基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于土壤微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大田種植方式下，基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根際(Rhizosphere)被定義為緊密圍繞著有生命力根系的生物活性區(qū)域，其中包含大量微生物，例如細菌、放線菌和真菌等，也包括一些藻類和病毒等，范圍一般為距離根表面Icm以內(nèi)。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物會對根際微生物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響;而根際微生物又參與土壤有機質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)等多種生理生化過程，尤其是其中的固氮菌群，通過生物固氮作用在常溫下把氮氣轉(zhuǎn)化為能被植物利用于合成各種氨基酸的氨。土壤根際微生物群落不僅受到植物根系影響，也受土壤類型、農(nóng)業(yè)耕作管理、季節(jié)變化、重金屬污染、殺蟲劑處理等影響，同時也受到檢測技術(shù)的影響。因此，準(zhǔn)確檢測不同基因型植物包括轉(zhuǎn)基因作物的根際微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對豐度差異，是判斷和評價不同基因型植物對土壤微環(huán)境影響的重要基礎(chǔ)，也是評估轉(zhuǎn)基因作物釋放對土壤微生態(tài)風(fēng)險的重要基礎(chǔ)。
[0003]傳統(tǒng)的用于研究微生物的分離培養(yǎng)法主要有平板培養(yǎng)法和顯微鏡觀察等方法，雖然簡單方便，至今仍然是一種不可替代的研究手段，但也存在一些弊端，即上述方法無法研究土壤中大量的且不可培養(yǎng)的微生物。B1LOG微平板分析法適用于檢測可培養(yǎng)的且生長速度較快的微生物及其代謝多樣性，但是實驗結(jié)果并不能完全代表原位條件下微生物代謝多樣性的結(jié)果，樣品的處理方法、培養(yǎng)條件以及B1LOG微平板的類型等都會對結(jié)果造成一定程度的誤差。醌指紋法的優(yōu)點是簡單快速，因此也被廣泛地應(yīng)用于微生物細胞結(jié)構(gòu)多樣性的分析中，但是醌指紋法也存在一些不足，例如它不能具體反映到哪個屬、種的多樣性變化等。磷脂脂肪酸(PLFA)分析法是基于PLFA是活體細胞膜的一個重要組成部分，含量大約占細胞干重的5% ；用PLFA的變化來反映土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的種類組成和數(shù)量變化，該方法不需要進行微生物培養(yǎng)，可直接鑒定微生物群落多樣性變化，但該方法與PLFA是否完全提取以及操作過程中PLFA是否穩(wěn)定有著很大的關(guān)系。
[0004]土壤微生物的遺傳多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中的微生物在基因水平上所攜帶的遺傳物質(zhì)和遺傳信息的總和;與高等生物相比，微生物的遺傳多樣性更加突出，不同微生物種群間的遺傳物質(zhì)和遺傳信息具有非常顯著的差異。土壤微生物遺傳多樣性的分析方法主要包括兩類:第一類是基于雜交的分析方法，第二類是基于PCR的分析方法。雜交分析方法是基于核酸分子的堿基互補配對原理，利用特異性的探針與待測樣品的核酸分子進行雜交的過程;雜交技術(shù)是通過測定DNA重組率或DNA雜交動力相似度來研究土壤微生物的遺傳多樣性，用于研究微生物遺傳多樣性的雜交探針主要包括rRNA基因探針、抗性基因探針和編碼代謝酶基因探針等，其中應(yīng)用比較普遍的雜交技術(shù)包括焚光原位雜交(Fluorescence inSitu Hybridizat1n,FISH)技術(shù)，肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)雜交技術(shù)以及限制性片段長度多態(tài)性(restrict1n fragment length polymorphism,RFLP)技術(shù)等，各有優(yōu)點，但均是低通量的分析方法。
[0005]運用PCR技術(shù)擴增細菌基因組中的16S rDNA或是真菌基因組中的18S rDNA、ITS區(qū)域可以對微生物進行分類鑒定，該技術(shù)已經(jīng)普遍應(yīng)用到探討微生物的多樣性、鑒定微生物的種類以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等領(lǐng)域?；赑CR的分析方法大致分為三階段:第一，樣品的核酸提取和純化;第二，目的基因的PCR擴增;第三，擴增片段的變性處理與分析檢測，包括聚丙烯酰胺變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP)、核糖體基因間隔區(qū)分析(RISA)和自動核糖體間隔區(qū)基因分析(ARISA)，或者第三，擴增片段的測序與分析，例如16S rDNA高通量測序技術(shù)等。其中，實時熒光定量PCR具有很多優(yōu)點，如高精度、高靈敏度、高特異性、具有實時性等，但同時也存在一些不足之處，例如成本比較高，操作時還要考慮同源和異源DNA背景、寡核苷酸雜交特異性、熒光染料或特異性探針的濃度以及PCR產(chǎn)物的大小等因素，這些因素都會引起結(jié)果的偏差。DGGE是一種利用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳的方法將具有相同長度但不同序列組成的核酸片段分離開的技術(shù)，雖然已經(jīng)普遍應(yīng)用到土壤微生物群落多樣性分析的研究領(lǐng)域中，但是該技術(shù)也存在一些不足之處，例如可重復(fù)性差，耗時耗力，而且只能檢測土壤中巨量復(fù)雜微生物中的很小一部分等。16S rDNA高通量測序技術(shù)，也稱為16S rDNA深度測序技術(shù)，其原理是因為16SrDNA是原核微生物分類學(xué)研究中最常用的“分子鐘”，其序列包含9個高可變區(qū)(hypervariable reg1n)和8個保守區(qū)(constant reg1n)，可變區(qū)序列因原核微生物物種不同而異，且變異程度與原核微生物的系統(tǒng)進化密切相關(guān)即提取樣品中微生物的總DNA，然后用16S rRNA基因(S卩16S rDNA)的通用引物進行PCR擴增，獲得絕大部分微生物16S rDNA高可變區(qū)的擴增產(chǎn)物，構(gòu)建擴增產(chǎn)物的文庫，進行大規(guī)模、高通量測序，然后比較分析測序數(shù)據(jù)，對土壤微生物群落的多樣性進行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明需要解決的問題是克服現(xiàn)有技術(shù)檢測通量低、規(guī)模小、對不可培養(yǎng)微生物的覆蓋度低等不足，提供一種基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法，為不同基因型大豆包括轉(zhuǎn)基因大豆及其受體品種對根際土壤原核微生物群落影響的準(zhǔn)確評估提供了一種新方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明所述基于16SrDNA深度測序檢測不同大豆根際土壤原核微生物的方法，由以下步驟構(gòu)成:
[0009](I)大田試驗地設(shè)計，每一種基因型大豆種植于三個或三個以上小區(qū)，每個小區(qū)面積不小于12m2(4mX3m)，每個小區(qū)有兩個取樣點，每個取樣點取兩棵或兩棵以上植株；
[0010](2)先除去地面雜草和枯枝落葉，鏟除大田土壤表面l-2cm的表土，然后將在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的大豆植株連根從土中取出，用抖落法取根系抖落土作為系統(tǒng)對照，混合均勻并去除根毛，于零下20°C_零下70°C保存，再用捋取法取下緊粘于大豆根的根際土壤，混合均勻并去除根毛，并于零下70°C保存；
[0011](3)從上述各土壤樣品中，用可去除土壤中殘留的腐殖質(zhì)及幾乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolat1n Kit(MoB1 Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)提取高質(zhì)量微生物宏基因組DNA;
[0012](4)用雙標(biāo)簽融合引物對，其一含P5 Illumina接頭序列、8核苷酸的標(biāo)簽以及特異性引物515F(5 ‘ -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3，)，另一引物含P7 Il Iumina接頭序列、8核苷酸的標(biāo)簽以及806R(5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，做PCR擴增所述宏基因組DNA中 16SrDNA的V4高變區(qū)片段以構(gòu)建文庫；
[0013](5)對合格的文庫用Illumina Miseq平臺進行雙末端250個核苷酸(英語縮寫為PE250)邊合成邊測序的深度測序，并對邊合成邊測序的讀取序列(英語為READS)進行質(zhì)量控制；
[0014](6)把純凈的成對READS拼接成TAG，然后聚類成“可操作分類學(xué)單元”(英語縮寫為OTU)，再做物種組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對豐度差異的顯著性分析；
[0015](7)以根系抖落土壤微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)及多樣性作為系統(tǒng)對照，克服土壤異質(zhì)性的影響，準(zhǔn)確測定根際土壤原核微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性、相對豐度，比較不同大豆之間的異同。
[0016]上述系統(tǒng)對照為大田種植方式下的大豆根系抖落土壤，每種基因型大豆的系統(tǒng)對照土壤樣品至少3個生物學(xué)重復(fù)，每種基因型大豆的根際土壤樣品至少3個生物學(xué)重復(fù)。所述的高質(zhì)量宏基因組DNA用PowerSoil DNA Isolat1n Kit提取。其中的土壤樣品的均質(zhì)化在康寧LSE渦旋混合器上以最大轉(zhuǎn)速2850rpm運轉(zhuǎn)10分鐘完成。
[0017]深度測序是在Illumina Miseq平臺上，以PE250模式做16S rDNA的V4高變區(qū)片段高通量測序，每個系統(tǒng)對照土壤樣品DNA至少產(chǎn)出3.8萬條有效TAG以用于聚類成0TU;每個根際土壤樣品DNA至少產(chǎn)出13萬條有效TAG以用于聚類成0TU。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:16SrDNA深度測序方法具有很多優(yōu)點:首先是大規(guī)模、高通量，可以檢測到土壤中的絕大部分不可培養(yǎng)的原核微生物種類，其次相比于宏基組高通量測序方法，費用較低(700?800元/樣品DNA)，因而可以更加全面(不同作物品種植前、苗期、花期、成熟期等多個時期；同一時期各品種多點樣品)、直接、原位地研究不同作物對于土壤原核微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的影響。準(zhǔn)確檢測不同基因型植物包括轉(zhuǎn)基因作物的根際微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對豐度差異，是判斷和評價不同基因型植物對土壤微環(huán)境影響的重要基礎(chǔ)，也