來源于巨大芽孢桿菌的酸性磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中來源于巨大芽孢桿菌的酸性磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷是植物生長發(fā)育三大必需元素之一，在生命過程中起重要作用。植物利用的磷 素主要來源于土壤。目前，我國有2/3的耕地缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷含 量不足，大約95%的磷為難溶性的無效磷，植物很難吸收利用。我國每年大約消耗1050-1200萬噸磷肥(2010年中國化工信息網(wǎng)），但是磷肥當季植物利用率僅為5%-25%，90%左 右的磷肥施入土壤后很快被化學(xué)固定。因此，提高磷肥利用效率，活化土壤無效磷素是農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)迫切解決的科學(xué)問題之一。
[0003] 溶磷微生物中酸性磷酸酶、肌醇六磷酸酶在土壤有機磷的分解與釋放起著關(guān)鍵作 用（Yamamura et al.，2004;趙小蓉等，2001;陳哲等，2009)。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，簡稱ACPase，E.C. 3.1.3.2)，是在酸性條件下催化磷酸單酯水解的酶。此酶除 了參與磷酸酯的代謝，還參與代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)換以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命活動。酸性磷酸 酶具有非常重要的功能，其一，酸性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性，通過分解有機質(zhì)的磷一 酯鍵和磷一酐鍵釋放磷，從而活化土壤中無效磷，在充分利用土壤磷資源、減少磷肥施用上 具有重要應(yīng)用價值;其二，酸性磷酸酶也具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，在合適的條件下，能將低能 磷酸基團轉(zhuǎn)移到核苷的羥基上，在核苷酸生化合成上具有較大的應(yīng)用價值。核苷酸通常作 為食品添加劑和醫(yī)藥中間體，其中，肌苷酸(次黃嘌呤-5'-核苷酸）因為具有更明顯的助鮮 效果，廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。目前主要有兩種方法生產(chǎn)核苷酸，一種是化學(xué)合成法，利 用菌體發(fā)酵產(chǎn)生肌苷，再用P0C1 3磷酸化，該方法副產(chǎn)物較多，提純困難;另一種方法是利用 大腸桿菌肌苷激酶磷酸化肌苷，此過程需要ATP的參與，而ATP需要通過產(chǎn)氨桿菌發(fā)酵再生， 限制了酶法合成的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種磷酸水解酶的活性和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性均 較高的酸性磷酸酶。
[0005] 本發(fā)明所提供的酸性磷酸酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)由SEQ ID No.2第1-203位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] b)由SEQ ID No.2第26-203位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端(C末端)或/和氨基端(N末端)融合蛋白標簽得 到的融合蛋白；
[0009] d)將SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)。
[0010] 上述酸性磷酸酶中，a)所示的蛋白質(zhì)為來源于巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium)的完整酸性磷酸酶，其名稱為BmacpA; SEQ ID No · 2由203個氨基酸殘基組成， 第1-25位為信號肽。
[0011] 上述酸性磷酸酶中，b)所示的蛋白質(zhì)為去掉BmacpA的信號肽得到的去信號肽酸性 磷酸酶，其名稱為NSBmacpA。
[0012] 上述酸性磷酸酶中，蛋白標簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表 達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化等。c)所示的蛋白質(zhì) 具體可為在NSBmacpA的羧基端或/和氨基端融合組氨酸標簽得到的融合蛋白質(zhì)，如SEQ ID No.6所示的蛋白質(zhì)，其名稱為NSBmacpA-His。SEQIDNo.6由192個氨基酸殘基組成。
[0013] 編碼上述酸性磷酸酶的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0015] 上述核酸分子具體可為如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
[0016] 1)編碼序列(⑶S)是SEQ ID No. 1所示的DNA分子，其名稱為BmacpA基因；
[0017] 2)編碼序列是SEQ ID No. 1的第76至612位所示的DNA分子，其名稱為NSBmacpA基 因；
[0018] 3)編碼序列是SEQ ID如.5所示的0嫩分子;其名稱為吧811^口4-!^基因；
[0019] 4)與1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼上述酸性磷酸酶的 DNA分子。
[0020] 所述核酸分子中，"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉 眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比 (%)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0021] 下述A1)、A2)或A3)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0022] A1)上述酸性磷酸酶在作為磷酸轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用。
[0023] A2)上述核酸分子在制備磷酸轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用。
[0024] A3)上述酸性磷酸酶在制備核苷酸中的應(yīng)用。
[0025] 上述應(yīng)用中，所述核苷酸為肌苷酸。
[0026] 本發(fā)明還提供了制備上述酸性磷酸酶的方法。
[0027] 本發(fā)明所提供的制備上述酸性磷酸酶的方法，包括使上述酸性磷酸酶的編碼基因 在生物中進行表達得到上述酸性磷酸酶的步驟;所述生物可為微生物、植物或非人動物。
[0028] 上述方法中，所述使上述酸性磷酸酶的編碼基因在生物中進行表達包括將上述酸 性磷酸酶的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達上述酸性磷酸酶的重組微生物，培養(yǎng)所述 重組微生物，表達得到上述酸性磷酸酶。
[0029] 上述方法中，所述受體微生物可為原核微生物。
[0030] 上述方法中，所述原核微生物具體可為革蘭氏陰性細菌。
[0031] 上述方法中，所述革蘭氏陰性細菌具體可為埃希氏菌屬細菌或檸檬酸桿菌屬細 菌。
[0032]上述方法中，所述埃希氏菌屬細菌具體可為大腸桿菌，如大腸桿菌BL21(DE3)。所 述檸檬酸桿菌屬細菌可為檸檬酸桿菌ACCC02187。
[0033]上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過重組表達載體pET-NSBmacpA導(dǎo)入所述受體微生物;所述pET-NSBmacpA是用序列表中序列5第4至537位核苷酸 所示的DNA分子替換pET-30b (+)的Nde I和Hindll I識別位點間的片段得到的重組表達載體。 [0034]上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)的編碼基因通過重組表達載體pHT-BmacpA 導(dǎo)入所述受體微生物;所述pHT-BmacpA是序列表中序列1所示的DNA分子替換pHT43的BamHI 和Xbal識別位點間的片段得到的重組表達載體。
[0035] 實驗證明，BmacpA和NSBmacpA均具有磷酸水解酶活性和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，BmacpA 和NSBmacpA在37°C、pH5.0的50mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中的磷酸水解酶活分別為 33.96 ± 1.32U/mg蛋白和 37.35 ± 1.55U/mg蛋白；NSBmacpA 在 37°C、pH 值為 5、反應(yīng) 30min 的肌 苷轉(zhuǎn)化率為38%，BmacpA在37°C、pH值為5的條件下反應(yīng)45分鐘的肌苷轉(zhuǎn)化率為36%。
[0036] 本發(fā)明為應(yīng)用基因工程手段培育高效利用土壤養(yǎng)分的農(nóng)作物新品種提供基因資 源，可用于培育高效活化土壤磷素養(yǎng)分的生物工程菌。
【附圖說明】
[0037]圖1為在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達酸性磷酸酶的SDS-PAGE圖譜。
[0038]圖1中，M:蛋白Marker; 1 :空白對照菌粗酶液；2:空載體對照菌粗酶液；3: NSBmacpB-His 粗酶液;4: NSBmacpA-His 粗酶液。
[0039] 圖2為不同pH和反應(yīng)時間對NSBmacpA-His的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的影響。
[0040] 圖3為不同pH和反應(yīng)時間對NSBmacpB-His的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的影響。
[0041 ] 圖4為不同二價離子對NSBmacpA-His和NSBmacpB-His磷酸水解酶活性的影響。
[0042] 圖4中，BmacpA為NSBmacpA-His;BmacpB為NSBmacpB-His。
[0043] 圖5為重組工程菌中酸性磷酸酶的SDS-PAGE表達圖譜。
[0044] 圖5中，M:蛋白Marker; 1:胞內(nèi)上清;2:胞外上清。
[0045]圖6為pH對酸性磷酸酶工程菌的酸性磷酸酶酶活性的影響。
[0046] 圖7為在添加有機磷源培養(yǎng)基中酸性磷酸酶工程菌的溶磷效果。
[0047] 圖7中，檸檬酸桿菌為檸檬酸桿菌ACCC02187,轉(zhuǎn)入酸性磷酸酶的檸檬酸桿菌為酸 性磷酸酶工程菌。
【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無