約18.8g)置于250ml三口燒瓶中，按照投料比CHM-1∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶3，在攪拌下加入3，5，6-三氯吡啶-2-酚0.15mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml DCM。待固體全部溶解后，用冰水浴將該溶液降溫至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，繼續(xù)反應(yīng)3h。反應(yīng)完畢后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，振蕩后分出水層，油層以冰水洗滌至中性，再經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，得少量棕色油狀物，該油狀物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再減壓濃縮，得10.02g黃色液體(收率49.1％，以三氯吡啶酚計)。
3、毒死蜱半抗原9-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-壬酸(簡稱CHNe，n＝8)合成稱取1.73g(約10mmol)9-氨基壬酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口燒瓶中，冰水浴冷卻至0-10℃，攪拌下緩慢加入17.05g(約50mmol)溶解于10ml二氧六環(huán)的CHM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)。在20～30℃下反應(yīng)5h。反應(yīng)完畢后，加入5％NaOH冰水溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH約為8～10。再用石油醚洗滌上述混合液(40ml×2)，棄石油醚層，以2mol/LHCl調(diào)節(jié)水相pH約為3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗滌后經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮，殘余物于4℃密封存放過夜，有無色晶體析出。以乙酸乙酯—石油醚重結(jié)晶，過濾，干燥，得1.30g白色固體(收率27.3％，以9-氨基壬酸計)。
半抗原(CHNe)的鑒定質(zhì)譜(MS，+c ESI)測定結(jié)果m/z為477，相對豐度100％，應(yīng)為CHNe的準(zhǔn)分子離子峰[M+1]+；右側(cè)m/z為479，相對豐度94％的峰，應(yīng)為CHNe分子的氯原子同位素峰。
4、人工免疫抗原的制備同實施例3。
免疫抗原的鑒定按合成毒死蜱免疫抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHNe-BSA在285nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHNe、BSA的最大吸收峰(CHNe、BSA分別為290nm、278nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗CHNe-BSA的合成是成功的。
半抗原CHNe與BSA的結(jié)合比為9.3∶1。
5、人工包被抗原的制備同實施例3。
包被抗原的鑒定按合成毒死蜱包被抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結(jié)合比。偶聯(lián)物CHNe-OVA在282nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與CHNe OVA的最大吸收峰(CHNe、OVA分別為290nm、279nm)相比，發(fā)生了明顯的變化，表明人工抗原CHNe-OVA的合成是成功的。
半抗原CHNe與OVA的結(jié)合比為4.8∶1。
6、抗體的制備方法同實施例3。
所得3只兔子抗血清的效價為1∶6400(指OD490nm值等于1.0)。
抗CHNe-BSA抗體對各類似物的交叉反應(yīng)率三氯吡啶酚為0.11％，對硫磷為5.7％，溴硫磷為17％，甲基毒死蜱為89％，殺螟硫磷為3.6％，馬拉硫磷為＜0.01％。由此可知，除甲基毒死蜱以外，所制備的抗體的特異性均較強。
實施例5毒死蜱酶聯(lián)免疫吸附測定方法建立與鑒定因為用n＝1，3，5，8時四種不同連接臂長的毒死蜱半抗原制備的免疫抗原去免疫兔子得到的四種抗體相比較，從抗體的效價、特異性來看，n＝3，5時比n＝1，8時得到的抗體比較好，可以用于進(jìn)一步建立毒死蜱ELISA測定方法，所以本專利就這兩種抗體進(jìn)一步研究建立了毒死蜱ELISA測定方法。
1、毒死蜱ELISA測定方法的建立及其工作條件和基本參數(shù)采用直接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。其測定原理已作了簡單論述，現(xiàn)作一詳細(xì)論述。它是將農(nóng)藥分子與大分子載體(如蛋白質(zhì))偶聯(lián)制得的復(fù)合物作為包被抗原吸附于固相載體(96孔酶標(biāo)板)上，制備成固相抗原，然后加入待測農(nóng)藥和相應(yīng)酶標(biāo)抗體。固相抗原、待測農(nóng)藥與酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)，待測農(nóng)藥含量多，則被結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體少，反之結(jié)合在固相抗原的酶標(biāo)抗體多，最后用底物進(jìn)行顯色加以測定，當(dāng)酶標(biāo)抗體量一定時，加入的待測農(nóng)藥量越多，與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)就減弱，抑制率增高，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強，抑制率減低，因而可根據(jù)已知量農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)線和待檢樣品的抑制率，推算出待測農(nóng)藥的濃度。
2、酶標(biāo)抗體的制備采用改良過碘酸鈉法，將抗體與等量的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)。偶聯(lián)物加入甘油，混勻，分裝，-20℃保存。
3、最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定用方陣滴定法，同時稀釋酶標(biāo)抗體和固相抗原包被液。在同一包被液濃度下，隨著酶標(biāo)抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢，同樣在同一酶標(biāo)抗體稀釋濃度下，隨著包被液濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。通常選擇OD值1.0左右時的抗體和包被抗原濃度作為工作濃度。從實驗可知，當(dāng)CHBu-BSA酶標(biāo)抗體4.0μg·mL-1，包被抗原CHBu-OVA濃度為2.0μg·mL-1時OD值約等于1.0；當(dāng)CHHe-BSA酶標(biāo)抗體為3.0μg·mL-1，包被抗原CHHe-OVA濃度為2.0μg·mL-1時，OD值約等于1.0。
4、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測靈敏度從低溫冰箱中取出CHBu-OVA或CHHe-OVA偶聯(lián)復(fù)合物，使之完全解凍后用包被液稀釋成2.0μg·mL-1的包被抗原溶液。96孔微量反應(yīng)板用蒸餾水洗滌后，每孔加入上述包被液100μL，于37℃溫箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST緩沖液洗滌，每孔加入封閉液300μL，于37℃溫箱中孵育0.5h。甩掉封閉液，用PBST緩沖液洗滌，加入預(yù)先配制的毒死蜱各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50μL/孔，每濃度8孔重復(fù)，再加入預(yù)先配制的對應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋液(CHBu-BSA酶標(biāo)抗體8.0μg·mL-1，CHHe-BSA酶標(biāo)抗體6.0μg·mL-1)50μL/孔，設(shè)不加藥對照和空白對照。放入37℃溫箱中孵育1h，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶聯(lián)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)抑制與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時的吸光值，ODmin為空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得毒死蜱各濃度的抑制率，作圖。用抗CHBu-BSA抗體測定時，抑制率為50％時毒死蜱的濃度(I50)為8.2μg·L-1，最低檢測限[抑制率為20％時毒死蜱的濃度(I20)]為0.4μg·L-1；用抗CHHe-BSA抗體測定時，I50＝14.7μg·L-1，I20＝0.7μg·L-1。從圖中還可知，毒死蜱在1-500μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與毒死蜱濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，抗CHBu-BSA抗體的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9883，抗CHHe-BSA抗體的相關(guān)系數(shù)為r＝0.9905。
5、精密度精密度(Precision)是指方法的重復(fù)性。如果一個分析方法測定結(jié)果的重復(fù)性很差，就無法評價其靈敏度，特異性和準(zhǔn)確度，也就無法得出令人信服的結(jié)果，在ELISA實驗中，常采用批內(nèi)和批間誤差來表示其精密度。
(1)批內(nèi)誤差以標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)平均變異系數(shù)來表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線各劑量點的批內(nèi)平均變異系數(shù)CV％＝12.6％。
(2)批間誤差以6塊不同板上的測定結(jié)果進(jìn)行平均，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線各劑量點的批間平均變異系數(shù)CV％＝15.3％。
從批內(nèi)和批間的數(shù)據(jù)可以看出，毒死蜱含量高的樣品在測定過程中，其重復(fù)性較好，批內(nèi)批間的變異也較小，且批內(nèi)批間相差也較小。
6、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度(Accuracy)是指測得值與真值的符合程度。在農(nóng)藥ELISA實驗中，以回收率和健全性來表示其準(zhǔn)確度。
6.1、回收率將甘藍(lán)樣品切碎后，裝入三角瓶中，每份10g。加入一定量的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含毒死蜱濃度分別為1000μg·L-1、100μg·L-1、50μg·L-1、10μg·L-1的甘藍(lán)樣品。每濃度3個重復(fù)，設(shè)空白對照。一定時間后，在樣品中加入50mL的丙酮振蕩提取15分鐘。用布氏漏斗抽濾，用30mL的丙酮沖洗濾渣，抽濾完畢后，移入到150mL的容量瓶中，減壓濃縮至2mL左右，用PBST定容至10mL。配制2倍于工作濃度的的酶標(biāo)抗體稀釋液。在已包被好的96孔板內(nèi)每孔加入系列提取濃縮液50μL，重復(fù)4孔，再每孔加入酶標(biāo)抗體稀釋液50μL，空白對照孔加入100μL PBST，同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蓋好板，37℃孵育1小時，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶聯(lián)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)各添加樣品的抑制率，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出毒死蜱濃度并計算回收率。
經(jīng)分析可知，該方法的平均回收率為92.2％，平均變異系數(shù)為12.4％，且毒死蜱的添加量為50μg·L-1以上時，方法的變異系數(shù)均小于10％，而小于50μg·L-1時，方法的變異系數(shù)為10-20％之間。隨著農(nóng)藥添加量的降低，回收率基本上也呈現(xiàn)下降的趨勢。
在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，得到的檢測極限為0.4μg·L-1，而在測定甘藍(lán)樣品的過程中，對其提取液作了100倍的稀釋，換算可得用此方法檢測甘藍(lán)中的毒死蜱檢測限可達(dá)4μg·L-1，而用氣相色譜硫磷檢測器時對毒死蜱的檢測限為20μg·L-1，從而可知用ELISA分析方法來測定甘藍(lán)中毒死蜱量是可行的。且與氣相色譜相比，ELISA分析方法樣品的前處理快捷簡單，只用丙酮提取后濃縮定容即可進(jìn)行檢測，而用氣相色譜法分析，樣品前處理過程復(fù)雜，先要用緩沖溶液提取，然后用二氯甲烷萃取，萃取后濃縮，濃縮后又要用小型硅膠柱凈化，工作量大，故建立毒死蜱的ELISA分析方法能夠大大提高工作效率。
6.2、健全性將添加1000μg·L-1毒死蜱的甘藍(lán)樣品的提取液在作了10倍稀釋后作系列稀釋，進(jìn)行重疊性試驗，樣品提取液的稀釋曲線基本上與標(biāo)準(zhǔn)曲線平行。說明所測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的免疫化學(xué)性質(zhì)相同，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測被測物質(zhì)，也說明測定結(jié)果不會因樣品稀釋度的改變而發(fā)生顯著變化。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種毒死蜱人工半抗原，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毒死蜱人工半抗原，其特征在于其中的n＝3或5，分子結(jié)構(gòu)式為 或
3.一種毒死蜱人工半抗原的合成方法，其特征在于依次包括下列步驟1)O-乙基硫代磷酰二氯的合成∶三氯硫磷與無水乙醇，采用先滴加后反應(yīng)的步驟反應(yīng)1～10小時，所述三氯硫磷與無水乙醇的克分子比為1∶1～10，滴加溫度為-30～0℃，反應(yīng)溫度為20～15℃；2)O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯的合成將O-乙基硫代磷酰二氯與3，5，6-三氯吡啶-2-酚在極性溶劑、縛酸劑存在下反應(yīng)，投料比O-乙基硫代磷酰二氯∶3，5，6-三氯吡啶-2-酚＝1∶0.5～1∶3(克分子比)，反應(yīng)溫度為-20～30℃，反應(yīng)時間為0.5～3.0小時；3)毒死蜱半抗原(n+1)-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-(n+1)酸的合成將(n+1)-氨基酸溶解于堿性溶液中，攪拌下緩慢加入溶解于極性溶劑的O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯溶液，再滴加NaOH水溶液進(jìn)行反應(yīng)，(n+1)-氨基酸與O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰氯的克分子比為1∶0.5-6，反應(yīng)溫度為-10～40℃，反應(yīng)時間為1～5小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毒死蜱人工半抗原的合成方法，其特征在于步驟2)中所述縛酸劑是吡啶、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、或碳酸鉀；所述極性溶劑是低級鏈醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、二氧六環(huán)或吡啶；步驟3)的反應(yīng)完成后，再滴加NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為8～12，然后用石油醚洗滌，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH在2～7，用極性溶劑提取，再將所述提取液進(jìn)行濃縮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的毒死蜱人工半抗原的合成方法，其特征在于將所述步驟3)所得的毒死蜱半抗原(n+1)-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，用乙酸乙酯—石油醚重結(jié)晶。
6.一種毒死蜱人工抗原，其特征在于它的分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～10。
7.如權(quán)利要求6所述的毒死蜱人工抗原，其特征在于其中的n＝3或5，分子結(jié)構(gòu)式為 或
8.一種毒死蜱特異性抗體，其特征在于是用分子結(jié)構(gòu)式為 其中n＝1～10的毒死蜱人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與毒死蜱發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。
9.一種毒死蜱半抗原的用途，其特征在于是用作動物免疫的抗原體系的原料。
10.一種毒死蜱特異性抗體的用途，其特征在于用于檢測食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中毒死蜱的殘留量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毒死蜱人工半抗原和抗原，分子結(jié)構(gòu)式分別為其中的n＝1～10。本發(fā)明還公開了以此抗原制備的抗體，半抗原的合成方法，和半抗原、抗體的用途。本發(fā)明最終制成的抗體檢測靈敏度高、特異性強。
文檔編號C07F9/00GK1680405SQ200510048969
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日
發(fā)明者朱國念, 程敬麗, 桂文君 申請人:浙江大學(xué)