反映男性精子活力的精漿piRNA標志物或其組合及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及反映男性精子活力的精漿piRNA標志物或其組合 及應用。
【背景技術】
[0002] 不孕不育已成為全世界范圍內的生殖健康問題。據不完全統(tǒng)計，目前全世界約有 1.86億人被不孕不育問題困擾，其中由于男性因素造成的不育占據一半左右，且近幾年呈 上升趨勢（1)。近75%的男性不育患者被診斷為先天性自發(fā)，然而造成男性不育的分子機制 尚不清晰（2)。目前臨床生殖實驗室檢查項目一般包括對精液的生化檢查，酸性磷酸酶、乳 酸脫氫酶-X等酶類檢查以及精液免疫學檢查，但這些技術都存在一定缺陷，不能直接反映 睪丸的生精功能和全面評價精液質量，也無法解釋造成男性不育的分子機制(3)。弱精癥是 男性不育疾病中的一種，弱精癥是指精液參數中前向運動的精子(a和b級）小于50 %或a級 運動的精子小于25 %的病癥，弱精子癥又稱精子活力低下。然而臨床上針對這種疾病的檢 測很難精確反映男性精子的活力程度，難以直接判定精子活力的低下程度及其導致的男性 不育。由于精子活力在男性生殖中起到至關重要的作用，所以目前急需尋找一種比現有方 法更精確的方法來直接反映精子活力。
[0003] PiRNA是2006年在動物生精細胞中發(fā)現的一類新型小分子非編碼RNA，因為它們特 異性地與PIWI蛋白質相互作用，所以被命名為PIWI互作RNA(PIWI-interacting RNA)，簡稱 piRNAGlhpiRNA與生殖密切相關，這不僅因為piRNA特異性的在生殖世系細胞中高表達， 而且piRNA參與了精子的形成和調控，包括對精子成熟相關基因進行轉錄后調控以及對逆 轉錄轉座子進行抑制等等(4,8)。因此，piRNA突變失去功能后，常常會導致個體不育(9)。
[0004] 因此，通過對這些PiRNA進行研究，有望發(fā)現一些與男性生殖功能（如精子活力等） 密切相關的PiRNA，以其作為生物標志物將有望開發(fā)出反映男性精子活力的指標，從而應用 于男性生殖功能障礙的臨床診斷、預測和篩查。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是篩查反映男性精子活力的精漿piRNA，通過測量精漿piRNA特異性 變化，篩選出精子活力弱的生殖功能障礙的男性的精漿PiRNA譜圖，然后通過數學分析方法 計算危險系數評分(Risk Score)以及區(qū)分標準(Cut-off Value)，從而給每個病人打分并 評估其危險系數(高危險系數代表精子活力弱并伴隨生殖功能障礙），最終為精確定量男性 精子活力程度及鑒別因精子活力低下導致的弱精癥提供新的渠道和指標。精漿PiRNA作為 新的反映男性精子活力的生物標志物具有重要的指導意義，能顯示出分子水平的遺傳信 息，有助于揭示男性精子活力降低的分子機制。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是采用以下技術方案來實現的：
[0007] -種與男性精子活力弱及生殖功能障礙相關的piRNA標志物或其組合，包括下列 piRNA中的任意一種或幾種:DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661。其中所述的男性生 殖功能障礙選自弱精癥。
[0009] 本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的piRNA標志物或其組合在制備檢測男性精子 活力的試劑中的應用。
[0010] 本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的piRNA標志物或其組合在制備弱精癥診斷試 劑中的應用。
[0011] 定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的piRNA標志物或其組合的試劑在制 備檢測男性精子活力的試劑中的應用;所述的定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關 的piRNA標志物或其組合的試劑優(yōu)選所述的與男性精子活力相關的piRNA標志物或其組合 的TaqMan探針和引物。
[0012] 定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的piRNA標志物或其組合的試劑在制 備弱精癥診斷試劑中的應用;所述的定量檢測本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的PiRNA 標志物或其組合的試劑優(yōu)選本發(fā)明所述的與男性精子活力相關的PiRNA標志物或其組合的 TaqMan探針和引物。
[0013] -種用于檢測男性精子活力的試劑盒，包含TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測 DQ570956、DQ571813、DQ575659 和 DQ575661 的探針和引物。
[0014] 一種用于診斷男性弱精癥的試劑盒，包含TaqMan探針實時熒光定量PCR法檢測 DQ570956、DQ571813、DQ575659 和 DQ575661 的探針和引物。
[0015] -種預測弱精癥的方法，包含以下步驟：
[0016] (1)收集精漿樣本，包括精子活力正常的有生育能力的男性以及精子活力弱的生 殖功能障礙的男性的精漿樣本，并提取總RNA;
[0017] (2)逆轉錄成cDNA，采用TaqMan探針實時熒光定量PCR法對DQ570956、DQ571813、 DQ575659和DQ575661四種piRNA進行檢測，測算出精子活力低下患者與正常生育男性精漿 中四種piRNA的絕對含量；
[0018] (3)經數學分析過程計算Risk Score從而評估精子活力與piRNA表達水平之間的 關系，使用的公式如下：
[0019] Risk Scorei= Znj=iffj · Sij
[0020] 在以上公式中，每個PiRNA的"s"是以正常對照組5%的下限為參考值，即低于正常 5%下限記為1，否則為0。"Sij"是piRNA j相對于sample i獲得的數值，"W/'是piRNA j的加 權值。通過以上公式，即可以給病人i打分，獲得其危險系數評分Risk Sc〇rei。然后根據ROC 曲線找到一個合適的Cut-off值，然后使用該Cut-off值來評估男性不育與piRNA表達水平 之間的關系，并評估每個受測試樣本的危險性，從而評估男性精子活力，進而特異性檢測或 預測弱精癥男性生殖功能障礙疾病。
[0021] 該方法中，將計算得到的Risk Scorei分值與Cut-off值比較，分值大于Cut-off值 提示該樣本危險系數高，精子活力不足，該樣本來源的男子患有弱精癥;分值小于Cut-off 值提示該樣本危險系數低，精子活力正常，該樣本來源的男子未患弱精癥。
[0022]本發(fā)明使用的檢測方法選自：TaqMan探針實時熒光定量PCR法，包括以下步驟： [0023] (1)使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取精衆(zhòng)總RNA;
[0024] (2)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA;
[0025] (3)根據人piRNA序列設計引物及TaqMan探針，進行PCR反應對piRNA進行精確定量 檢測；
[0026] (4)測算出精子活力低下患者與正常生育男性精漿中四種piRNA的絕對含量。
[0027]本發(fā)明所述的用于檢測相應piRNA的TaqMan探針和引物是商業(yè)化購買。目前針對 已知piRNA設計TaqMan探針和引物已是非常成熟的現有技術，凡是能夠準確檢測本發(fā)明所 述的p i RNA的TaqMan探針和引物均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 本發(fā)明精漿piRNA組合及危險系數數學計算方法可應用于男性精子活力評估和生 殖功能障礙檢測，例如為男性生殖功能障礙補充新的檢測指標，用于病程監(jiān)測、預后和藥效 評價等。
[0029] 本發(fā)明具有以下幾個方面的有益效果：
[0030] 第一，精漿相對其它組織較易獲得，與睪丸活檢或者睪丸穿刺相比，屬于無創(chuàng)性檢 查，極大地方便了醫(yī)療人員的使用，減輕了患者的痛苦；
[0031] 第二，精漿中的piRNA反映的是整個生精過程中的病理和生理狀況，其檢測結果更 具有臨床指導意義；
[0032]第三，精漿piRNA檢測能在分子水平上反映精子發(fā)生中的狀態(tài)，提高了檢測的準確 水平，并為男性生殖功能障礙尤其是生精功能障礙的治療提供了潛在靶點；
[0033]第四，危險系數數學計算方法給每個受試者計算了一個數值，通過該數值可以直 接、直觀的反映精子活力程度，避免了主觀因素及經驗欠缺等造成的干擾。
[0034]綜上所述，檢測精漿中的piRNA，簡單易行且效果優(yōu)越，從精漿piRNA的特異性變化 這一新角度出發(fā)，發(fā)現精子活力評價標準并且區(qū)分男性生殖功能障礙，從而建立起一種檢 測生精功能障礙的新技術。本發(fā)明提供的特異性的PiRNA組合與精子活力密切相關，通過其 含量測算出的危險系數評分與精子活力負相關，能作為男性因精子活力弱導致生殖功能障 礙的分子標志物，具有很高的特異性和靈敏性。該技術僅僅需要病人的精漿而不需要任何 其它組織，通過簡單的精漿PiRNA組合及數學計算評估男性精子活力強弱及預測生殖功能 障礙發(fā)生的可能性。由此可見，檢測精漿piRNA水平能評估精子活力及由精子活力引起的男 性生殖功能障礙，精漿PiRNA的水平有望成為反映男性精子活力的重要標志分子，具有極重 要的臨床應用潛力和價值。
【附圖說明】
[0035]圖1.本發(fā)明的主要流程圖。
[0036]圖 2.了39]\&111探針實時熒光定量？〇?法測定口丨1?熟(00570956、00571813、00575659和 DQ575661)在弱精患者與正常對照精漿樣本中的濃度及差異性變化。如圖所示DQ570956、 DQ571813、DQ575659和DQ575661在弱精患者精漿中相對正常對照均出現顯著降低，因此 DQ570956、DQ571813、DQ575659和DQ575661是可以反映精子活力與區(qū)分正常對照和弱精癥 的特異性生物標志物P iRNA。
[0037] 圖3.Risk Score分析。首先，對這四種piRNA在正常組和弱精組中表達差異作出 R0C曲線，選擇Cut-off值，算出Risk Score值，然后分析Risk Score與年齡、精子密度、精液 體積、精子活力等臨床信息的相關性。結果發(fā)現Risk Score與精子活力成反比例關系，和其 他二種臨床?目息不成比例關系。
【具體實施方式】
[0038] 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0039]本發(fā)明通過研究男性因精子活力而造成生殖功能障礙過程中精漿piRNA的特異變 化，篩選出在疾病及正常生理狀態(tài)下表達差異顯著的一組精漿piRNA，將它們的探針應用于 男性精子活力檢測，以提高診斷男性精子活力的準確性。以下實施例中使用的檢測相應 piRNA的TaqMan探針和引物是由上海吉瑪制藥技術有限公司設計制定。試劑盒名稱為 Hairpin-it? Real-Time PCR，訂單號為探10122。但這些探針和引物僅是為了更好的說明 本發(fā)明的技術方案，不能因此限制本發(fā)明的保護范圍。凡是能夠準確檢測本發(fā)明所述的 p i RNA的TaqMan探針和引物均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0040] 實施例1 :TaqMan探針實時熒光定量PCR法測定piRNA在精漿中的絕對濃度
[0041] (1)研究對象為結婚后未采取任何避孕措施2年內不育者，以年齡匹配的已育不超 過兩年的男性為正常對照，所有受試者禁欲3~5天后留取精液，用WLJY-9000偉力彩色精子 質量檢測系統(tǒng)(北京偉力公司)進行精子質量和功能分析。分析標準均按世界衛(wèi)生組織標準 進行(WHO人類精液檢查和處理實驗室手冊第5版）。待精液分析后將其1000g離心10min，收 集上清，再12000g離心5min，收集上清精楽；。
[0042] (2)收集弱精不育者共20例(無前列腺疾病、性功能障礙、精索靜脈曲張、生殖道感 染等病史，患者病程1~7年），以年齡匹配的生育能力正常的男性16例作對照，組成初篩組。 利用Trizol試劑（Invitrogen公司）分別提取100yL單個樣本精衆(zhòng)中的總RNA。針對 DQ570956、DQ571813、DQ575