對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，利用哺乳動物活精子探針Hoechst 333422和死精子探針PI可被同一紫外光激發(fā)出熒光的特點，對豬、牛、羊、犬4種重要家養(yǎng)哺乳動物精子進行熒光染色，準確地進行精子活力評價。與傳統(tǒng)的PI/ SYBR-14染色法相比，PI/ Hoechst 33342染色法用Hoechst 33342 取代了昂貴的SYBR-14探針，使檢測成本大大降低。本發(fā)明成功用于豬、牛、羊、犬等重要家養(yǎng)哺乳動物精子活力的評價，可廣泛應用于各種家養(yǎng)哺乳動物的精子活力評價。
【專利說明】對家養(yǎng)晡乳動物精子活力評價的熒光染色法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于動物繁殖【技術領域】，尤其涉及對幾種重要家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法。
[0003]

【背景技術】
[0004]精子活力(也稱精子質(zhì)膜完整性)評價是精子質(zhì)量檢測中一個必不可少的指標，其檢測方法主要有普通染色法、熒光染色法和低滲腫脹實驗等，低滲腫脹實驗雖然操作簡單、價格低廉，但因檢測指標單一、無法經(jīng)流式細胞儀分析等原因現(xiàn)在已很少使用。
[0005]普通染色法常用的染料有曙紅(eosin)、曙紅-苯胺黑(eosin-nigrosin)、吉姆薩、臺盼蘭(typan blue)、俾斯麥棕(Bismarck brown Y)、孟加拉玫瑰(Rose Bengal)等。所用的染色方法有僅用一種染料的單染色法，也有同時使用二種或二種以上染料的雙染或三染色法。如斯麥棕和孟加拉玫瑰結合使用的雙染色法可用于人精子的檢測；吉姆薩和臺盼蘭結合用于牛、豬、兔精子的染色；曙紅-苯胺黑染色法用于人精子的檢測以及俾斯麥棕、孟加拉玫瑰和臺盼蘭結合的三染色法用于人、小鼠、馬、羊、豬等動物精子的檢測中。上述染色法借助普通光學顯微鏡即可對精子質(zhì)膜做出檢測，但這些方法使用起來比較繁瑣，死精子比例會被估計過高，而且不同實驗室的檢測結果差異較大，因此，非熒光染色法的可信度遠不如突光染色法。
[0006]檢測精子質(zhì)膜完整性常用的熒光探針有碘化丙錠(propidium 1dide, PI)、Hoechst 33258、溴化乙淀(EB)、溴乙非唳二聚體(ethidium homodimer, EH)> Yo-Pro-l>SYBR-14、竣基突光素雙醋酸鹽(carboxyfluorescein diacetate, CFDA)、竣基二甲基突光素雙醋酸鹽(carboxy dimethyl fluoresccein diacetate, CMFDA)、Carboxy-SNARF-1>SYTO-17等。其中，P1、Hoechst 33258、EB、EH、和Yo-Pro-1是死精子的特異熒光探針，它們只能進入質(zhì)膜破損的精子與DNA結合，因此只有質(zhì)膜破損的精子才能被染色。SYBR-14、CFDA、CMFDA、Carboxy-SNARF-l和SYT0-17是活精子的特異熒光探針，它們能夠進入細胞膜完整的精子。Carboxy-SNARF-1是一種胞內(nèi)pH指示劑，在活精子內(nèi)發(fā)橙紅色熒光，SYT0-17標記活精子的細胞核，發(fā)紅色熒光。CFDA和CMFDA是各種非特異性酯酶的底物，它們本身是一類非熒光物質(zhì)，能夠進入細胞并容易被細胞內(nèi)的非特異性酯酶水解，形成強熒光產(chǎn)物，發(fā)綠色熒光，但不能逸出細胞外，因此具有完整細胞膜的精子發(fā)綠色熒光。用CFDA和CMFDA評價精子質(zhì)膜完整性時要嚴格限定時間，因為細胞內(nèi)熒光隨著時間推移而不斷增強。而SYBR-14則很穩(wěn)定，它能在短時間內(nèi)與核酸達到平衡。因此，與基于酯酶水解的染色法相比，SYBR-14染色法具有染色不受時間影響及不存在背景染色的優(yōu)點。
[0007]目前，哺乳動物精子熒光染色法有僅用一種染料的單染色法，也有同時使用二種染料(如PI/SYBR-14，ΡΙ/CFDA聯(lián)用)的雙重熒光染色法，一般認為，在精子活力檢測的所有方法中，死精子的特異熒光探針PI與活精子的特異熒光探針SYBR-14的聯(lián)合應用效果最好，可以很方便地同時檢測精子的死活，清楚地將死精子與活精子區(qū)分開來。PI/ SYBR-14染色法適合于各種動物精子質(zhì)膜的檢測，經(jīng)典的報道有將其用于牛、豬、羊、兔子、小鼠、人等物種的精子檢測中，在熒光顯微鏡下，質(zhì)膜完整的精子呈綠色，質(zhì)膜破損的精子呈紅色，處于由活到死過渡狀態(tài)的精子則同時發(fā)兩種熒光。但由于SYBR-14發(fā)綠色熒光，若要在檢測精子活性時同時檢測其頂體完整性就無法兼顧，因為檢測頂體的熒光探針大多也發(fā)綠色熒光，與同樣發(fā)綠色熒光的SYBR-14光譜重疊。此外，SYBR-14探針價格昂貴，限制了這一方法的廣泛使用。
[0008]Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低，也是一種膜通透性活體染料，但是，與其他活體染料不同的是Hoechst 33342能標記活精子和死精子，發(fā)藍色熒光，在此基礎上，之前我們研發(fā)出PI/ Hoechst 33342精子質(zhì)膜雙重熒光染色法，所不同的是活精子發(fā)藍色熒光，死精子發(fā)紅色熒光，將其用于獼猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等常用實驗動物的精子質(zhì)膜檢測中，所得結果與PI/ SYBR-14染色法的結果一致，但由于用Hoechst 33342取代了 SYBR-14，使實驗成本大大降低，而且，在檢測質(zhì)膜完整性的同時還可引入頂體探針對精子的頂體完整性做出評價。
[0009]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術方法中存在的不足，提供對幾種重要家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，可廣泛應用于各種家養(yǎng)哺乳動物的精子活力評價。經(jīng)試驗，本發(fā)明可成功用于豬、牛、羊、犬等重要家養(yǎng)哺乳動物精子活力的評價，而且，用PI/Hoechst 33342雙重染色法對豬、牛、羊、犬等動物精子活力進行評價的工作未見報道。
[0011]本發(fā)明所采取的技術方案如下:
對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，步驟如下:
(1)豬精子稀釋液BTS配制
稱取3.69g葡萄糖、0.119g氯化鈉、0.0403g氯化鉀、0.126g碳酸氫鈉、0.125gEDTA和0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.2，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成豬精子稀釋液BTS ；
(2)豬精液處理
取一定體積的新鮮精液，用豬精子稀釋液BTS稀釋，使精子濃度達10X106個/mL，取l~2mL在離心管中進行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ；
(4)顯微鏡檢測
取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
[0012]對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，步驟如下:
(I)牛精子稀釋液配制
牛精子和羊精子稀釋液ifepes-0.1% BSA配制稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成牛精子稀釋液ifepes-0.1% BSA ；
(2)牛精液處理
取一定體積的新鮮精液，用牛精子稀釋液H印es-0.1% BSA按質(zhì)量比1:8進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用H印es-0.1% BSA調(diào)整精子濃度，使精子濃度達30 X 106個/mL，取1- 2mL在離心管中進行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ；
(4)顯微鏡檢測
取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
[0013]對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，步驟如下:
(1)羊精子稀釋液配制
稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成羊精子稀釋液H印es-0.1% BSA ；
(2)羊精液處理
取一定體積的新鮮精液，用羊精子稀釋液H印es-0.1% BSA按質(zhì)量比1:3進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用H印es-0.1% BSA調(diào)整精子濃度，使精子濃度達30 X 16個/mL，取1~2mL在離心管中進行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ；
(4)顯微鏡檢測
取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
[0014]對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，步驟如下:
(1)犬精子稀釋液配制
稱取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G鈉鹽以及0.1 g硫酸鏈霉素，溶入Mill1-Q超純水中，混合均勻后加水定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至6.8，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成犬精子稀釋液TCG ；
(2)精液處理
取一定體積的新鮮精液，用犬精子稀釋液TCG按質(zhì)量比1:1進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用稀釋液調(diào)整精子濃度，使達30 X 16個/mL，取l~2mL在離心管中進行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ；
(4)顯微鏡檢測
取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
[0015]優(yōu)選的是，以上所述的精子染色步驟中，藍色熒光染料H0eChst33342和碘化丙啶PI均為濃度lmg/mL的貯存液，事先用Mill1-Q超純水配制和分裝并保存于_20°C冰箱。
[0016]所述EDTA是乙二胺四乙酸二鈉的英文縮寫。
[0017]所述Tris是三羥甲基氨基甲烷的英文縮寫。
[0018]所述PI是碘化丙啶的英文縮寫。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點是:利用哺乳動物活精子探針Hoechst 333422和死精子探針PI可被同一紫外光激發(fā)出熒光的特點，對豬、牛、羊、犬4種重要家養(yǎng)哺乳動物精子進行熒光染色，準確地進行精子活力評價。
[0020]由于這二種染料在被光激發(fā)后分別發(fā)藍色和紅色熒光，故在檢測活力的同時還可引入發(fā)綠色熒光的染料進行精子頂體完整性的檢測，借助熒光顯微鏡或流式細胞儀對4種重要家養(yǎng)哺乳動物精子活力及頂體完整性做出準確檢測。
[0021]此外，與傳統(tǒng)的PI/ SYBR-14染色法相比，PI/ Hoechst 33342染色法用Hoechst33342取代了昂貴的SYBR-14探針，使檢測成本大大降低。

【具體實施方式】
[0022]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步描述。
[0023]實施例1:
稱取3.69g葡萄糖、0.119g氯化鈉、0.0403g氯化鉀、0.126g碳酸氫鈉、0.125gEDTA以及0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,用氯化氫或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2，孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成豬精子稀釋液BTS并于37 1:水浴保存；取一定體積的新鮮精液，用BTS適當稀釋，使精子濃度達10 X 16個/mL，取I mL至2mL離心管中，加入2yL Hoechst33342和8yL PI，37°C溫浴15min ;取8 μ L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)至少200個精子，本次實際計數(shù)了 202個精子，結果為活精子166個，死精子36個，故豬精子活力為82%。
[0024]實施例2:
稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂、0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成牛精子稀釋液并于37 1:水浴保存；取一定體積的新鮮精液，用H印es-0.1% BSA進行1:8稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用稀釋液調(diào)整精子濃度，使達30X 16 個/mL，取 I mL 至 2mL 離心管中，加入 2μ L Hoechst33342 和 8 μ L PI，37°C 溫浴15min ;取8111^精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)至少200個精子，實際計數(shù)了 212個精子，結果為活精子187個，死精子25個，故牛精子活力為88%。
[0025]實施例3:
稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂、0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成羊精子稀釋液并于37 1:水浴保存；取一定量的新鮮精液，用Hepes-0.1% BSA進行1:3稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用稀釋液調(diào)整精子濃度，使達30 X16 個/mL，取 I mL 至 2mL 離心管中，加入 2μ L Hoechst33342和8 μ L PI，37°C 溫浴 15min ;取8 μ L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)至少200個精子，實際計數(shù)了 205個精子，結果為活精子160個，死精子45個，故羊精子活力為78%。
[0026]實施例4:
稱取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G鈉鹽以及0.1 g硫酸鏈霉素加入Mill1-Q超純水中，混合均勻后加水定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至6.8，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成犬精子稀釋液并于37 1:水浴保存；取一定體積的新鮮精液，用TCG稀釋液進行1:1稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用稀釋液調(diào)整精子濃度，使達30 X 16個/mL，取 I mL 至 2mL 在離心管中，加入 2 μ L Hoechst33342 和 8 μ L PI，37°C溫浴 15min ;取 8 μ L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)至少200個精子，實際計數(shù)了211個精子，結果為活精子179個，死精子32個，故犬精子活力為85%。
【權利要求】
1.對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，其特征在于，步驟如下: (1)豬精子稀釋液BTS配制 稱取3.69g葡萄糖、0.119g氯化鈉、0.0403g氯化鉀、0.126g碳酸氫鈉、0.125gEDTA和0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.2，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成豬精子稀釋液BTS ； (2)豬精液處理 取一定體積的新鮮精液，用豬精子稀釋液BTS稀釋，使精子濃度達10X106個/mL，取l~2mL在離心管中進行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ； (4)顯微鏡檢測 取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
2.對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，其特征在于，步驟如下: (1)牛精子稀釋液配制 牛精子和羊精子稀釋液ifepes-0.1% BSA配制 稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成牛精子稀釋液ifepes-0.1% BSA ； (2)牛精液處理 取一定體積的新鮮精液，用牛精子稀釋液H印es-0.1% BSA按質(zhì)量比1:8進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用H印es-0.1% BSA調(diào)整精子濃度，使精子濃度達30 X 106個/mL，取1- 2mL在離心管中進行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ； (4)顯微鏡檢測 取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
3.對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，其特征在于，步驟如下: (1)羊精子稀釋液配制 稱取 0.76g 氯化鈉、0.03g 氯化鉀、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化鈣、0.0lg氯化鎂和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超純水中并定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至7.4，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成羊精子稀釋液H印es-0.1% BSA ； (2)羊精液處理 取一定體積的新鮮精液，用羊精子稀釋液H印es-0.1% BSA按質(zhì)量比1:3進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用H印es-0.1% BSA調(diào)整精子濃度，使精子濃度達30 X 16個/mL，取1~2mL在離心管中進行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ； (4)顯微鏡檢測 取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
4.對家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，其特征在于，步驟如下: (1)犬精子稀釋液配制 稱取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G鈉鹽以及0.1 g硫酸鏈霉素，溶入Mill1-Q超純水中，混合均勻后加水定容至10mL,調(diào)節(jié)pH至6.8，用孔徑0.22 μ m濾膜過濾，制成犬精子稀釋液TCG ； (2)精液處理 取一定體積的新鮮精液，用犬精子稀釋液TCG按質(zhì)量比1:1進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)后再用稀釋液調(diào)整精子濃度，使達30 X 16個/mL，取l~2mL在離心管中進行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀釋后的精液中，加入2 μ L藍色熒光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C溫浴 15min ； (4)顯微鏡檢測 取8 μ L染色后的精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測并計數(shù)。
5.根據(jù)權利要求1至4任一項所述的家養(yǎng)哺乳動物精子活力評價的熒光染色法，其特征在于，所述精子染色步驟中，藍色熒光染料H0echst33342和碘化丙啶PI均為濃度lmg/mL的貯存液，事先用Mill1-Q超純水配制和分裝并保存于_20°C冰箱。
【文檔編號】C12Q1/06GK104498583SQ201410847407
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權日:2014年12月31日
【發(fā)明者】楊明華, 李亞輝 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學