用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因sai-1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I的方法，屬于分子生 物學(xué)和遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 高粱是一種抗逆性強、產(chǎn)量潛力大的高光效C4作物，具有糧食、飼料、能源等多種 用途，在干旱半干旱中低產(chǎn)地區(qū)發(fā)揮重要作用。蔗糖代謝是植物最重要的代謝之一，在糖感 知和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，轉(zhuǎn)化酶基因是蔗糖代謝的關(guān)鍵調(diào)芐基因，而可溶性酸性轉(zhuǎn) 化酶（SAI)是蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，對植物生長發(fā)育起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，開發(fā) 簡捷快速克隆可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因的方法，對于育種材料和品種資源的基因分型具有重 要意義。
[0003] 目前，已有包括甜高粱在內(nèi)的大量關(guān)于轉(zhuǎn)化酶基因的研宄，并進行了基因克隆?；?因克隆方法主要有功能克隆，PCR擴增，定位克隆，差別雜交和減法雜交等多種方法。越來 越多基因的克隆和植物基因組的測序，使得同源PCR克隆，成為一種快速、簡便克隆植物基 因的方法，其在功能標記開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。劉洋（2009)在高粱基因組測序公布之前 利用同源PCR克隆技術(shù)克隆了甜高粱SAI-I基因大部分片段。后與高粱基因組序列比對發(fā) 現(xiàn)，已克隆的SAI-I基因片段之前恰好是一段序列空白。之后在空白片段兩端設(shè)計引物，改 變PCR參數(shù)，克隆出這段空白片段，同時采用RT-PCR方法克隆了該基因的cDNA全長。但由 于該基因全長是分成五段后克隆、測序后拼接而成，要克隆更多高粱材料的SAI-I基因，這 種方法顯然不合適，因此目前需要一種更為簡便的方法，為研宄高粱SAI-I基因優(yōu)異單體 型發(fā)掘和分子育種、種質(zhì)創(chuàng)新提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了滿足上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I的方法，所述方法將SAI-I基因分為不均等的兩段，采用兩對引物分別進行PCR，然后 再拼接獲得SAI-I基因全長。
[0005] 本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：
[0006] 用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I的引物，其核苷酸序列為：
[0007] SAIA-F/SAIA-R ：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC ；
[0008] SAIP-F/SAIP-R :GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
[0009] 用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I前半段序列的引物，其核苷酸序列 為：
[0010] SAIA-F/SAIA-R ：CCTCCCATCCTTGATTCTCTT/TTGGGATCGTTCATCCAGTTC〇
[0011] 用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I后半段序列的引物，其核苷酸序列 為：
[0012] SAIP-F/SAIP-R :GTGGAGCAATGCGATGCTGC/CAGCATCAGATGTCCGTGACC。
[0013] 用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I的方法，包括如下步驟：
[0014] (1)以待測高粱品種為材料，提取樣品基因組DNA ;
[0015] (2)采用權(quán)利要求2所述的引物SAIA-F/SAIA-R，以樣品基因組DNA為模板進行 PCR反應(yīng)A，獲得擴增產(chǎn)物；若擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)大小為635bp片段，則回收、克隆、測序該 635bp片段，即SAI-I基因的前段；
[0016] (3)采用權(quán)利要求3所述的引物SAIP-F/SAIP-R，以樣品基因組DNA為模板進行 PCR反應(yīng)B，獲得擴增產(chǎn)物；若擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)大小為3232~3412bp之間的單一片段，則回 收、克隆、測序所述單一片段，為SAI-I基因的后段；
[0017] (4)將獲得的所述SAI-I基因的前段和所述SAI-I基因的后段進行序列拼接，獲得 待測高粱品種的可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因全長。
[0018] 所述PCR反應(yīng)A的體系為：反應(yīng)的總體積50 μ 1，其中2XPCR Buffer for KOD FX 25yl，2mmol/L dNTPs 10yl，ddH20 10以1，1(^111〇1/1引物5八1八-卩/5八1八-1?各1.5 4 1，1((? FX 1 μ 1，樣品基因組DNA 1 μ 1。
[0019] 所述？〇?反應(yīng)六的程序為：94°0預(yù)變性211^11;98°0 108,61°0 308,68°0 308,30個 循環(huán)；68°C延伸lOmin。
[0020] 所述PCR反應(yīng)B的體系為：反應(yīng)的總體積50 μ 1，其中2XPCR Buffer for KOD FX 25yl，2mmol/L dNTPs 10yl，ddH20 10以1，1(^111〇1/1引物5八1?-卩/5八1?-1?各1.5 4 1，1((? FX 1 μ 1，樣品基因組DNA 1 μ 1。
[0021] 所述 PCR 反應(yīng) B 的程序為：94°C預(yù)變性 2min ;98°C 10s，60°C 30s，68°C 3m30s，30 個循環(huán)；68°C延伸lOmin。
[0022] 基因序列擴增克隆是研宄基因功能、標記開發(fā)等一系列研宄的第一步。雖然各種 類型PCR技術(shù)的基本反應(yīng)原理都大致相同，但在實踐中會遇到難以擴增的DNA目標序列，尤 其相對于非高GC含量DNA序列而言，高GC含量DNA序列的PCR擴增更是困難。我們對近 50份高粱屬材料重測序的序列進行人工拼接發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的重測序數(shù)據(jù)都不能拼成完整 SAI-I基因序列，在第一外顯子和第三外顯子區(qū)域高GC區(qū)未能完整測序。為進一步了解克 隆的SAI-I基因 GC分布，我們對每IOObp DNA序列的GC含量進行統(tǒng)計。結(jié)果如圖9所示， SAI-I基因 GC的分布不均衡，外顯子序列GC含量普遍較高，最高處可達80%以上，而內(nèi)含 子區(qū)，GC含量普遍較低，最低30%以下。一些區(qū)域GC含量波動劇烈，可能是導(dǎo)致SAI-I基 因克隆困難的原因之一。
[0023] 本研宄通過對已知的高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因序列及高粱基因組中該基因序 列片段，設(shè)計引物，比較了基因全長克隆、巢式PCR、分段克隆等方法克隆高粱SAI-I基因的 效果。結(jié)果表明，直接擴增全長，擴增產(chǎn)物極其不穩(wěn)定且擴增產(chǎn)物純化、連接，轉(zhuǎn)化后得不到 陽性克??；采用均等分段克隆，前半段擴增產(chǎn)物純化、連接轉(zhuǎn)化后得不到陽性克隆，但后半 段克隆成功。
[0024] 為解決SAI-I基因難以克隆的問題，本發(fā)明提供一種用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn) 化酶基因 SAI-I的方法，采用不均等分段PCR策略，針對高粱基因組信息中SAI-I基因上 游的未知序列部分設(shè)計引物SAIA-F/SAIA-R，以待測高粱品種的基因組DNA為模板，擴增 SAI-I基因的前段；根據(jù)余下的已知序列設(shè)計引物SAIP-F/SAIP-R，以待測高粱品種的基因 組DNA為模板，擴增SAI-I基因的后段；然后將獲得的兩個片段進行拼接，得到SAI-I基因 的全長。
[0025] 以甜高粱品種"MN-3466"為例，采用本發(fā)明提供的方法進行SAI-I基因克隆。經(jīng) 測序，引物SAIA-F/SAIA-R擴增的前段序列長635bp，其堿基組成為：腺嘌呤A 13. 86%，鳥 嘌呤 G32. 28%，胸腺嘧啶 T 16. 54%，胞嘧啶 C 37. 32%，A+T 30. 39%，C+G 69. 61%，屬于 富含GC片段。引物SAIP-F/SAIP-R擴增的后段序列長3408bp，其堿基組成為：A 22.68%， G23.36%，T24.79%，C29.17%，GC合計 52.52%。兩個片段之間有78bp的重疊，拼接后得 到的 SAI-I 基因全長 3965bp，其堿基組成為：A 21.19%，G 24·69%，Τ 23.63%，C30.49%， C+G 55. 18%。將獲得的SAI-I基因全長序列與已經(jīng)公布的高粱基因組序列（GenBank Accession NC_012873. 1)比對發(fā)現(xiàn)，基因組中所缺失的實際片段長450bp，其C+G比例 43. 11%偏低。與已經(jīng)克隆的SAI-I基因序列（GenBank Accession JX535516.1)相似性 99. 3%，證明該序列正確。之后，我們利用該方法對136份高粱材料的SAI-I基因進行了克 隆，均能成功獲得SAI-I基因全長，證明本發(fā)明提供的方法可行。
[0026] 通過對各種PCR方法的嘗試，我們認為高GC含量雖是造成SAI-I基因克隆的重要 原因，但GC分布的巨大波動性可能是影響PCR的更重要的因素。隨著研宄的不斷深入，高 GC序列的克隆已經(jīng)不再是特別困難的事，市場上已有不少針對GC含量PCR的專用試劑盒。 然而，高粱SAI-I基因 GC分布極不均勾，有的區(qū)段GC含量高達80%以上，而有的區(qū)段GC含 量卻不到30%。因此，即便使用這種專用試劑盒，采用常規(guī)的全長PCR、巢式PCR及均等分 段PCR等方法也不能克隆出SAI-I基因全長?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然已有成功克隆高粱SAI-I基 因的例子，但是該方法將SAI-I基因分成五段后克隆、測序后拼接而成，步驟繁瑣，而高粱 有上千個品種，如果都采用這種多段PCR的方法，耗費時間長，勢必阻礙后續(xù)研宄的進行。 發(fā)明人經(jīng)過多年的研宄發(fā)現(xiàn)，將SAI-I基因按照本發(fā)明所述的位置分為不均等的兩段，采 用兩對引物SAIA-F/SAIA-R和SAIP-F/SAIP-R分別進行擴增，然后再進行拼接，能夠快速成 功地獲得SAI-I基因全長，并且，所述兩對引物均在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計，適用于所有的高粱品 種。實驗證明，采用本發(fā)明提供的引物和方法，能夠成功獲得136份高粱材料的SAI-I基因 全長。
[0027] 在優(yōu)選實施例中，兩段PCR條件不同，用引物SAIA-F/SAIA-R擴增前段時，其退火 溫度為61°C ;用引物SAIP-F/SAIP-R擴增后段時，其退火溫度為60°C。由于前段GC含量 高，因此前段PCR退火溫度較后段高1度，提高其特異性。
[0028] 綜上，本發(fā)明用于克隆高粱可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因 SAI-I的方法，能夠快速、簡 便、成功地克隆出高粱的SAI-I基因，解決了 SAI-I基因難以克隆的問題，大大縮短了該基 因的克隆周期，促進了該基因的功能研宄，推動了高粱蔗糖代謝的研宄，加速了高粱的分子 育種和種質(zhì)創(chuàng)新。
【附圖說明】
[0029] 圖1.高粱SAI-I基因全長PCR產(chǎn)物檢測
[0030] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，2000bp， 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp ;l-2 為 SAI-I 基因擴增條帶。
[0031] 圖2.巢式PCR擴增高粱SAI-I基因的第一輪PCR產(chǎn)物檢測
[0032] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，2000bp， 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp ;1 為第一輪 PCR 產(chǎn)物。
[0033] 圖3.巢式PCR擴增高粱SAI-I基因的第二輪PCR產(chǎn)物檢測
[0034] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，2000bp， 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp ;l-2 為第二輪 PCR 產(chǎn)物。
[0035] 圖4.均等分段PCR擴增高粱SAI-I基因的PCR產(chǎn)物檢測
[0036] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，2000bp， lOOObp，750bp，500bp，250bp，IOObp ; I為SAI-I基因前半段擴增產(chǎn)物；2為SAI-I基因后半 段擴增產(chǎn)物。
[0037] 圖5.均等分段PCR擴增高粱SAI-I基因的前半段克隆PCR鑒定
[0038] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，2000bp， lOOObp，750bp，500bp，250bp，IOObp ; 1-10 為 SAI-I 基因前半段克隆 PCR 鑒定條帶。
[0039] 圖6.均等分段PCR擴增高粱SAI-I基因的后半段克隆PCR鑒定
[0040] 其中，M 為 DL8000 標記，從上至下條帶大小為 8000bp，5000bp，3000bp，20