專利名稱：一種提取杉木屬植物組織中rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取多年生樹木類植物組織中RNA的方法，特別涉及一種提取杉木屬植物組織中RNA的方法。
背景技術(shù)：
杉木是常綠針葉樹種之一，是我國重要的速生商品材樹種，主要分布在我國和東南亞地區(qū)。杉木生長迅速，主莖通直圓滿，材質(zhì)輕而韌，紋理美觀，加工容易，木材芳香，不饒、不變形，抗蟻蛀，耐腐蝕。它被廣泛應(yīng)用于房屋建筑、裝飾、家具、造船、制器皿等領(lǐng)域。隨著杉木深度加工利用，它的用途不斷拓展，加上人們生活水平的提高，要求居住環(huán)境回歸自然，杉木越來越受廣大群眾歡迎和喜愛，尤其是在南方各省。相對于一年生植物而言，多年生的樹木類植物組織中多糖多酚類等次生代謝物質(zhì)含量較多，且酚類物質(zhì)的含量會(huì)隨著植物的生長而增加。在植物材料勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)。被氧化的酚類化合物(如醌類)能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化，嚴(yán)重影響了提取RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量。在沉淀RNA時(shí)，多糖也往往沉淀形成凝膠狀物質(zhì)，這種沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，所以也很難有效地將其與RNA分開。另外多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。由于研究杉木屬植物生長發(fā)育、代謝和抗逆等相關(guān)的各種分子機(jī)制以及林木轉(zhuǎn)基因研究，均涉及到其組織中RNA的提取，但由于杉木屬植物RNA提取的實(shí)際困難導(dǎo)致杉木屬植物分子生物學(xué)和基因工程包括林木抗性、生殖發(fā)育、材性改良等明顯落后。目前，RNA的提取方法如 TrizoU SDS、常規(guī)CTAB等方法均不能有效地從富含多糖多酚類物質(zhì)的木本杉木屬植物組織中提取高質(zhì)量的RNA。迄今為止還沒有提取杉木屬植物各種組織中高質(zhì)量RNA的有效方法和技術(shù)，從而導(dǎo)致與杉木屬植物相關(guān)的分子生物學(xué)研究與應(yīng)用相對于被子植物和一年生作物落后很多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取杉木屬植物組織中RNA的方法。本發(fā)明所提供的提取杉木屬植物組織中RNA的方法，包括以下步驟(1)裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)；(2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白；(3)在步驟O)的基礎(chǔ)上去苯酚；(4)在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到所述植物組織的RNA。所述方法中，在所述步驟⑷中，在所述沉淀RNA后，包括去除DNA的步驟；所述步驟(1)中裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物的方法為用RNA提取緩沖液對所述植物組織進(jìn)行抽提，取上清液；所述RNA提取緩沖液由緩沖液A和β -巰基乙醇組成，緩沖液A和β -巰基乙醇的體積比 100 2-100 8，具體為 100 2,100 5 或 100 8 ；每1升所述緩沖液A由200mL STE緩沖液、40g十二烷基磺酸鈉、30g聚乙烯吡咯烷酮、150mL乙醇和水組成，用水補(bǔ)足體積，pH值為7. 0-8. 0 ；所述水為焦碳酸二乙酯處理過的無RNA酶超純水；每200mL所述STE緩沖液由6. Og三羥甲基氨基甲烷、8. 2g氯化鈉、3. 7g乙二胺四乙酸和水組成，用水補(bǔ)足體積，PH值為8. 0 ；所述水為焦碳酸二乙酯處理過的無RNA酶超純水；所述步驟( 中去蛋白的方法為用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟(1)得到的產(chǎn)物，收集上清液；所述步驟(3)中去苯酚的方法為用氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟( 得到的產(chǎn)物，收集上清液；所述步驟中沉淀RNA的方法為用無水乙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀或用異丙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述用RNA提取緩沖液對所述植物組織進(jìn)行抽提的方法為將所述RNA提取緩沖液與所述植物組織混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再離心，取上清液；所述步驟O)中，用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟(1)得到的產(chǎn)物，收集上清液的方法為將所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液與步驟(1)得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再離心，收集上清液；所述步驟C3)中，用氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟( 得到的產(chǎn)物，收集上清液的方法為將步驟( 得到的產(chǎn)物與氯仿和異戊醇的混合液以1 1的體積比混勻，放置 5min-10min或5min或7min或IOmin,離心，收集上清液；所述步驟(4)中，用無水乙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀的方法為將步驟(3)得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min 或120min，再離心，收集沉淀；用異丙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀的方法為將步驟(3) 得到的產(chǎn)物與異丙醇和醋酸鈉水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min 或120min，再離心，收集沉淀；所述步驟( 得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液的體積比為10 25 1 ；所述步驟C3)得到的產(chǎn)物與異丙醇和醋酸鈉水溶液的體積比為 10 10 1。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述RNA提取緩沖液與所述植物組織的配比為0. 25g_lg植物組織4mL RNA提取緩沖液，具體為0. 25g植物組織4mL RNA提取緩沖液、0. 6g植物組織4mL RNA提取緩沖液或Ig植物組織4mL RNA提取緩沖液；所述步驟(4)中，所述醋酸鈉水溶液的濃度為3mol/L。所述步驟(1)中，所述離心的方式為在4°C以12，OOOr/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；所述步驟O)中，所述離心的方式為在4°C以12，OOOr/min的速度離心15min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；
所述步驟(3)中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；所述步驟中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心IOminJ^ 轉(zhuǎn)半徑為66mm。所述步驟O)中，所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為 25 24 1 ；所述步驟(3)中，所述氯仿和異戊醇的混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為 M I0所述步驟(1)中，所述植物組織為植物組織粉末。所述植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木；所述植物組織為葉或莖。本發(fā)明的方法中，在提取之前，采用嚴(yán)格的無RNase處理，提取緩沖液中加入SDS 可以使蛋白迅速變性，去除多糖，β-巰基乙醇可以去除多糖多酚類物質(zhì)因氧化而對RNA分離產(chǎn)生的干擾和破壞作用，與PVP結(jié)合的多糖多酚類物質(zhì)，可以直接通過離心去除掉，或在氯仿/異戊醇抽提時(shí)除去。苯酚/氯仿/異戊醇抽提，可以有效的去除蛋白和多糖的污染。 無RNase的DNase I處理RNA溶液，可以有效去除RNA中的基因組DNA的污染，得到高純度 RNA0本發(fā)明有效的克服了多糖多酚類次生代謝物質(zhì)含量高對杉木屬植物組織中總RNA提取所帶來的不利影響，能從其中提取得到高質(zhì)量的RNA，得到的總RNA純度高，有效去除了蛋白、鹽類以及多糖和多酚類次生代謝物質(zhì)的污染。因此，本發(fā)明方法具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為杉木針葉組織未去基因組DNA的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為杉木針葉組織去除基因組DNA的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為杉木莖組織未去基因組DNA的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4為杉木莖組織去除基因組DNA的RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。杉木葉購自福建省三明市清流縣福新苗圃；杉木莖購自福建省三明市清流縣福新苗圃。實(shí)施例1、提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)并檢測方法I一、提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等嚴(yán)格按分子克隆第二版所述方法進(jìn)行無RNase方法處理。提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)包括以下步驟1、裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)RNA 提取緩沖液由緩沖液A和β-巰基乙醇組成；
每1升所述緩沖液A由200mL STE緩沖液、40g十二烷基磺酸鈉(SDS)、30g聚乙烯吡咯烷酮、150mL乙醇和水組成，用水補(bǔ)足體積(水為焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的無RNA 酶的超純水)，pH值為7.0 ；每200mL所述STE緩沖液由6. Og三羥甲基氨基甲烷(Tris)、8. 2g氯化鈉(NaCl)、 3. 7g乙二胺四乙酸(EDTA)和水組成，用水補(bǔ)足體積(水為DEPC處理的無RNA酶的超純水)，PH值為8. 0 ；在使用前，向緩沖液A中加入β -巰基乙醇，得到RNA提取緩沖液；β -巰基乙醇的添加量為50mL β -巰基乙醇/1升緩沖液A ；在液氮中研磨200mg杉木針葉至粉末狀，迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1. 5mL離心管中，按照 0. 25g植物組織4mL RNA提取緩沖液的比例加入上述RNA提取緩沖液，迅速渦旋30秒，室溫放置5min ；在4°C以12，000r/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm，收集上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)離心管中。RNA提取緩沖液中含SDS、NaCl和乙醇，通過高速離心可去除多糖及多糖衍生物。2、在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白將苯酚、氯仿和異戊醇的混合液(苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 24 1) 與步驟⑴得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置5min，在4°C以12，000r/min的速度離心15min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；收集上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)離心管中。3、在步驟O)的基礎(chǔ)上去苯酚將氯仿和異戊醇的混合液(氯仿和異戊醇的體積比為M 1)與步驟⑵得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置5min，在4°C以12，000r/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；收集上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)離心管中。4、在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到植物組織的RNA。將步驟(3)得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液(3mol/L)以體積比為 10 25 1混合，_20°C放置30min，在4°C以12，000r/min的速度離心lOmin，旋轉(zhuǎn)半徑為 66mm ；收集沉淀，得到杉木針葉組織RNA ；沉淀用lmL70%乙醇洗一遍，在4°C以12，000r/min的速度離心5min，完全去除上清液，收集沉淀；將沉淀在空氣中干燥5min，加50 μ L DEPC處理的水溶解沉淀，得到RNA溶液，保存在-80°C超低溫冰箱里。3mol/L醋酸鈉水溶液的配制方法24. 6克醋酸鈉溶于DEPC處理的H2O中，調(diào)節(jié)pH 至5. 2，定容至IOOmL,高壓滅菌。二、檢測 1、電泳檢測RNA的完整性取上述步驟一得到的杉木針葉組織RNA 1 μ L，在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，180V，電泳10-20min，其結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，經(jīng)過本發(fā)明的方法提取到的杉木針葉組織 RNA (未去除DNA)，電泳檢測28S和18S條帶均非常清晰，比例為2 1，說明RNA保持了較好的完整性。但是，沒經(jīng)過去除DNA的步驟，得到的RNA尚有基因組DNA的污染。2、提取RNA的純度檢測取2yL步驟一得到的杉木針葉組織RNA樣品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀釋50倍，用 100 μ L IXTE (ρΗ8. 0)做空白對照，在230nm、260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零，然后讀出待測樣品在三個(gè)波長處的OD值。結(jié)果顯示紫外分光光度計(jì)測得OD23tl為 0. 251, OD260 為 0. 512, OD280 為 0. 261，其中，0D26。/0D28(1 = 1. 962, OD260/OD230 = 2. 040。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之間，表明RNA純度高，沒有殘余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 說明沒有雜質(zhì)鹽的污染。方法II一、提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等嚴(yán)格按分子克隆第二版所述方法進(jìn)行無RNase方法處理。提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)包括以下步驟1、裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)除以下1)- 外，其余方法均與方法I相同(1) RNA提取緩沖液中緩沖液A的pH值為7. 5 ；(2)在使用RNA提取緩沖液前，向緩沖液A中加入β-巰基乙醇，β-巰基乙醇的添加量為20mL β -巰基乙醇/1升緩沖液A ；(3)按照0. 6g植物組織4mL RNA提取緩沖液的比例加入上述RNA提取緩沖液，迅速渦旋45秒，室溫放置7min。2、在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白除將苯酚、氯仿和異戊醇的混合液與步驟(1)得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻， 放置7min以外，其余方法與方法I相同。3、在步驟O)的基礎(chǔ)上去苯酚除將氯仿和異戊醇的混合液與步驟( 得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置 7min以外，其余方法與方法I相同。4、在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到植物組織的RNA。除將步驟(3)得到的產(chǎn)物與異丙醇和醋酸鈉水溶液(3mol/L)以體積比為 10 10 1混合，-20°c放置75min外，其余方法均與方法I相同。二、檢測1、電泳檢測RNA的完整性
與方法I結(jié)果無顯著差異。2、提取RNA的純度檢測與方法I結(jié)果無顯著差異。方法III一、提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)所有的溶液、容器和器具等嚴(yán)格按分子克隆第二版所述方法進(jìn)行無RNase方法處理。提取杉木針葉組織RNA (未去DNA)包括以下步驟1、裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)除以下1)- 外，其余方法均與方法I相同(1) RNA提取緩沖液中緩沖液A的pH值為8. 0 ；(2)在使用RNA提取緩沖液前，向緩沖液A中加入β -巰基乙醇，β -巰基乙醇的添加量為80mL β -巰基乙醇/1升緩沖液A ； (3)按照Ig植物組織；4mL RNA提取緩沖液的比例加入上述RNA提取緩沖液，迅速渦旋60秒，室溫放置IOmin。2、在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白除將苯酚、氯仿和異戊醇的混合液與步驟(1)得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻， 放置IOmin以外，其余方法與方法I相同。3、在步驟O)的基礎(chǔ)上去苯酚除將氯仿和異戊醇的混合液與步驟(2)得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置 IOmin以外，其余方法與方法I相同。4、在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到植物組織的RNA除將步驟(3)得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液混合后，-20°C放置120min 外，其余方法均與方法I相同。二、檢測1、電泳檢測RNA的完整性與方法I結(jié)果無顯著差異。2、提取RNA的純度檢測與方法I結(jié)果無顯著差異。實(shí)施例2、提取杉木針葉組織RNA (去除DNA)一、提取杉木針葉組織RNA (去除DNA)提取杉木針葉組織RNA(去除DNA)是在實(shí)施例1步驟(4)后面，增加去除DNA的步驟，其它步驟與實(shí)施例1的方法I完全相同。去除DNA的步驟包括如下(a)用無RNase的DNase I去除RNA中的基因組DNA (50 μ L反應(yīng)體系中含有5 μ L 的 IOXDNase I bufferUOU DNase I、20U RNase inhibitor,20-50 μ L RNA溶液)，37°C反應(yīng) 30min ；(b)將氯仿/異戊醇04 1)與等體積的步驟(a)的產(chǎn)物混合，靜置5-lOmin， 12，000r/min、4°C離心 lOmin，收集上清液；(c)沉淀RNA 沉淀方法與實(shí)施例1的方法I的步驟(4)相同；(d)用ImL 70%乙醇洗沉淀，4°C，12，000r/min離心5min，完全去除上清；(e)沉淀在空氣中干燥5min，加50 μ L DEPC處理的水溶解RNA沉淀，于_80°C保存。二、檢測1、電泳檢測RNA的完整性取上述步驟一得到的杉木針葉組織RNA 1 μ L，在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，180V,電泳10-20min，其結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，經(jīng)過本發(fā)明的方法提取到的杉木針葉組織 RNA(去除DNA)，電泳檢測28S和18S條帶均非常清晰，比例為2 1，說明RNA保持了較好的完整性。2、提取RNA的純度檢測取2yL步驟一得到的杉木針葉組織RNA樣品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀釋50倍，用 100 μ L IXTE (ρΗ8. 0)做空白對照，在230nm、260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零，然后讀出待測樣品在三個(gè)波長處的OD值。結(jié)果顯示紫外分光光度計(jì)測得OD23tl為 0. 151, OD260 為 0. 338, OD280 為 0. 162，其中，0D26(l/0D28(l = 2. 086, OD260/OD230 = 2. 238。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之間，表明RNA純度高，沒有殘余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 說明沒有雜質(zhì)鹽的污染。實(shí)施例3、提取杉木莖組織RNA (未去DNA)一、提取杉木莖組織RNA (未去DNA)該實(shí)施例中所用的材料為杉木莖組織，該實(shí)施例的RNA提取方法與實(shí)施例1的方法I中RNA提取方法相同。二、檢測1、電泳檢測RNA的完整性取上述步驟一得到的杉木莖組織RNA 1 μ L，在瓊脂糖凝膠上電泳，180V,電泳 10-20min，其結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，經(jīng)過本發(fā)明的方法提取到的杉木針葉組織RNA (未去除DNA)，電泳檢測28S和18S條帶均非常清晰，比例為2 1，說明RNA保持了較好的完整性。但是，沒有經(jīng)過去除DNA的步驟，得到的RNA尚有基因組DNA的污染。2、提取RNA的純度檢測取2yL步驟一得到的杉木莖組織RNA樣品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀釋50倍，用 100 μ Ll X TE (ρΗ8. 0)做空白對照，在230nm、260nm,280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零，然后讀出待測樣品在三個(gè)波長處的OD值。結(jié)果顯示紫外分光光度計(jì)測得OD23tl為 0. 331，OD260 為 0. 678，OD280 為 0. 346，其中，OD260/OD280 = 1. 960，OD260/OD230 = 2. 048。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之間，表明RNA純度高，沒有殘余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 說明沒有雜質(zhì)鹽的污染。實(shí)施例4、提取杉木莖組織RNA (去除DNA)一、提取杉木莖組織RNA (去除DNA)該實(shí)施例中所用的材料為杉木莖組織，該實(shí)施例的RNA提取方法與實(shí)施例2的RNA 提取方法相同。二、檢測1、電泳檢測RNA的完整性取上述步驟一得到的杉木莖組織RNA lyL，在瓊脂糖凝膠上電泳，180V，電泳10-20min，其結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，經(jīng)過本發(fā)明的方法提取到的杉木針葉組織 RNA(未去除DNA)，電泳檢測28S和18S條帶均非常清晰，比例為2 1，說明RNA保持了較好的完整性。2、提取RNA的純度檢測取2yL步驟一得到的杉木莖組織RNA樣品，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)稀釋50倍，用 100 μ Ll X TE (ρΗ8. 0)做空白對照，在230nm、260nm,280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零，然后讀出待測樣品在三個(gè)波長處的OD值。結(jié)果顯示紫外分光光度計(jì)測得OD23tl為 0. 203, OD260 為 0. 428, OD280 為 0. 212，其中，0D26。/0D28。= 2. 019，0D26。/0D23。= 2. 108。OD260/ OD280比值介于1. 9-2. 1之間，表明RNA純度高，沒有殘余的蛋白污染，OD260/OD230大于2. 0， 說明沒有雜質(zhì)鹽的污染。
權(quán)利要求
1.一種提取植物組織RNA的方法，包括以下步驟(1)裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)；(2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白；(3)在步驟O)的基礎(chǔ)上去苯酚；(4)在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到所述植物組織的RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述步驟中，在所述沉淀RNA后，包括去除DNA的步驟；所述步驟(1)中裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物的方法為用RNA提取緩沖液對所述植物組織進(jìn)行抽提，取上清液；所述RNA提取緩沖液由緩沖液A和β-巰基乙醇組成，緩沖液A和β-巰基乙醇的體積比 100 2-100 8，具體為 100 2,100 5 或 100 8 ；每1升所述緩沖液A由200mL STE緩沖液、40g十二烷基磺酸鈉、30g聚乙烯吡咯烷酮、 150mL乙醇和水組成，用水補(bǔ)足體積，pH值為7. 0-8. 0 ；每200mL所述STE緩沖液由6. Og三羥甲基氨基甲烷、8. 2g氯化鈉、3. 7g乙二胺四乙酸和水組成，用水補(bǔ)足體積，PH值為8. 0 ；所述步驟( 中去蛋白的方法為用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟(1)得到的產(chǎn)物，收集上清液；所述步驟C3)中去苯酚的方法為用氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟( 得到的產(chǎn)物， 收集上清液；所述步驟中沉淀RNA的方法為用無水乙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀或用異丙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述用RNA提取緩沖液對所述植物組織進(jìn)行抽提的方法為將所述 RNA提取緩沖液與所述植物組織混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再離心， 取上清液；所述步驟O)中，用苯酚、氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟(1)得到的產(chǎn)物，收集上清液的方法為將所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液與步驟(1)得到的產(chǎn)物以1 1的體積比混勻，放置5min-10min或5min或7min或lOmin，再離心，收集上清液；所述步驟(3)中，用氯仿和異戊醇的混合液抽提步驟( 得到的產(chǎn)物，收集上清液的方法為將步驟( 得到的產(chǎn)物與氯仿和異戊醇的混合液以1 1的體積比混勻，放置 5min-10min或5min或7min或IOmin,離心，收集上清液；所述步驟(4)中，用無水乙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀的方法為將步驟C3)得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液混合，_20°C放置30min-120min或30min或75min或120min， 再離心，收集沉淀；用異丙醇和醋酸鈉水溶液進(jìn)行沉淀的方法為將步驟C3)得到的產(chǎn)物與異丙醇和醋酸鈉水溶液混合，-20°C放置30min-120min或30min或75min或120min， 再離心，收集沉淀；所述步驟C3)得到的產(chǎn)物與無水乙醇和醋酸鈉水溶液的體積比為 10 25 1;所述步驟(3)得到的產(chǎn)物與異丙醇和醋酸鈉水溶液的體積比為10 10 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述RNA提取緩沖液與所述植物組織的配比為0. 25g-lg植物組織4mL RNA提取緩沖液，具體為0. 25g植物組織4mL RNA提取緩沖液、0. 6g植物組織4mL RNA 提取緩沖液或Ig植物組織4mL RNA提取緩沖液；所述步驟(4)中，所述醋酸鈉水溶液的濃度為3mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為 66mm ；所述步驟O)中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心15min，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm ；所述步驟(3)中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心5min，旋轉(zhuǎn)半徑為 66mm ；所述步驟中，所述離心的方式為在4°C以12，000r/min的速度離心lOmin，旋轉(zhuǎn)半徑為66mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟O)中，所述苯酚、氯仿和異戊醇的混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為 25 24 1 ；所述步驟(3)中，所述氯仿和異戊醇的混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為M 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述植物組織為植物組織粉末。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述植物為杉木屬植物；所述杉木屬植物為杉木；所述植物組織為葉或莖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取杉木屬植物組織中RNA的方法。該方法包括以下步驟(1)裂解植物組織的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放內(nèi)含物并去除多酚物質(zhì)和多糖物質(zhì)；(2)在步驟(1)的基礎(chǔ)上去蛋白；(3)在步驟(2)的基礎(chǔ)上去苯酚；(4)在步驟(3)的基礎(chǔ)上沉淀RNA，得到所述植物組織的RNA。本發(fā)明有效的克服了多糖多酚類次生代謝物質(zhì)含量高對杉木屬植物組織中RNA提取所帶來的不利影響，能從其中提取得到高質(zhì)量的RNA，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/10GK102373194SQ20101024964
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月10日
發(fā)明者萬里川, 張海燕 申請人:中國科學(xué)院植物研究所