利用熒光定量pcr鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種適用于魷魚及其深加工產(chǎn)品種類的熒光定量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 魷魚（Squid)，又稱句公、柔魚或槍烏賊，是頭足綱（Cephalopoda)、槍形目 (Teuthida)中多種10腕頭足類軟體動物的俗稱。其身體狹長，呈槍形。嗅覺突由兩個突起組 成，眼眶外覆蓋透明角膜，環(huán)口附肢10腕。噴水推進(jìn)能力強(qiáng)，適于快速游泳。魷魚廣泛分布于 世界各大洋，已知分布水層為〇~3000m。市場上常見的魷魚一般是開眼亞目（Oegopsida)的 柔魚科(Ommastrephidae)品種和閉眼亞目（Myopsida)的槍烏賊科(Loliginidae)品種。在 中國本土市場，最常見的魷魚是柔魚科的秘魯魷魚(Dosidicus gigas)、阿根廷魷魚（Illex argentinus)、日本海魷魚（Todarodes pacificus)和北太平洋魷魚（Ommastrephes bartramii)〇
[0003] 魷魚類的平均可食用部分約占85%，比一般魚類高約25%。肉質(zhì)鮮美，富含蛋白 質(zhì)、?；撬?、鈣、磷、鐵等人體必需的成分，且必需氨基酸組成接近全蛋蛋白，營養(yǎng)價值非常 高。市場上的魷魚除了直接鮮銷，還會經(jīng)加工來供應(yīng)市場。常見的魷魚加工形式有:凍品，如 凍魷魚胴片、凍魷魚圈等;干品，如魷魚鲞、魷魚耳等；熟食產(chǎn)品，如魷魚絲、魷魚仔、魷魚罐 頭等。日本和歐盟是魷魚的主要消費市場，日本以進(jìn)口冷凍和干制品為主，歐盟則大部分進(jìn) 口冷凍品。近年來，美國、中國等國家或地區(qū)的魷魚市場也逐漸擴(kuò)大。
[0004] 因為產(chǎn)地、營養(yǎng)成分、口味的差異，不同魷魚品種的市場價相差巨大。例如，阿根廷 魷魚肉質(zhì)肥厚、口感鮮嫩，所以價格較高;秘魯魷魚資源豐富，個體大，但含有特殊酸味且肉 質(zhì)較差，所以價格較低。而當(dāng)魷魚進(jìn)行切片、熟制等加工過程，其可供鑒別的形態(tài)學(xué)特征基 本不存在，這可能會導(dǎo)致不法商販以次充好的欺詐行為。雖然很多國家、地區(qū)和組織都有相 應(yīng)的法規(guī)，規(guī)定在水產(chǎn)品的標(biāo)簽中明確其種類和來源，但是摻假造假的判定和標(biāo)簽制度的 有效實施，必須是建立在快速、準(zhǔn)確的魷魚品種鑒定的基礎(chǔ)上的。目前該領(lǐng)域國內(nèi)的研究還 在起步階段。因此，為了規(guī)范魷魚市場，維護(hù)消費者的知情權(quán)，迫切需要建立靈敏、可靠的檢 測方法和檢測體系來鑒定魷魚類產(chǎn)品原魚料的品種。
[0005] 目前，已報道的魷魚種類鑒定的方法有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)法、蛋白質(zhì)電泳法和DNA分子遺 傳標(biāo)記方法。形態(tài)學(xué)方法依賴于專業(yè)人士的長期工作經(jīng)驗，對親緣關(guān)系相近的相似種的判 斷并非有效。而且對于市面上常見的加工過魷魚產(chǎn)品（魷魚絲、罐頭等），可供種類鑒別的形 態(tài)學(xué)特征幾乎不存在;蛋白質(zhì)分析方法不適用于深加工產(chǎn)品，因為產(chǎn)品加工過程中的熱處 理使蛋白質(zhì)的生化特性及其結(jié)構(gòu)完整性都被破壞;而基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法，就顯 示出明顯優(yōu)勢：1)DNA比蛋白質(zhì)耐熱性強(qiáng);盡管DNA在加工過程中也會被降解，但是仍然能提 取出小片段的DNA; 2)作為生物體的遺傳物質(zhì)，DNA分子能夠提供更多信息;3)DNA分子穩(wěn)定， 不受組織類型、年齡及生理狀態(tài)等因素的影響。
[0006] DNA分子技術(shù)用于種類鑒定有多種常見方法，如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo) 記、單堿基多態(tài)性（SNP)標(biāo)記、微衛(wèi)星（microsatellite )標(biāo)記、DNA條形碼技術(shù)（DNA barcode)、熒光定量PCR技術(shù)等。
[0007] RFLP首先需要對目標(biāo)DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后選擇合適的限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò) 增片段，通過瓊脂糖凝膠電泳獲得不同物種的限制性酶切片段圖譜。該方法花費低，操作簡 單，但也存在諸多缺點：1)、由于存在種內(nèi)變異以及不同密碼子的簡并性特征，同一物種不 同個體可能存在不同的限制片段酶切圖譜;2)、除生鮮魷魚和冷凍魷魚外，魷魚深加工產(chǎn)品 (如魷魚絲、魷魚餅、魷魚罐頭等)在加工過程中通常使用長時間（>15min)高溫(>115°C)處 理，DNA分子常降解為100-200bp的小片段，這可能嚴(yán)重影響酶切片段的多態(tài)性的判斷。 [0008] SNP和microsatellite標(biāo)記常用于魷魚類的群體分析。DNA barcode是通過對一個 標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行快速物種鑒定的技術(shù)，由Hebert等（2003)首先 提出。2003年，海洋生物普查研究首次將DNA Barcode技術(shù)用于標(biāo)本編碼。2004年，生命條形 碼聯(lián)盟（the Consortium for the Barcode of Life,CB0L)成立，支持生物DNA條形碼研究 的發(fā)展。至今，該組織下的魚類DNA條碼(Fish Barcode of Life campaign,FISH-B0L)已經(jīng) 獲得了 10267個種的DNA條形碼記錄，包含97%的魚類品種。該方法在新物種的發(fā)掘和物種 系統(tǒng)進(jìn)化分析方面非常高效，但其缺點是混合樣品中通常有多種成分被同時擴(kuò)增，會造成 測序結(jié)果的雜亂，因此不適用于混合樣品的鑒定。
[0009] 熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新的核酸定量檢測方法，它在常規(guī)的PCR基 礎(chǔ)上加入熒光信號物質(zhì)(探針或染料），利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過 擴(kuò)增曲線的C t值(熒光信號強(qiáng)度達(dá)到基礎(chǔ)信號(Base Line)時的循環(huán)數(shù)，表明PCR開始進(jìn)入 指數(shù)擴(kuò)增期)對未知模板進(jìn)行定量分析。它集中了核酸雜交特異性強(qiáng)和PCR擴(kuò)增靈敏度高的 優(yōu)點，檢測范圍廣U 7個數(shù)量級）、檢測極限低（lc/r)，可同時對多個樣品進(jìn)行快速準(zhǔn)確分 析，被認(rèn)為是目前最可靠的核酸定量檢測技術(shù)。在我國進(jìn)出口食品的檢驗檢疫方面，已廣泛 應(yīng)用于病原體檢測、有害生物風(fēng)險分析以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管等多個方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種魷魚或其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量 PCR檢測方法中所用的特異性引物和探針，采用本發(fā)明的方法能對魷魚以及深加工魷魚產(chǎn) 品種類進(jìn)行快速鑒定。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供魷魚或其深加工產(chǎn)品種類鑒定的熒光定量PCR 檢測方法中所用的特異性引物和探針，其特征是：
[0012] 所述特異性引物和探針的序列由柔魚科以及北太平洋魷魚（Ommastrephes bartramii)、秘魯魷魚（Dosidicus gigas)、阿根廷魷魚（Illex argentinus)以及日本海魷 魚(Todarodes pacificus)中的至少任意一種以及柔魚科組成：
[0013] 具體如表1所述；
[0014] 表1
[0015]
[0016] 備注說明：
[0017 ]上述柔魚科 R-P 中：Y: C/T，R: A/G，H: A/T/C。
[0018]本發(fā)明還同時提供了利用熒光定量PCR鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法，包 括以下步驟：
[0019 ]①、待測魷魚樣品中基因組DNA的提取；
[0020]②、對常見魷魚特異性鑒定引物與探針的設(shè)計；
[0021 ] 4種常見魷魚為:北太平洋魷魚(Ommastrephes bartramii)、秘魯魷魚(Dosidicus gigas)、阿根廷魷魚（Illex argentinus)以及日本海魷魚（Todarodes pacificus);
[0022] ③、熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置；
[0023] 以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用上述特異性引物和探針，進(jìn)行實時熒光PCR檢測；
[0024] ④、根據(jù)實時熒光PCR檢測結(jié)果進(jìn)行判斷（即，對市售魷魚樣品的種類鑒定，判斷是 否與標(biāo)簽所述相符）。
[0025] 作為本發(fā)明的利用熒光定量PCR鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法的改進(jìn)：
[0026] 所述步驟②是對4種常見魷魚的12S rDNA及Cytb、COI、ATPase 6基因的序列進(jìn)行 熒光定量PCR檢測的特異性鑒定引物與探針的設(shè)計。
[0027] 作為本發(fā)明的利用熒光定量PCR鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法的進(jìn)一步改 進(jìn):所述探針的5'端標(biāo)記有報告熒光染料，所述報告熒光染料為FAM、HEX，探針的3'端標(biāo)記 有淬滅熒光染料，所述淬滅熒光染料為TAMRA。
[0028] 作為本發(fā)明的利用熒光定量PCR鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法的進(jìn)一步改 進(jìn):所述步驟②中的特異性引物和探針的序列如表1所述。
[0029] 作為本發(fā)明的利用熒光定量PCR鑒定魷魚或其深加工產(chǎn)品種類的方法的進(jìn)一步改 進(jìn):所述步驟③熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置：
[0030] 反應(yīng)體系為：20yL總體積中含有AceQTM qPCR Probe Master Mix 10yL，魷魚/柔 魚科的上下游引物（1〇μΜ)各0.4yL，魷魚/柔魚科的探針（10μΜ)0.2μL，DNA模板1.5yL，補(bǔ)水 至20yL;
[0031 ]備注:每個反應(yīng)重復(fù)3次，同時以1.5yL滅菌蒸餾水為模板的作為空白對照組。
[0032] 上述魷魚是指"北太平洋魷魚、秘魯魷魚、阿根廷魷魚、日本海魷魚"中的任意一 種;DNA 模板的濃度為 1.514X 10-2ng/yL-4.08ng/yL。
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