專利名稱：一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)臨床上使用的檢測方法，確切地說是一種精子細胞膜完整性及活 力檢測方法。
背景技術(shù)：
精子膜完整性與精子代謝、頂體反應(yīng)、精子獲能及精卵融合密切相關(guān)，測定精子膜 功能可以準確地反映精子功能并預(yù)測精子潛在受精能力。自1984年建立精子尾部低滲腫 脹試驗(HOS)測定人精子膜功能以來，HOS已成為目前不多的幾個評價精子膜功能的檢測 方法之一，越來越廣泛地運用于男性生殖避孕的基礎(chǔ)研究和不育的臨床診治中。細胞的物 質(zhì)交換和新陳代謝活動依靠細胞膜進行，精子在男、女性生殖道中極易受到各種化學(xué)物質(zhì) 影響，精子膜對這些物質(zhì)的傳遞能力直接影響精子的活力和新陳代謝，從而關(guān)系到能否獲 能，完成受精的全過程。因此，評價精子膜功能在精子功能檢測中具有重要意義。但是，現(xiàn) 有的精子尾部低滲腫脹試驗僅可顯示精子尾膜是否完整，而無法顯示精子頭膜是否具有完 整性，使得人們無法全面地評價精子膜功能，從而也難以準確地檢測精子活力。而目前可顯 示精子頭膜完整性的試驗方法，由于試驗本身存在精子頭膜顯示不清楚，精子核和頂體不 易區(qū)分的問題，因此，難以有效地起到鑒別精子頭膜是否完整，以及精子頭膜破壞的具體部 位的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供了一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，它可解決現(xiàn)上 述技術(shù)存在的問題，既可確定一個精子的尾部是否完整，又可清楚地鑒別其頭部膜是否被 破壞。并且，在伊紅染液中加入吉姆薩染料對精子染色，可使精子染色程度加重，精子膜顯 示更加清晰，精子核染色加深，頂體易于區(qū)分，從而，更易于鑒別精子膜完整性破壞的部位。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方 法，其步聚如下
+ 制備低滲液
低滲液為每IOOml蒸餾水中含0. 735g檸檬酸鈉和1. 35g果糖，滲透壓是150m0sm的溶
液；
制備伊紅-吉姆薩染液
向每IOOml的0. 9%的生理鹽水中加入0. 5g伊紅和0. Ig吉姆薩混勻，使其充分溶解， 配置成染液，再用雙層濾紙將所述染液過濾，所得濾液即伊紅_吉姆薩染液，伊紅_吉姆薩 染液置于22°C室溫內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br> 3)將0. Iml精液加入Iml步驟①中所述的低滲液中，混勻；①將盛有步驟 中所述的低滲液和精液的混合溶液的容器置于水溫37°C的水中水浴 30分鐘；
⑤向步驟③所述的混合溶液中加入0. Iml步驟 中所述的伊紅-吉姆薩染液，混勻制
成精液-HOS-EG混合液；
靜置2分鐘后取50 μ 1步驟③中所述的精液-HOS-EG混合液置于清潔載玻片上，加
蓋22mmX 22mm蓋玻片，濕片封片，在顯微鏡下觀察每條精子頭部著色和尾部腫脹情況，隨 機計數(shù)200條精子，計算4種類型精子的百分率。為進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，還可以采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)步驟 中所述的蒸
餾水是雙蒸水。步驟 中所述顯微鏡是光學(xué)顯微鏡，其參數(shù)是品牌01ympUS，型號IX51，
產(chǎn)地Japan，最大放大倍數(shù)400倍。步驟 中所述顯微鏡是高級數(shù)碼生物顯微鏡，其參數(shù) 是品牌=Leica,型號DM4000B，產(chǎn)地Germany，最大放大倍數(shù)1000倍。所述吉姆薩是由 天青和伊紅按1 :1重量配制而成。步驟！)中所述的低滲液的離子強度為0. 15。本發(fā)明的有益效果在于它將精子低滲腫脹實驗和精子伊紅_吉姆薩染色實驗有 機地結(jié)合起來，在伊紅染液中加入吉姆薩染料，改進了伊紅染液的成分，從而可使實驗更易 觀察，結(jié)果是在普通光學(xué)顯微鏡下分析，共測定42例正常生育男性得出與單獨應(yīng)用精子低 滲腫脹實驗不同的結(jié)論，即精子在低滲溶液里進行腫脹實驗后，接著進行伊紅-吉姆薩染 色實驗，得到的精子形態(tài)變化共有4種類型(A-D)，其中A型精子是頭膜尾膜均完整的精子， 精子是具有活動能力或是活的，B型精子是頭未染色而尾部未腫脹的精子，我們觀察到這種 精子是有活動能力的精子；如果單純用精子低滲腫脹實驗判斷，結(jié)果這種B型精子就是死 的或沒有活動能力的精子；而C型精子是尾部腫脹而頭部染色的精子，這種精子在單純HOS 實驗里就判斷為活動的精子，因為精子尾膜是完整的，即腫脹，但實際上其頭膜已損傷是死 精子。我們的實驗結(jié)果證實了單純精子低滲腫脹(HOS)實驗對于判斷精子活動能力和膜 的完整性是不完全的，對于A型精子和D型精子，單純低滲腫脹實驗和低滲腫脹實驗/伊 紅_吉姆薩染色結(jié)合實驗判斷結(jié)果是一致的，即A型精子是活動的和頭膜_尾膜完整的精 子，D型精子是頭膜-尾膜均損傷的精子，是死亡的精子，但對B型精子，單純HOS實驗只能 判斷其為死精子，實際上這種精子是活精子，而對C型精子的判斷，單純HOS實驗則判斷為 活精子，實際上這種精子是死精子，應(yīng)用HOS與伊紅_吉姆薩(EG)結(jié)合實驗，就能對這些精 子做出正確判斷。
42例ιΗ常牛育男件單純H0S、單純伊紅染餼、單純伊紅-吉姆薩染餼及HOS/伊紅-吉 姆薩劑和ti^精子形杰學(xué)奪化(+χ)_
HOS/伊紅吉姆薩-69. 3 士 8. 8. 1 士 1. 5 10. 1 士 1.7 12. 5 士 4. Ijg_
注* P<0.01，** P<0. 001，與單純HOS實驗精子尾部腫脹的比較及單純伊紅染色及 單純伊紅_吉姆薩染色精子頭部著色比較；(H0S+)=低滲腫脹實驗精子尾部腫脹(陽性)， (H0S-)=低滲腫脹實驗精子尾部未腫脹(陰性)。圖1是在400X高倍鏡下觀察到的精子單純精子低滲腫脹實驗，即HOS實驗的圖 像，僅可分辨精子尾部是否腫脹的精子；圖2是在400 X高倍鏡下觀察到的單純伊紅Y染 色實驗，精子頭部著紅色的圖像；圖3是精子低滲腫脹/伊紅-吉姆薩結(jié)合實驗的圖像，即 H0S/EG結(jié)合實驗的圖像，圖中三個精子均是A型精子，即精子頭膜和尾膜都未損傷的精子， 標(biāo)注為(H0S+)-(EG_)；圖4是在明視野1000X油鏡下觀察到的A型精子進行H0S/EG結(jié) 合實驗后的圖像；圖5是在明視野1000X油鏡下觀察到的B型精子，即尾膜損傷而頭膜 完整的精子，標(biāo)注為(HOS-)-(EG-)，進行H0S/EG結(jié)合實驗后的圖像；圖6是在明視野 1000X油鏡下觀察到的C型精子，即精子頭膜損傷的精子，標(biāo)注為(HOS+)--(EG+)，進行 H0S/EG結(jié)合實驗后的圖像；圖7是在明視野1000X油鏡下觀察到的D型精子，即精子頭 膜尾膜均損傷的精子，標(biāo)注為0105-) —伍6+)，進行!105序6結(jié)合實驗后的圖像。
具體實施例方式本發(fā)明所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于其步聚如 下
Φ制備低滲液
低滲液為每IOOml蒸餾水中含0. 735g檸檬酸鈉和1. 35g果糖，離子強度為0. 15，滲透 壓150m0sm的溶液；
S)制備伊紅-吉姆薩染液
向每IOOml的0. 9%的生理鹽水中加入0. 5g伊紅和0. Ig吉姆薩混勻，使其充分溶解， 配置成染液，再用雙層濾紙將所述染液過濾，所得濾液即伊紅_吉姆薩染液，伊紅_吉姆薩 染液置于22°C室溫內(nèi)保存?zhèn)溆?；所述伊紅可以是美國希格瑪(Sigma)公司生產(chǎn)的型號為 E6003,伊紅粉劑，所述吉姆薩可以是美國希格瑪(Sigma)公司生產(chǎn)的型號為G4507的吉姆 薩粉劑；
將0. Iml精液加入Iml步驟①中所述的低滲液中，混勻；


①將盛有步驟 中所述的低滲液和精液的混合溶液的容器置于水溫37°C的水中水浴 30分鐘；
⑤向步驟③所述的混合溶液中加入0. Iml步驟 中所述的伊紅-吉姆薩染液，混勻制
成精液-HOS-EG混合液；
靜置2分鐘后取50 μ 1步驟③中所述的精液-HOS-EG混合液置于清潔載玻片上，加
蓋22mmX 22mm蓋玻片，濕片封片，在顯微鏡下觀察每條精子頭部著色和尾部腫脹情況，隨 機計數(shù)200條精子，計算4種類型精子的百分率。四種精子類型的判斷標(biāo)準
A型尾腫脹(H0S+)-頭未染紅色(EG-)，判斷為尾膜一頭膜均完整的精子。B型尾不腫脹(H0S-)--頭未染紅色(EG-)，判斷為尾膜損傷--頭膜完整的精子。C型尾腫脹(H0S+)-頭紅染(EG+)，判斷為尾膜完整一頭膜損傷的精子。D型尾不腫脹(H0S-)--頭紅染(EG+)，判斷為尾膜一頭膜均損傷的精子。步驟①中所述的蒸餾水是雙蒸水。步驟》 中所述顯微鏡是光學(xué)顯微鏡，其參數(shù)是品牌01ympUS，型號IX51，產(chǎn)地 Japan，最大放大倍數(shù)400倍。步驟 中所述顯微鏡是高級數(shù)碼生物顯微鏡，其參數(shù)是品牌Leica，型號 DM4000B,產(chǎn)地Germany,最大放大倍數(shù)1000倍。所述吉姆薩是由天青和伊紅按1 :1重量配制而成，S卩，原來單純伊紅染色劑中加 入吉姆薩染料，可使精子頭部著色更深。步驟①中所述的低滲液的離子強度為0. 15，顯微鏡下可以同時觀察一條精子頭膜 和尾膜是否完整。本發(fā)明未詳盡描述的技術(shù)內(nèi)容均為公知技術(shù)。
權(quán)利要求
一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于其步聚如下①制備低滲液低滲液為每100ml蒸餾水中含0.735g檸檬酸鈉和1.35g果糖，滲透壓是150mOsm的溶液；②制備伊紅 吉姆薩染液向每100ml的0.9%的生理鹽水中加入0.5g伊紅和0.1g吉姆薩混勻，使其充分溶解，配置成染液，再用雙層濾紙將所述染液過濾，所得濾液即伊紅 吉姆薩染液，伊紅 吉姆薩染液置于22℃室溫內(nèi)保存?zhèn)溆茫虎蹖?.1ml精液加入1ml步驟①中所述的低滲液中，混勻；④將盛有步驟③中所述的低滲液和精液的混合溶液的容器置于水溫37℃的水中水浴30分鐘；⑤向步驟④所述的混合溶液中加入0.1ml步驟②中所述的伊紅 吉姆薩染液，混勻制成精液 HOS EG混合液；⑥靜置2分鐘后取50μl步驟⑤中所述的精液 HOS EG混合液置于清潔載玻片上，加蓋22mm×22mm蓋玻片，濕片封片，在顯微鏡下觀察每條精子頭部著色和尾部腫脹情況，隨機計數(shù)200條精子，計算4種類型精子的百分率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于步驟 ①中所述的蒸餾水是雙蒸水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于步驟 ⑥中所述顯微鏡是光學(xué)顯微鏡，其參數(shù)是品牌01ympUS，型號IX51，產(chǎn)地Japan，最大放 大倍數(shù)400倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于步 驟⑥中所述顯微鏡是高級數(shù)碼生物顯微鏡，其參數(shù)是品牌Leica，型號DM4000B，產(chǎn)地 Germany,最大放大倍數(shù)1000倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于所述 吉姆薩是由天青和伊紅按1:1重量配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其特征在于步驟 ①中所述的低滲液的離子強度為0. 15。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種精子細胞膜完整性及活力檢測方法，其步聚如下①制備低滲液；②制備伊紅-吉姆薩染液；③將精液加入步驟①中所述的低滲液中，混勻；④將盛有步驟③中所述的低滲液和精液的混合溶液的容器水浴30分鐘；⑤向步驟④所述的混合溶液中加入0.1ml步驟②中所述的伊紅-吉姆薩染液，混勻制成精液-HOS-EG混合液；⑥靜置2分鐘后取50μl步驟⑤中所述的精液-HOS-EG混合液置于清潔載玻片上，加蓋22mm×22mm蓋玻片，濕片封片，在顯微鏡下觀察每條精子頭部著色和尾部腫脹情況。它可解決現(xiàn)上述技術(shù)存在的問題，既可確定一個精子的尾部是否完整，又可清楚地鑒別其頭部膜是否被破壞。
文檔編號C12Q1/02GK101906460SQ20101024976
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者王磊光, 邱毅 申請人:山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所